三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络.docx

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三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络

项目名称：

三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络

首席科学家：

戴建武中国科学院遗传与发育生物学研究所

起止年限：

2011.1至2015.8

依托部门：

中国科学院

二、预期目标

本项目的总体目标：

通过本项目的实施，建立干细胞三维培养和完善干细胞纳米示踪技术，解析干细胞自我更新与分化过程中遗传与表观遗传的调控网络，为干细胞的应用奠定基础。

取得一批具有重大影响的科研成果，提高我国在干细胞研究领域的自主创新能力。

五年预期目标:

1．综合考虑多种因素，最大限度模拟体内环境，制备出适合干细胞生长分化的三维支架材料，建立三维培养多能干细胞和成体干细胞的自我更新和定向分化的研究体系。

2.结合基因组、蛋白质组和磷酸蛋白质组分析结果探讨三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞自我更新和定向分化中起关键调控作用的信号通路和信号网络、转录调控以及表观遗传调控网络。

3．通过模式动物体内干细胞维持与定向分化研究，发现并鉴定与神经干细胞的维持、分化相关的一些新基因，阐明其作用机制。

明确体外三维培养的神经干细胞在体内的自我更新能力与分化潜能，并对其导入体内后的有效性、安全性进行评估。

分析三维培养干细胞与体内干细胞维持与分化机制的异同，获得干细胞调控的真实信息。

4.建立干细胞纳米示踪与成像新技术，包括制备出高生物相容性、高量子产率的量子点，建立量子点标记活细胞及亚细胞组分的方法，实现对三维培养干细胞以及活体干细胞的特异性标记，建立三维培养干细胞和活体干细胞的三维、非损伤性的纳米示踪与成像技术。

5．培养研究生30名。

博士后10名。

6．在本领域发表论文30篇，其中影响因子5以上的15篇。

三、研究方案

1）学术思路：

干细胞的自我更新和定向分化是干细胞研究中的基本问题。

在体内，干细胞的自我更新和分化是处于三维环境中，体外三维培养体系下细胞的行为学特性近似于体内细胞的特性。

本项目将建立模拟体内环境的干细胞三维培养体系，并利用干细胞纳米标记与成像技术，研究三维培养干细胞自我更新和定向分化的调控网络。

在体内研究中，以线虫和小鼠为模式动物，系统研究体内干细胞的维持、分化调控机制。

2）技术途径：

根据研究内容，本项目技术途径如图所示：

具体内容如下：

1）适合不同类型干细胞培养的三维胶原支架的构建

分离纯化胶原蛋白，制备三维胶原支架材料，检测其生物相容性，运用不同生产工艺使其具有适宜的硬度和孔隙结构，建立适合不同类型干细胞培养的三维支架材料。

2）三维胶原支架材料的修饰、优化

在胶原支架材料的基础上，将微环境中调控干细胞自我更新和定向分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素通过不同的方法整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和定向分化的环境。

3）干细胞三维培养体系的建立

干细胞选择多潜能干细胞（ES细胞和iPS细胞）和成体干细胞（神经干细胞、心肌干细胞、骨骼肌干细胞）。

（1）用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。

在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架（如actin或tubulin的荧光融合蛋白）及其他因子的动态变化。

（2）将不同干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，与二维培养体系相比较，利用芯片技术对二者基因表达情况进行比较，分析在三维培养条件下干细胞的基因表达情况，利用westernblot等技术对关键因子的蛋白表达进行定量分析。

综合利用细胞生物学和分子生物学的方法对两种培养体系下细胞的干细胞特性进行比较。

4）干细胞自我更新调控机制研究

（1）将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行自我更新和定向分化研究。

分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞定向分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。

用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。

（2）三维培养干细胞的发育潜能研究，在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能，体外研究中重点探索三维胚胎干细胞向神经、心肌等细胞分化的能力及其调控机制，体内利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养的胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性。

（3）以生物化学方法检测三维培养环境中干细胞的自我更新和分化受外界信号调控的各种信号转导通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，检测其下游靶基因的表达水平，以分析细胞中各种信号通路的整合情况，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。

其中自我更新研究将以ES细胞和iPS细胞为主，探讨其以Oct4和Nanog为中心的干细胞自我更新的调控网络。

5）干细胞定向分化调控机制研究

（1）选择成体干细胞包括神经、心肌和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。

将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行定向分化研究。

通过细胞形态观察及免疫荧光染色检测干细胞定向诱导分化后产生的细胞类型（针对神经干细胞分化产生的细胞类型将分别用神经元、星形胶质细胞及寡树突细胞标志蛋白的特异抗体（神经元TuJ1及MAP2，星形胶质细胞GFAP，寡树突细胞OSP）作免疫荧光染色,针对人胚胎干细胞分化产生的心肌细胞类型将分别用α-肌浆球蛋白重链（α-MHC）、肌钙蛋白C、心房利钠肽（ANP）等标志蛋白的特异抗体作免疫荧光染色,骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3）。

例如肌原代成肌细胞或肌源性细胞系C2C12细胞在增殖阶段的培养条件为含10%胎牛血清的DMEM培养基，诱导分化的培养条件为含2%马血清的DMEM培养基，一般5～6天细胞可以分化成肌管。

针对成肌干细胞分化产生的骨骼肌细胞将分别用骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3作免疫荧光染色。

分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。

检测并比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞在分化过程中亚细胞结构水平的变化，用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。

通过与课题组四合作，用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。

在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架（如actin或tubulin的荧光融合蛋白）及其他因子的动态变化。

（2）运用生化方法检测并比较二维和三维培养的干细胞分化过程中受外界信号因子诱导产生的细胞内信号通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，并检测其下游靶基因的表达水平，分析它们各自信号转导途径整合的特性，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。

其中神经细胞的研究将以Erk及mTOR信号通路为主，肌细胞的研究将以PI3K/AKT/GSK3β信号通路为主。

此外，我们已发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通过STAT3-p63-Jagged-Notch级联调控细胞维持细胞增殖和分化之间的平衡。

功能低下或高度活化的mTOR信号通过影响Notch信号抑制细胞分化。

因此计划探讨三维培养条件下干细胞定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞定向分化中mTOR信号传导通路是否起关键调控作用。

研究方案如下：

分离选择小鼠条件性mTOR、PTEN或Tsc1基因敲除（mTOR活化）的成体干细胞包括神经和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，然后将TAT-NLS-Cre融合蛋白质加入细胞培养液，融合蛋白质将会被细胞摄取、入核，敲除mTOR基因或Tsc1基因，从而下调或上调mTOR通路的活性，然后检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。

还可让这些小鼠与组织特异性CRE表达小鼠交配，在小鼠体内敲除mTOR、PTEN或Tsc1，以明确mTOR在干细胞的定向分化中的作用。

小鼠条件性敲除胚胎干细胞（loxp-mTOR-loxp）已从欧洲条件性基因敲除小鼠项目（EuropeanConditionalMouseMutagenesisprogram）得到，将培育loxp-mTOR-loxp转基因小鼠，为条件性敲除mTOR小鼠做准备。

已有条件性Pten或Tsc1基因敲除小鼠和神经、肌肉CRE表达小鼠。

（3）鉴定人胚胎干细胞向心肌前体细胞分化过程中起关键作用的转录因子网络和关键调节通路

表达KDR的细胞是心肌细胞的前提细胞。

利用我们现有的心肌分化培养体系，将人胚胎干细胞在三维条件下分化成心肌细胞，并在相应的时间点，利用流式细胞分离仪分离取得KDR表达的心肌前体细胞和非表达细胞，然后再利用microarray或深度测序技术获取这二类细胞的基因表达数据，并通过二者之间和与为分化的胚胎干细胞表达谱对比，找到在这一分化过程中上调和下调的前500个基因，并通过UCSCmm8得到这些基因的启动子序列，最后利用CREADpackage的Motifclass来发现出现在这些启动子中的具有代表性的（按出现频率划分）转录因子DNA结合位点。

通过这些转录因子DNA结合位点来找到调节这一细胞分化过程的转录因子网络。

最后，利用可诱导的基因表达系统在胚胎干细胞中验证这些转录因子在心肌分化中的功能。

6）三维培养干细胞自我更新和定向分化的表观调控网络研究

（1）系统定量地分析在二维和三维培养条件下未分化干细胞和经诱导分化细胞之间的总蛋白质组和重要的蛋白质修饰（包括磷酸化、乙酰化和泛素化）的差异，从而找出在三维培养条件下控制干细胞自我更新与定向分化的特异性的调控网络。

研究方案包括下图所示七个步骤：

①从三维和二维培养条件下未分化的干细胞和经诱导分化的细胞制备蛋白质样品。

这样一共有四个样品，分别标记为三维未分化，三维分化，二维分化，二维未分化。

②从每个样品中分出等量的蛋白样品进行胰蛋白酶（Trypsin）酶解，产生多肽混合物。

③利用商业化的iTraq试剂，分别标记以上四个不同的样品。

iTraq试剂有四个不同的标记物。

这四个标记物在MS/MS图谱上所显示的峰其质量/电荷比分别为113，114，115，116。

如果某一个多肽在四个样品中都存在，那么这个多肽就会被这四个标记物分别标记上。

将这四个标记过的样品等量混合并进行LC-MS/MS分析，根据这四个标记物在MS/MS图谱上特异峰的信号强度，我们就可以对这个多肽在四个样品中的相对含量进行定量。

④对于总蛋白质组的分析，我们从每个标记的样品中取等量的样品加以混合。

让后利用多维的液相层析和质谱联用的技术（LC-MS/MS）,同时对四个样品中的蛋白进行鉴定和定量。

⑤对于磷酸蛋白质组的分析，我们从第三步标记好的四个样品中分别拿出等量样品并合并，然后先后用固定化金属离子亲和层析法（IMAC）和二氧化钛（TiO2）亲和层析法富集不同的磷酸肽亚群（Bodenmilleretal.,2007），并将收集到的磷酸肽合并到一起。

同样，对与乙酰化和泛素化，我们将分别利用已发表的免疫沉降法和亲和层析法对被修饰的多肽进行富集。

⑥利用多维LC-MS/MS进行蛋白质修饰位点的鉴定和定量。

我们将利用最先进的带有ETD功能的LTQ-Orbitrap-Velos质谱仪来分析这些样品。

这个质谱仪是目前世界上进行大规模蛋白质组研究的最好的仪器，具有高灵敏度，高分辨率，以及高精确度的特点。

同时，附加的ETD（ElectronTransferDissociation）功能是专门用来分析蛋白质修饰的。

我们可以利用ETD方法和传统的CID（CollisionInducedDissociation）方法来进行蛋白质修饰位点的分析，以求获得更高的位点鉴定覆盖率。

⑦利用生物信息学和计算生物学的方法对产生的蛋白质组和蛋白质修饰数据进行信号通路和网络的分析，找出与干细胞自我更新或定向分化相关的调控通路或网络。

同时，我们将会找出一些与干细胞更新与定向分化特异相关的蛋白和修饰位点，进行进一步的功能研究。

（2）利用microRNA芯片进行高通量筛选。

确定microRNA在三维干细胞自我更新和定向分化过程中的调控网络，具体途径如下：

①非编码RNA序列的筛选和生物信息学分析

获得二维和三维培养状态下的干细胞，提取细胞RNA，利用microRNA芯片进行高通量筛选。

通过生物信息学分析，对非编码RNA进行功能分类、确认可能的新类别非编码RNA；分析非编码RNA的基因组定位、寻找可能的非编码RNA特异的上游调控元件。

②报告基因系统确定非编码RNA基因的转录调控元件和转录调控因子

通过生物信息学方法分析非编码RNA基因的上游调控元件，进一步分析其中可能的转录调控因子结合位点，针对不同的转录调控因子结合位点构建缺失或点突变的报告基因（Luciferase）重组质粒，确定影响非编码RNA基因表达的转录调控因子及结合序列。

③非编码RNA对干细胞自我更新、分化的影响

分别构建正义和反义非编码RNA重组质粒，转染神经干细胞或肌肉干细胞，观察超表达或Knockdown特定非编码RNA对其生物学功能的影响。

进一步采用Northern和Western方法检测细胞增殖分化相关的标志基因（proliferationordifferentiationmarker）的表达情况，分析非编码RNA的功能。

7）模式动物体内干细胞维持分化与功能研究

将从基因、蛋白质、细胞与组织以及活体动物水平研究体内干细胞自我更新与分化。

具体途径如下：

（1）基因水平的研究：

全基因组RNAi筛选和化学诱变，基因定位、克隆找到细胞分化调控因子。

（2）蛋白质水平的研究：

利用双向电泳、质谱、显微注射、酵母双杂交和免疫共沉淀等技术研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。

（3）细胞与组织水平的研究：

利用建立的各种细胞和组织培养模型和流式细胞分离、激光共聚焦成像、显微注射、RNA干扰和过表达等技术，深入研究基因/蛋白质的功能及调控网络。

（4）活体动物研究：

利用转基因疾病动物模型、干细胞移植等技术研究体内神经干细胞的自我更新与定向分化。

8）干细胞的纳米示踪与成像技术研究

将以高量子效率、高生物相容性量子点的制备为基础，通过对量子点的特异性修饰，实现对干细胞的特异性标记，利用荧光成像技术和核磁共振成像手段，对三维培养的干细胞和活体干细胞进行三维示踪成像。

具体研究途径如下：

（1）纳米粒子的制备研究：

a.高量子效率、高生物相容性量子点：

对目前实验室已有的量子点合成技术进行改进，使量子点在光稳定性、化学稳定性、低毒性、荧光量子产率、荧光半峰全宽等各个参数上满足后续应用的需要。

选取恰当的配体，对量子点表面进行功能化修饰，提高其生物相容性。

b.采用高温分解铁前驱体的方法合成磁性纳米粒子，通过优化前驱体浓度、回流时间、加热速率等反应条件，借助晶种生长法来控制粒径的大小。

选用合适的铁前驱体和过渡金属前驱体进行热解，控制磁性纳米粒子的化学组成。

通过表面配体置换对纳米粒子表面进行改性和修饰。

（2）量子点的特异性修饰：

结合其它子课题的研究需求，利用特异性的识别分子对量子点、磁性颗粒通过共价或非共价的方式进行修饰，实现对细胞及其亚结构组分的特异性标记。

（3）活体干细胞的标记：

将近红外量子点或磁性纳米粒子标记的干细胞在体外进行标记，然后导入小鼠体内，利用荧光信号或核磁信号对干细胞在小鼠体内的行为进行示踪。

（4）纳米示踪与成像：

a.通过量子点和生物分子标记对象的双色荧光共定位成像，可以在单分子水平研究近红外量子点对干细胞结构的特异性标记技术。

b.采用共聚焦扫描技术实现干细胞三维成像与示踪。

根据红外量子点的激发与发射波长的特点，选用合适波长的激光光源构建共聚焦荧光显微系统，可以有效降低本底信号强度，实现较高成像精度的三维红外荧光成像，满足对不同生长环境下干细胞的亚细胞结构对比研究。

c.近红外光具有较大的组织穿透深度，利用近红外量子点构建活体荧光成像系统，可以在小动物尺度对干细胞的维持和分化进行示踪成像。

d.直接将磁性纳米粒子标记的神经干细胞注射到包裹小鼠纹状体的脑室侧壁神经干细胞的niche区，将小鼠于不同时间点置入11.7T磁共振微成像仪中，分别采用自旋回波和梯度回波两种对铁敏感性不同的磁共振影像方法，设计优化脉冲系列，对小鼠脑部进行扫描，针对移植部位进行图像采集，研究外源性神经干细胞在体内的增殖、迁移、分化等。

以磁共振影像技术作为核心技术，对比研究三维培养与二维培养干细胞在体内维持分化与功能的差异，支撑课题1、2、3的相关研究。

3）创新点与特色：

（1）三维培养体系中细胞的行为学特性更近似于体内细胞的环境。

本项目模拟体内干细胞自我更新和定向分化的三维环境，建立干细胞的三维培养分化体系，在此基础上对干细胞自我更新和定向分化的调控网络进行研究。

这是本项目重要创新点。

（2）活体细胞纳米示踪与成像技术作为生物医学研究的基本手段在干细胞的自我更新与分化的体内外研究中发挥着日益重要的作用。

纳米标记与成像技术作为非损伤性的新型标记技术将获得传统二维细胞研究技术难以摄取的信息。

（3）系统定量地分析在二维和三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化过程中蛋白质组和磷酸蛋白质组的差异，找出更接近体内环境中干细胞自我更新与分化的调控网络。

（4）本项目既有体外三维培养干细胞自我更新和分化的研究，又有模式动物体内干细胞自我更新和分化的研究，可以验证三维培养体系与体内环境的相似性。

4）可行性分析：

（1）项目申请人主持了2006-2010年国家重大科学研究计划中“调控干细胞自我更新能力的分子网络研究”的项目，项目组对干细胞的自我更新和定向分化及其调控网络进行了较为深入的研究，取得了一些重要的研究结果，丰富和发展了以Oct4和Nanog等转录因子为核心的干细胞自我更新的调控网络。

这些工作为进一步在三维培养条件下研究干细胞自我更新的调控机制奠定了基础。

（2）项目组成员在三维培养体系建立、干细胞定向分化研究、定量蛋白质组学、细胞迁移与粘附、纳米示踪与成像技术等研究以及模式动物实验体系建立等方面已有较好的积累（详见研究基础）。

（3）参加本项目的课题组来自中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国科学院动物研究所、中国科学院生物物理所、中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所、中国医学科学院基础医学研究所、大连医科大学，课题组依托单位和重点实验室都具备先进的实验条件，为该项目的实施提供了充分必要的条件。

（4）本项目所设置的四个课题组的研究内容相互联系，研究成员之间已经建立了紧密的协作关系。

（5）项目申请人戴建武研究员是中国科学院“百人计划”入选者、国家杰出青年基金获得者、国家重大科学研究计划“调控干细胞自我更新能力的分子网络研究”（2006-2010）项目首席科学家，为本项目的运行积累了组织和协调经验。

项目课题负责人均为相关研究领域的优秀学科带头人。

学术骨干队伍由精力充沛的优秀青年科研人员组成。

5）课题设置

本项目利用细胞示踪和成像技术，研究三维培养干细胞和体内干细胞自我更新与定向分化的调控机理。

本项目设置四个课题：

课题1干细胞三维培养与自我更新调控网络的研究

课题2三维培养干细胞的定向分化调控网络研究

课题3干细胞体内维持分化与功能研究

课题4干细胞的纳米示踪与成像技术

四个课题相互独立又相互联系，其中课题4建立的纳米示踪与成像技术在课题1、课题2、课题3的研究过程中均会得到应用。

课题1和课题2的研究为体外研究，其分别研究三维培养干细胞的自我更新和定向分化调控。

自我更新和定向分化的调控机制既相互区别又相互联系。

课题3为模式动物体内干细胞自我更新与定向分化研究，其体内的研究结果可与课题1、课题2体外干细胞自我更新和定向分化的研究结果相互验证。

课题1：

干细胞三维培养与自我更新调控网络的研究

研究目标：

制备出适合干细胞生长分化的三维胶原支架材料；建立多潜能干细胞和成体干细胞的三维培养体系，阐释三维培养条件下胚胎干细胞的发育潜能与自我更新的分子机制；结合蛋白质组和磷酸蛋白质组以及microRNA分析结果探讨三维培养条件下干细胞自我更新表观调控机制，阐明在干细胞自我更新起关键调控作用的表观遗传网络。

研究内容：

1）适合不同类型干细胞培养的三维支架的构建

分离纯化胶原蛋白，制备不同类型的三维支架材料，使其具有良好的生物相容性，适宜的硬度和孔隙结构，建立适合不同类型干细胞培养的三维胶原支架材料。

2）三维胶原支架材料的修饰、优化

在胶原支架材料的基础上，将微环境中调控干细胞自我更新和分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和分化的环境。

3）干细胞三维培养体系的建立

干细胞选择多潜能干细胞ES细胞和iPS细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测并比较二维和三维培养的干细胞细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达能等。

检测并比较二维和三维培养的干细胞在生长和分化过程中的亚细胞结构水平的变化。

4）三维培养胚胎干细胞发育潜能研究

在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能。

利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性，并与二维培养体系下干细胞的发育潜能相比较。

5）三维培养干细胞的自我更新研究

建立ES细胞和iPS细胞三维培养体系基础上，研究调控细胞多能性的这些因子之间的调控网络，解析其如何相互协同共同控制多能性细胞的不分化状态。

6）三维培养干细胞自我更新的表观遗传调控网络

用基因组学及蛋白质组学方法检测并比较二维和三维培养的干细胞在在自我更新过程中的表观遗传学变化，包括蛋白质组和磷酸蛋白质组、非编码RNA表达谱等。

承担单位：

中国科学院遗传与发育生物学研究所

中国科学院动物研究所

大连医科大学

课题负责人：

戴建武

学术骨干：

汪迎春、刘蕾、丁文勇、林琳、田余祥

经费比例：

34%

课题2：

三维培养干细胞的定向分化调控网络研究

研究目标：

综合运用细胞生物学、生物化学、材料科学及系统生物学研究方法，检测三维培养中干细胞自我更新和分化状态的各项指标，以建立一套完善有效的干细胞三维培养的评价体系。

结合蛋白质组和磷酸蛋白质组分析结果探讨三维培养条件下干细胞定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞定向分化中起关键调控作用的信号通路和信号网络及表观遗传网络。

研究内容：

1）选择成体干细胞包括神经、心肌和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。

检测并比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞在分化过程中亚细胞结构水平的变化，包括用免疫染色及活细胞成像技术等观测细胞粘附特性及细胞骨架结构、细胞迁移和运动特性等。

2）运用生化方法检测并比较二维和三维培养的干细胞分化过程中受外界信号因子诱导产生的细胞内信号通路的动态变化，分析它们各自信号转导途径整合的特性。

3）