医学细胞生物学讲义汇总.docx
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医学细胞生物学讲义汇总
实验一细胞器的活体染色与观察
线粒体活体染色与观察
实验目的
1．掌握细胞器活体荧光标记技术。
2．观察和了解活细胞内线粒体的形态、结构与分布特点。
实验原理
对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。
活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于被识别。
体外活染又称超活染色，它是将活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染，染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。
随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，从静态到动态，从单维度到多维度的发展。
其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要实验技术。
这种技术可以从分子水平上动态地研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。
这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。
现在，已经有许多细胞器特异的商业化荧光染料。
Golgi-TrackerRed是一种高尔基体红色荧光探针，可以用于活细胞高尔基体特异性荧光染色。
Golgi-TrackerRed为采用MolecularProbes公司的BODIPYTR进行了荧光标记的C5-ceramide。
Golgi-TrackerRed可以用于活细胞的高尔基体荧光标记，但不适合用于固定细胞的标记。
Golgi-TrackerRed的最大激发光波长为589nm，最大发射光波长为617nm。
BODIPY-FL-神经酰胺是一种脂类物质，能特异地标记高尔基体。
BODIPY-FL-神经酰胺的最大激发光波长是464nm，最大发射光波长为532nm。
DiO-C6（3）是一种短链碳酸化氰苷染料，可以标记包括内质网在内的多种膜性细胞器。
但是，根据形态、结构特征，内质网很容易被识别。
D10-C6（3）的最大激发光波长为484nm，最大发射光波长为501nm。
罗丹明123是一种阳离子荧光染料。
活体线粒体能够产生膜电位，可以吸引罗丹明123进入线粒体。
因此，罗丹明123能够特异地标记线粒体。
罗丹明123的最大激发光波长为504nm，最大发射光波长为534nm。
Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。
这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，所以也常用于普通的细胞核染色或常规的DNA染色。
Hoechst33258的最大激发光波长为346nm，最大发射光波长为460nm;Hoechst33258和双链DNA结合后，最大激发光波长为352nm，最大发射光波长为461nm。
詹纳斯绿B（JanusgreenB）可专一性地对线粒体进行活性染色，这是由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。
中性红（neutralred）对液泡和溶酶体的染色具有专一性，可将活细胞中的液泡和溶酶体染成红色。
中性红也可作为荧光染料来标记液泡和溶酶体，其最大激发光波长为541nm，最大发射光波长为640nm。
实验用品
1．材料
小白鼠肝细胞
2．试剂
（1）Ringer液NaCl:
0.85%;KCI:
0.03%;CaCI2:
0.033%。
（2）0.02%詹纳斯绿B水溶液。
3．器材
剪刀、镊子、解剖刀、眼科剪、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸。
实验程序
1．线粒体的活体染色与光学显微镜观察（詹纳斯绿B染色法）
（1）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察’
1）取干净的载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两滴0.02%詹纳斯绿B染液。
2）实验者用牙签在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放人载玻片上的染液中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于光学显微镜下观察。
3）在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。
可见扁平状上皮细胞细胞核周围的胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。
（2）小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察
1）用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放人表面皿内。
用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
2）在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加0.02%詹纳斯绿B染液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上半部分露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分氧化，易被染色。
当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20-30min）。
3）吸去染液，滴加Ringer液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。
然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
4）在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1-2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
（3）洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色与观察
1）用吸管吸取0.020-/0詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上。
然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10-15min。
2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
3）在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处，仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
‘
实验二细胞的原代培养
【实验目的】
1．熟悉并掌握原代培养中取材、消化及无菌操作等基本实验技术。
2．了解细胞原代培养的原理及其方法。
【实验原理】
原代培养（primaryculture）是从供体取得组织或细胞后在体外进行的首次培养，是建立各种细胞系的第一步。
原代培养的细胞由于刚刚离体，生物学特性与在体细胞接近，故在各种细胞生物学实验中有广泛应用，较适合进行药物测试、细胞分化等实验。
原代培养的方法很多，最基本的方法有两种，即组织块法和消化法。
组织块法是最常用的原代培养方法，该方法利用刚刚离体的、有旺盛生长活力的组织作为实验材料，将其剪成小块接种在培养瓶中，大约24h后，细胞即可从贴壁的组织块四周游出并生长。
利用组织块法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时，选择该法尤为合适。
消化法是一种结合化学与生化手段进行的原代培养方法。
该方法的主要特点是利用消化试剂将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等）加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液，因单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物，经体外适宜条件培养后，可以得到大量活细胞，在短时间内细胞即可生长成片。
酶是常用的消化试剂，在原代培养中，对于一些间质少、较软的组织，如上皮、肝、肾、胚胎等，选择胰蛋白酶来加以消化可收到较好的效果。
胶原酶因其对胶原有较强的消化作用，因此适合用在对纤维性组织、一些较硬的癌组织等的消化中。
本实验中将以胰蛋白酶为例，介绍原代培养的酶消化法。
【实验器材和试剂】
器材、试剂
每组学生所需数量
新生1～3d大鼠
2只
D-Hank液
10ml
器材、试剂
每组学生所需数量
DMEM培养基（含10%小牛血清）
5ml
0.25%胰蛋白酶消化液
3ml
25ml培养瓶
1个
60mm培养皿
3个
吸管
10只
弯头吸管
2只
胶帽
10个
眼科剪
4把
眼科镊
4只
10ml离心管
1只
磁力搅拌器
1个
磁力搅棒
1根
不锈钢筛网（100目）
1个
20ml三角烧瓶
1个
酒精棉球
20个
酒精灯
1个
离心机
1台
倒置显微镜
1台
超净工作台
1台
CO2培养箱
多组合用
【分组形式】
2～3人一组。
【操作步骤】
（一）组织块法（以新生太鼠肝细胞的原代培养为例）
1．将新生大鼠全身用75%酒精棉球反复擦拭消毒。
2．将消毒后的大鼠移入超净工作台中，再用75%酒精消毒一次。
3．在培养皿中将大鼠处死（断头法），用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。
4．用D-Hank液反复冲洗肝组织，以去除血细胞。
5．用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除，以避免杂细胞的污染。
6．将肝组织移入一新的培养皿中，用吸管吸取0.5ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成lrrirr13左右的小块。
7．用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。
8．并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0.5cm左右，25ml培养瓶放置15～20块。
9．吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。
10.轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。
11.24h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。
（二）消化法（以胰蛋白酶消化为例）
1．取新生大鼠的肝组织，用D-Hank液漂洗3次，用眼科剪、镊去除附着在肝组织上的结缔组织。
2．将肝组织剪成1~2mm3左右的小块。
3．将肝组织块置入三角烧瓶内，放入磁力搅棒，再注入30～50倍组织量的预热到37℃的胰蛋白酶液。
4．将三角瓶放在磁力搅拌器上进行搅拌，速度要慢一些，消化时间控制在l0～
20min。
也可将三角瓶放入水浴或温箱中，每隔5min摇动一次。
如需长时间消化，可每隔5min取出2/3上清液移入另一离心管冰浴或离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。
如果在4℃条件下进行冷消化，时间可长达12～24h。
从冰箱取出离心后，可再添加胰蛋白酶，放入37℃温箱中继续温热消化20～30min，效果可能更好。
5．在消化过程中，可随时吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，当发现组织已分散成小的细胞团或单个细胞，可终止消化。
6．消化完毕后将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，以除掉未消化充分的大块组织。
7—800～1000rpm离心3～5min去除含胰蛋白酶的上清。
8．用D-Hank液漂洗1～2次，每次800～1000rpm离心3～5min，去除上清。
9．加入含10%血清的DMEM培养基，吹打沉淀制悬。
10.进行细胞计数，一般按5×105～1×106的密度接种到培养瓶，于37℃条件下培养。
【观察与记录】
1．组织块法培养细胞的观察
培养24h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48h后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。
靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。
2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察
在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。
24h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。
48h以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。
96h以后，新生的细胞将逐渐连接成片，胞体轮廓增强，核仁明显可见，透明度减弱。
【注意事项】
1．D-Hank液对肝组织的冲洗要充分，尽量去除血细胞，避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。
2．严格无菌操作，避免细菌、霉菌等的污染。
3．组织块法中，组织块的体积应控制在lmm3左右，以保证其中心部位的细胞可获得充足的养分。
组织块体积过大，中心部位细胞会因营养不足而发生死亡：
溶解，进而对周围细胞的生长产生影响。
培养瓶中组织块摆放的密度不能过大，否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。
此外，为了避免组织块漂浮、不贴壁，第一次加入培养基的量要少，而在移动和观察细胞时，动作也要轻，因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。
4．消化法中，因Ca2+和Mg2+及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用，消化过程中使用的所有液体，应均不含有这些离子及血清，消化后可直接加含血清培养基使其灭活；
在选择消化时间时，应特别注意胰蛋白酶的浓度及pH值对消化效果的影响；此外，对消化时环境的温度、组织块的大小和硬度也要加以考虑。
胰蛋白酶浓度常用0.25%，pH值控制在8～9较好，消化时温度最好在37℃。
胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。
【试剂配制】
1．D-Hank平衡液的配制及消毒
（1）取市售D-Hank干粉一袋，剪开包装后将干粉溶于适量双蒸水中；
（2）在1000ml容量瓶中调节pH值为7.2～7.4，并将D-Hank液定容至1000ml;
（3）将1000mlD-Hank溶液分装到数个生理盐水瓶中，每个瓶塞上插入两只注射器针头，8磅高压蒸汽灭菌20～30分钟；
（4）从高压锅内取出装有D-Hank溶液的生理盐水瓶后，立即拔出针头并在针孔处贴上胶布，以防溶液被细菌污染；
（5）4℃保存，使用时可加入青霉素和链霉素双抗溶液，使二者的终浓度都达到
100U/ml。
2．DMEM’培养基的配制及消毒
（1）取市售DMEM培养基，小心剪开包装，将干粉溶于适量双蒸水中，并用适量双蒸水冲洗包装袋内侧面，将溶液定容至1000ml;
（2）根据包装袋上的说明添加NaHCO3；
（3）调节溶液pH值7.4左右；
（4）加入青霉素和链霉素，使两者的最终浓度都达到100U/ml;
（5）采用0.22μm孔径的滤膜正压过滤除菌并分装培养基：
1）取出已消毒的微孔滤膜不锈钢滤器；
2）在不锈钢滤器的上层与下层之间，放置孔径为0.22μm的滤膜，滤膜的光面朝上；
3）向不锈钢滤器中轻轻加入培养基；
4）向不锈钢滤器加压；
5）将已经过滤的培养基分装于l00ml小瓶中。
（6）-20℃保存，使用时再加入10%～20%的血清，并再次用上述方法过滤除菌。
3．胰蛋白酶消化液的配制及消毒
（1）将D-Hank平衡液高压消毒，用NaHCO3液调节pH值至7.2左右；
（2）称取所需量的胰蛋白酶，加入少量D-Hank平衡液，搅拌均匀后再补足D-
Hank平衡液，搅拌混匀；
（3）将配制的胰蛋白酶液加以粗滤后，再用注射滤器进行除菌及消毒：
1）打开直径为25mm的注射滤器；
2）将孔径为0.22μm的微孔滤膜光面朝上放置于滤器中；
3）将滤器安装在注射器上；
4）向注射器中加入需过滤的胰蛋白酶液；
5）推动注射器，使胰蛋白酶液经过滤膜过滤；
（4）将已过滤的胰蛋白酶液分装成小瓶；
（5）4℃或-20℃保存备用。
实验三细胞中微丝的染色及形态观察
【实验目的】
1．掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架微丝的方法。
【实验原理】，
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架（cytoskeleton）。
根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同，分为微管（microtubule）,MT）、微丝（microfilament，MF）和中间纤维（intermediatefilament，IF）。
目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。
微丝是肌动蛋白构成的纤维（F-actin）。
单根微丝直径约7nm，在光学显微镜下看不到。
在不同种类的细胞中，它们与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构,如肌肉细丝、肠上皮微绒毛轴心、应力纤维（stressfiber）等。
本实验用考马斯亮蓝R250（Coomassiebrilliantblue，R250）显示微丝组成的应力纤维。
应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。
考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染微丝。
但在该实验条件下，微管结构不稳定，有些类型的纤维太细，光镜下无法分辨。
因此，我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维。
【实验器材和试剂】
器材、试剂
每组学生所需数量
1．细胞培养设备
公用
2．恒温箱
公用
3．显微镜
4台
4．小镊子
4把
5．培养皿
4个
6．载玻片
8片
7.6mmol/LPBS（pH值6.5）
100ml
8.M缓冲液（pH值7.2）
100ml
9.1%Tritonx-100
30ml
10.0.2%考马斯亮蓝R250染液
30ml
11.3%戊二醛
30ml
12.材料：
体外培养的贴壁生长细胞、洋葱鳞茎
【分组形式】
4人一组。
【操作步骤】
（一）考马斯亮蓝R250染动物细胞的微丝
1．取材：
细胞培养在盖玻片条（为区别细胞的正反面，剪掉一角）上，生长密度达++～+++时取出，用6mmoI/LPBS洗3次。
2．抽提：
用I%TritonX-I00处理25～30min，室温或37℃均可。
3．冲洗：
用M缓冲液轻轻洗细胞3次。
M缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
4．固定：
略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5～15min。
5．冲洗：
用6mmol/LPBS轻轻洗细胞3次，滤纸吸干。
6．染色：
用0.2%考马斯亮蓝R250染片30min。
7．冲洗：
小心用蒸馏水漂洗，滤纸吸干标本边缘水分，空气干燥，直接观察或用树脂封片。
（二）考马斯亮蓝R250染植物细胞的微丝
1．取材：
取洋葱鳞茎内表皮，大小约lcm2，放入盛有6mmol/LPBS的小烧杯中，使其下沉，处理5～l0min。
2．抽提：
吸去PBS，用1%TritonX-100处理洋葱表皮30min（置37℃恒温箱中）。
3．冲洗：
吸去1%TritonX-I00，用M缓冲液充分洗3次，每次5min。
4．固定：
3%戊二醛固定20min。
5．冲洗：
吸去固定液，用6mmol/LPBS洗3次，每次5min。
滤纸吸去残液。
6．染色：
0.2%考马斯亮蓝R250染色20min。
7．制片：
蒸馏水洗数次。
将标本平铺在载玻片上，加盖玻片。
【观察与记录】
1．光镜下动物细胞形态已不清楚，只见细胞轮廓。
应力纤维呈深蓝色（图2-6，图2-7）。
2．见洋葱表皮细胞轮廓，微丝束呈深蓝色。
转换高倍镜观察，转动微调，可见细胞骨架的立体结构（图2-8）。
【注意事项】
1．各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。
2.l%TritonX-IOO抽提杂蛋白要做预实验，抽提时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大。
3．应力纤维是一种动态结构，细胞充分贴壁铺展时纤维挺直、丰富；反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显稀少。
【试剂配制】
1.6mmol/LPBS、（pH值6.5）:
A液：
NaH2PO4·.2H2O936mg/l000ml
B液：
Na2HPO4·12H2O2148mg/l000ml
工作液：
A液68.5ml+B液31.5ml（用NaHCO3调pH值至6.5）
2．M缓冲液（pH值7.2）：
咪唑3.40g
KCI3.7g
MgCI2·6H2O101.65mg
EGTA（乙二醇双醚四乙酸）380.35mg
EDTA（乙二胺四乙酸）29.22mg
巯基乙醇（mercaptoethanol）0.07ml
甘油292ml
加蒸馏水至1000ml（用Imol/LHCI调pH值至7.2）。
3.1%TritonX-100:
TritonX-100Iml
M-缓冲液99ml
4.0.2%考马斯亮蓝R250染液：
考马斯亮蓝R250'0.2g
甲醇46．5ml
冰醋酸7ml
蒸馏水46.5ml
5.3%戊二醛
25%戊二醛12ml
6mmol/LPBS88ml
实验四动物细胞融合
实验目的
1．了解动物细胞融合的常用方法。
2．学习化学融合和电融合的基本操作过程。
3．观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
实验原理
细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
1．病毒诱导融合
仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。
这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2．化学诱导融合
很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEC是被广泛使用的化学融合剂。
3．电激诱导融合
包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
实验用品
1．材料
鸡血红细胞。
2．试剂
50%PEC、Hank's溶液（pH7.4）、Alsever's细胞保存液（参见“实验十七”）、0.6mol/L
甘露醇溶液、0.85%氯化钠溶液、詹纳斯绿B染液。
3．器材
倒置显微镜、离心机、恒温水浴锅、电融合仪、血细胞计数器、量筒、注射器、烧杯、载玻片、盖玻片、200μL及lmL微量移液器、枪头、离心管、废液缸等。
实验程序
1．鸡血红细胞的制备和保存用无菌注射器先吸入Alsvers溶液1mL，再从鸡翼下静脉取血0.5～1mL，取出后放入刻度离心管中，再加入2-3mLAlsvers溶液，使总量为4-5mL，混匀并封口，置于4℃冰箱内（可供一周内使用）。
2．PEG诱导融合
（1）取保存的鸡血，离心去除Alsvers溶液，以0.85%氯化钠溶液制成5%-10%的悬液。
（2）称取1gPEG（相对分子质量4000）放入试管内，在沸水浴中融化后，加入1mL预热的Hank's溶液，混匀，制成50%的PEC溶液。
放入37℃水浴中待用。
（3）取上述鸡红细胞悬液lmL放人离心管中，再加入5mLHank's溶液混匀，然后以
1000r/min离心5min，小心弃去上清液，用指弹法将细胞团块弹散。
（4）取上述50
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