微生物检验操作规程.docx
《微生物检验操作规程.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《微生物检验操作规程.docx(29页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
微生物检验操作规程
微生物检验操作规程
1.目的
建立微生物检验标准操作规程,保证检验操作规范化。
2.范围
适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。
3.职责
微生物检验员负责微生物检验的全过程;
QC主管负责监督检查本规程的有效实施。
4.操作规程
微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤
一般的玻璃器皿(例如培养皿、试管、三角瓶等),可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢,然后用自来水、蒸馏水充分冲洗,直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜,即器壁既不挂水珠也无条纹,即洗涤达到标准。
玻璃器皿内有污迹不能洗净时,可浸泡于洗液中,待器皿中有机物氧化分解后,取出用自来水、蒸馏水冲洗干净,备用。
新购的玻璃器皿先用2%盐酸浸泡,再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。
器皿的包扎
试管:
塞上胶塞,然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。
做发酵试验时,将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。
三角瓶、抽滤瓶:
将三角瓶(抽滤瓶)口塞上胶塞,然后用牛皮纸把塞头部包起来。
吸管:
将耐高温的移液枪头装盒,用用牛皮纸或报纸包裹。
平皿:
10个为一组,用牛皮纸包裹。
消毒和灭菌:
化学灭菌:
此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。
如人手等。
(1)用75%的乙醇溶液或%新洁尔灭擦拭或浸泡。
(2)一般用1~2%的甲醛液浸泡软管和用具。
(3)一般成品漂白粉的有效成分是25~32%。
使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内,(对金属有腐蚀作用)放置10~15min后冲洗即可。
(4)氯灭菌剂的能力以有效氯表示,将氯水配制成50~100PPm的有效氯溶液,可用于浸泡,冲洗和表面杀菌。
但氯对金属有腐蚀作用。
物理灭菌:
干热灭菌:
适用于干燥的玻璃器皿(吸管、平皿等)、金属器具(镊子等)、固体试液、液状石蜡等。
灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。
(1)器具用牛皮纸或灭菌袋包(装)扎,放入金属容器内。
(2)器具在干燥箱加热前放入,每个器具之间留有足够的空隙,使热
空气能畅通。
(3)关闭箱门接通电源,打开通气孔,使箱内湿空气能逸出,至箱内温度达到100℃时关闭。
(4)加热至160℃,保持2小时。
(5)切断电源,冷却至60℃时,打开箱门,取出灭菌器具,并打开箱顶通气口。
注:
灭菌时必须注意温度不能超过180℃,以免使棉花、报纸烘焦;灭菌时不得打开箱门;干燥箱未冷却时,不要取出里面器具,防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸
璃器具爆炸。
湿热灭菌:
适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。
详见《压力蒸汽灭菌器操作规程》。
(1)装入培养基的瓶用胶塞盖上,再用牛皮纸包扎。
(2)瓶中的培养液不要超过1L,否则灭菌不彻底。
(3)容器的上部应留有足够的空间(一般不超过装量的2/3),以便产生气泡。
(4)器具用牛皮纸包裹。
(5)器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。
(6)各类器具装入灭菌器时,相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。
无菌操作的准备工作及注意事项
微生物室应定期按《微生物实验室管理规程》清洁。
微生物室使用前,应先打开紫外灯灭菌20~30min。
微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针,每次使用前后应灭菌消毒。
微生物室应备有75%酒精棉球;新洁尔灭消毒液内浸纱布数块,备用。
进入微生物,换专用鞋,穿好洁净服,离室时脱去洁净服和专用鞋,洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用,不准穿到其它地方去,并定期洗换和消毒灭菌。
样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容,并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。
无菌操作前,用75%的酒精棉球擦手。
操作要正确迅速,所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。
检验完毕,立即清理工作台,弃去不需要物品,打开紫外灯灭菌20~30min。
微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存
配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。
水:
电导率在25℃时不超过25μs/cm,除非另有规定要求。
称重和溶解:
保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定,已制备好的培养基要保存于冰箱中。
在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min,使其与室温一致再使用,因为气体的溶解度可因温度上升而降低,特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡,这一点必须注意。
pH的测定和调整:
用pH计测pH,必要时在灭菌前进行调整,除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25℃时,pH应在标准pH±范围内。
一般使用浓度约为40g/L(约1mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为g/L(约1mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。
分装:
将配好的培养基分装到适当的容器中,容器的体积应比培养基体积最少大20%。
培养基的使用:
经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间,融化后避免过度加热。
融化后应短暂置于室温中(如2min)以避免玻璃瓶破碎。
融化后的培养基放入47℃~50℃的恒温水浴锅中冷却保温,且应尽快使用,放置时间一般不应超过4h。
未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。
敏感的培养基尤应注意,融化后保温时间应尽量缩短,如有特定要求可参考指定的标准。
平板的制备和储存
倾注融化的培养基到平皿中,使之在平皿中形成厚度至少为3mm(直径90mm的平皿,通常要加入18mL~20mL琼脂培养基)。
将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。
如果平板需储存,或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃,则需要倾注更多的培养基。
凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中,以防止培养基成分的改变。
在平板底部或侧边做好标记,标记的内容包括名称、制备日期和(或)有效期。
也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。
将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。
为了避免冷凝水的产生,平板应冷却后再装入袋中。
储存前不要对培养基表面进行干燥处理。
对于采用表面接种形式培养的固体培养基,应先对琼脂表面进行干燥:
揭开平皿盖,将平板倒扣于烘箱或培养箱中(温度设为25℃~50℃);或放在有对流的无菌净化台中,直到培养基表面的水滴消失为止。
注意不要过度干燥。
商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。
检验方法
做样前,将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上,操作台、微生物室紫外线灭菌30min,然后关紫外线灭菌灯,开启净风循环30min后开始做样。
详见附录各检测方法
附录1菌落总数测定
附录2霉菌和酵母计数
附录3大肠菌群计数
附录4大肠埃希氏菌计数
附录5沙门氏菌检验
附录6金黄色葡萄球菌检验
附录1
菌落总数的测定方法
1.样品的稀释
固体和半固体样品:
称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1min~2min制成1:
10的样品匀液。
液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
用1mL微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸头尖端不要触及稀释液面),换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
按操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸头。
根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。
同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
2.培养
待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1℃培养48h±2h。
如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL),凝固后翻转平板,按条件进行培养。
菌落计数
可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示。
选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
3结果与报告
菌落总数的计算方法
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按下式计算:
式中:
N——样品中菌落数;
ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d——稀释因子(第一稀释度)。
若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
菌落总数的报告
菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
附录2
霉菌和酵母菌计数
1.样品的稀释
固体和半固体样品:
称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中,充分振摇,即1:
10稀释液。
液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
取1mL1:
10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:
100稀释液。
按操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管。
根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。
同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。
及时将15mL~20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
2.培养
待琼脂凝固后,将平板倒置,28℃±1℃培养5d,观察并记录。
3.菌落计数
肉眼观察,必要时可用放大镜,记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。
以菌落形成单位(CFU)表示。
选取菌落数在10CFU~150CFU的平板,根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。
霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。
菌落数应采用两个平板的平均数。
4.结果与报告
计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
若所有平板上菌落数均大于150CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多
不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
若所有平板上菌落数均小于10CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度平板均无菌生长,则以小于1乘最低稀释倍数计算;如为原液,则以小于1计数。
报告
菌落数在100以内时,按“四舍五入”原则修约,采用两位有效数字报告。
菌落数大于或等于100时,前3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用
0代替位数来表示结果;也可用10的指数形式来表示,此时也按“四舍五入”原则修约,采用两位有效
数字。
称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告,报告或分别报告霉菌和/或
酵母数。
附件A
菌落总数、霉菌及酵母数检验流程图
附录3
大肠菌群计数
第一法MPN计数
1.样品的稀释
固体和半固体样品:
称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋制成1:
10的样品匀液。
液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
样品匀液的pH值应在~之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸头尖端不要触及稀释液面),换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
2.初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
3.复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。
产气者,计为大肠菌群阳性管。
4.大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附件B,表1),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。
第二法平板计数法
1.样品的稀释
按第一法中的1进行。
2.平板计数
选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。
同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
及时将15mL~20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。
平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为或更大。
3.证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃
培养24h~48h,观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
4.大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。
例:
10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:
100×6/10×104/g(mL)=×105CFU/g(mL)。
附件B
表1大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数
MPN
95%置信区间
阳性管数
MPN
95%置信区间
上限
下限
上限
下限
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
<
11
11
11
15
16
14
20
15
20
27
-
11
18
18
38
18
18
38
20
38
42
42
42
38
42
42
42
42
94
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
3
3
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
21
28
35
29
36
23
38
64
43
75
120
160
93
150
210
290
240
460
1100
>1100
17
9
17
37
40
18
37
40
90
42
90
180
420
42
94
94
94
94
94
110
180
180
200
420
420
420
420
430
1000
1000
2000
4100
—
注1:
本表采用3个稀释度[(mL)、(mL)和(mL)],每个稀释接种3管。
注2:
表内所列检样量如改用1g(mL)、(mL)和(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用(mL)、(mL)、(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。
附件C
大肠菌群计数检验流程图
第一法MPN计数法第二法平板计数法
附录4
大肠埃希氏菌计数
第一法MPN计数法
1.样品的稀释
固体和半固体样品:
称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水均质1min~2min,制成1:
10的样品匀液。
液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
样品匀液的pH值应在~之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸头尖端不要触及稀释液面),换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
2.初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。
产气者进行复发酵试验。
如所有LST肉汤管均未产气,即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。
3.复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中,放入带盖的℃±℃水浴箱内。
水浴的水面应高于肉汤培养基液面,培养24h±2h,检查小倒管内是否有气泡产生,如未产气则继续培养至48h±2h。
记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。
如所有EC肉汤管均未产气,即可报告大肠埃希氏菌MPN结果;如有产气者,则进行EMB平板分离培养。
4.伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管,用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板,36℃±1℃培养18h~24h。
观察平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
5.营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5个典型菌落,如无典型菌落则挑取可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面或平板上,36℃±1℃,培养18h~24h。
取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
6.鉴定
取培养物进行靛基质试验、MR(甲基红)-VP试验和柠檬酸盐利用试验(详见生化试剂盒使用)。
大肠埃希氏菌MPN计数的报告
大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵乳糖、产酸、产气,IMViC生化试验为++――或-+--。
只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌,其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。
依据LST肉汤阳性管数查MPN表(见附件D,表2),报告每g(mL)样品中大肠埃希氏菌MPN值。
第二法平板计数法
1.样品稀释
按第一法中的1进行
2.平板计数
选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。
同时
取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。
将10mL~15mL冷至45℃±℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注于每个平皿中。
小心
旋转平皿,将培养基与样品匀液充分混匀。
待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA-MUG覆盖平板表层。
凝固后翻转平板,36℃±1℃培养18h~24h。
平板菌落数的选择
选择菌落数在10CFU~100CFU之间的平板,暗室中360nm~366nm波长紫外灯照射下,计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
检验时用已知MUG阳性菌株(如大肠埃希氏菌ATCC25922)和产气肠杆菌(如ATCC13048)做阳性和阴性对照。
3.大肠埃希氏菌平板计数的报告
两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数,报告每g(mL)样品中大肠埃希氏菌数,以CFU/g(mL)表示。
若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
附件D
表2大肠埃希氏菌最可能数(MPN)检索表
阳性管数
MPN
95%置信区间
阳性管数
MPN
95%置信区间
上限
下限
上限
下限
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
<
11
11
11
15