第七章 分子生物学研究方法课件11.docx

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第七章分子生物学研究方法课件11

课件11

第七章分子生物学研究方法

TechniquesofMolecularBiology

第一节基因操作

第二节主要载体系统

第三节基因的分离与鉴定

第四节基因表达研究技术

第五节DNA序列测定

第六节蛋白质组学研究技术

第一节常见基因操作

DNA分子的切割与连接

核酸分子杂交凝胶电泳

凝胶电泳细胞转化

核酸序列分析核心技术

基因的人工合成

基因的定点突变

PCR扩增等

⒈DNA克隆概述

（1）克隆概念：

⏹多细胞的高等生物个体水平上：

同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。

⏹在细胞水平上：

指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。

⏹DNA克隆（基因克隆）？

从单一祖先产生同一的DNA分子群体的过程

（2）重组DNA技术简单概括为：

“分”——目的基因的获取

“切”——基因载体的选择与构建

“接”——目的基因与载体的拼接

“转”——重组DNA分子导入受体细胞

“筛”——筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子

（转化子）

⒉限制酶与电泳

⏹1962年Arber发现限制性核酸内切酶

⏹1967Gellert发现了DNA连接酶

⏹工作原理图

⑴限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）

⏹识别双链DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

⏹分类：

Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。

Ⅱ类酶识别序列特点为回文结构。

¡¤¡¤¡¤GGATCC¡¤¡¤¡¤

¡¤¡¤¡¤CCTAGG¡¤¡¤¡¤

⏹命名：

EcoRⅠ（E：

属名；co：

种名；R：

株；Ⅰ：

发现次序）

⏹限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：

—粘性末端（cohesiveend）和钝性末端（bluntend）

钝性末端（bluntend）

限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。

☐同工异源酶：

来源不同,但能识别和切割同一位点

HpaII-----CCGG----

MspI----GGCC----

⑵核酸的凝胶电泳（Gelelectrophoresis）

基本原理：

电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型

琼脂糖凝胶电泳（Agaroseelectrophoresis）

⏹琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2—50kb之间

聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamideelectrophoresis）

⏹分辨能力强，但分辨范围窄（1~1000bp）。

脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-fieldgelelectrophoresis）

大肠杆菌冰冷的CaCl242ºC热击筛选

（预先处理的0ºC）

⒊细菌转化（Transformation）

a）概念：

指一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。

b）方法——CaCl2法

c）感受态细胞转化频率的计算方法：

⏹转化总数=菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）

⏹插入频率=白色菌落数/（白色菌落数+蓝色菌落数）

⏹转化频率（每µgDNA转化菌落数）=转化体总数/加入质粒DNA总量（µg）

⒋DNA体外扩增技术

（polymerasechainreaction,PCR）

⏹PCR基本原理

⏹PCR三步曲

5.基因敲除技术及应用

Forward

Genetics

（1）基因敲除的概念

⏹基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，该技术通过外源DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性、染色体DNA与目的片段共同稳定遗传等特点。

完全基因敲除：

通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。

条件型基因敲除：

通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。

（2）完全基因敲除策略

⏹在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略是置换型载体的正-负双选择（positive-negativeselection,PNS）：

☐正向选择基因neor通常插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。

该基因的表达可以抵抗G418对细胞的致死效应。

☐负向选择基因HSV-tk（humansemianvirus-thymidinekinase）则被置于目的片段外侧，使培养液中的丙氧鸟苷（ganciclovir,GANC）磷酸化，进而参与DNA复制并造成DNA复制的提前终止。

（3）条件型基因敲除（Cre/LoxP系统）

第二节分子克隆载体

⏹载体的概念:

基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。

⏹载体特点：

Œ至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制

?

至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入

Ž至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞

?

安全性

|载体的种类

1.细菌质粒（克隆）

2.λ噬菌体（克隆）

3.柯斯质粒（克隆）

4.穿梭质粒（克隆/表达）

5.细菌人工染色体（克隆/表达）

6.酵母人工染色体（克隆/表达）

7.Ti质粒及其衍生载体（转化）

8.哺乳动物病毒载体

⒈质粒载体（plasmidsasvectors）

⏹构成：

ampr←Tn3

tetr←pSC101

Ori←pMB1

⏹优点：

较小的分子量

选择记号

较高的拷贝数

b）pUC质粒载体

⏹构成：

（i）ori←pBR322；

（ii）ampr；

（iii）lacZ’；

（iv）MCS。

⏹优点：

Œ更小的分子量和更高的拷贝数

?

MCS区段

Žα-互补作用

|蓝白斑筛选

——lacZ’基因的插入失活

载体：

含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和头146

个aa的编码序列

宿主：

缺失了lacZ’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列

α-互补:

lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以

与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶

隐性突变体之间实现互补。

在有IPTG，X-gal时，蓝斑是载体自连产物，而白色克隆是重组质粒。

这一系统称为lacselection。

c）pMD18-T质粒载体

⒉噬菌体载体

（PhagesasVectors）

左臂：

A→J

中段：

DNA整合和切出，溶原生长所需的序列

右臂：

调控区

cos位点

（cohesive-endsite，

粘性末端位点）

（3）λ噬菌体载体种类

a）插入型载体

☐免疫功能失活插入型载体

外源DNA片段→免疫区→裂解周期→清晰噬菌

斑没有外源DNA插入→混浊的噬菌斑

☐β-半乳糖甙酶失活插入型载体

含有lacZ区段载体感染lac-指示菌蓝色噬菌斑→lacZ区无外源片段插入白色噬菌斑→lacZ区有外源片段插入

b）替换型载体

⏹取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。

这类载体常被限制酶切为三段：

左臂、隔离段和右臂。

⏹有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon4A

⒊柯斯质粒载体

——含有λ-DNA两端cos区的质粒

第三节基因的分离与鉴定

目的基因的克隆战略分为两大类：

一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库；

另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达

Ø核酸探针克隆目的基因

ØmRNA差别显示技术分离克隆目的基因

ØcDNA差示分析法克隆基因

Ø酵母双杂交体系克隆基因

Ø基因的图位克隆法

⒈基因文库的构建

a）基因库与基因文库

特定生物体全基因组的集合（天然存在）叫genepool

从特定生物个体中分离的全部基因为genelibraryorgenebank。

这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。

根据构建方法的不同，基因文库分为：

●基因组文库（含有全部基因）：

材料来自染色体DNA

●cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）：

材料来自mRNA

b）基因文库的完备性：

在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：

N=ln（1–P）/ln（1–f）

n：

一个完全基因文库所应包含的重组体克隆数

P：

任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率

f：

插入片短的平均大小与基因组DNA大小的比值

（2）基因文库的构建程序

a）基因组DNA文库

存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。

简称G－文库。

b）cDNA文库

用细胞总mRNA制备全套双链cDNA后，建立的基因文库。

简称c－文库。

（3）从基因文库中筛选目的基因

（4）基因组文库重组克隆的排序

⏹酶切片段末端标记法

随机探针联合杂交法

⒉应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因

根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：

一类叫做看家基因

（house-keepinggene）；

一类叫做发育调控基因

（developmentalregulatedgene）

基因的差别表达（differentialexpression）：

不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式。

3.抑制消减杂交（SSH）

4.应用酵母双杂交体系克隆基因

⏹原理：

真核生物转录因子包括两个结构域：

5.基因的图位克隆法

第四节基因表达研究技术

⏹基因表达系列分析技术

⏹原位杂交技术

⏹定点诱变技术

⏹DNA微列阵技术

⏹RNA干涉技术

1.DNA微列阵技术

⏹何为生物芯片?

生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。

DNAChipTechnology

⏹Solidsupport（glass,plastic,metal,silicon）

⏹MiniaturizedarrayofDNA（geneticmaterial）

⏹WorkonthebiochemicalprincipleofDNA/DNAhybridization

⏹Hybridizedprobes（DNAmolecules）arefluorescentlylabeled

（2）DNA芯片的主要类型

按制备方式分：

原位合成芯片：

采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。

探针较短

DNA微集阵列：

将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。

探针的来源较灵活

ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:

☐ProbeandtargetDNA/RNA（Complexity）

☐Chipsurface（autofluorescence&non-spec.bkg）

☐Attachmentchemistry/methodology（hyb.efficiency&crosshyb.）

☐Hybridizationefficiency（lotsoffactors）

☐Detectiontechnology（signaltype,efficiency,noise）

ResearchUse——

FromSequencetofunction

⏹计算Ratio值（=Cy3/Cy5）。

在0.5-2.0之外的定义为在两样本中有明显差异表达。

进而获取初步功能信息。

⏹Clustering。

（4）DNA芯片技术的应用

DNA测序；杂交测序（SBH）

基因表达分析：

基因组研究：

作图、测序、基因鉴定、基因

基因诊断：

寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水

平上检测致病基因的表达

药物研究与开发：

应用之一——

基因表达谱（geneexpressionpattern）

⏹表达芯片实例

2.RNAinterference

——GenesilencingbydsRNA

⏹植物：

cosuppression（RichJorgensen,early90sin

20thcentury）

⏹真菌：

quelling（Cogonietal,1994）

⏹动物：

RNAinterfering

GuoandKemphues（1994）:

向秀丽线虫注射par-1基因的antisenseRNA，结果减弱了此基因的表达。

但是，对照组注射senseRNA，也得到同样结果？

！

RNAi现象的普遍性

⏹随后陆续发现RNAi也存在水稻、烟草、果蝇及人等所有的真核生物中。

⏹RNAi能高效特医的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲处的效果。

RNA-MediatedGeneSilencing

（2）RNAi的作用机制：

沉默信号的放大与传递

RNAi放大信号

TranscriptionalGeneSilencing

small-temporalRNAs

RNAinterference

转基因沉默分为：

■转录后水平的沉默（Post-transcriptionalGene

Silencing，PTGS）

■转录水平的沉默（TranscriptionalGene

Silencing，TGS）

■RNAi属于转录后水平的沉默

沉默信号的放大与传递

RNAi在组织间的传递

需要：

A）从一个细胞到另一个细胞

B）信号进行放大

A）SID,穿膜蛋白（为信号运输提供通道）

B）RdRP

-RNA依赖的RNA聚合酶

-存在于有些生物中（drosophila,plants）

-通过扩增富集siRNA的浓度

-siRNA为引物，靶mRNA为模板，合成

dssiRNA

G系统；pH8.0

硫酸二甲酯→G→m7G→C8~N9断裂→脱G

A+G系统；pH2.0

哌啶甲酸（pidine）→嘌呤环N质子化→脱嘌呤

C系统；1.5mol/LNaCl

C+肼（hydrazine）→脱C

T+C系统；

肼（hydrazine）→打开嘧啶环→重新5C环化→脱嘧啶

二、双脱氧法

三、DNA序列测定的自动化

1.DNA测序步骤与自动化

1）模板制备可自动化

2）定序反应可自动化

3）凝胶电泳自动化有一定困难：

制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。

4）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化

2.自动测序仪

Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。

红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）

黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）

兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP

优点：

i.四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；

ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；

iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。

缺点：

无法保留原始记录,四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。

DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，

一是指“分析反应”的自动化，

另一方面则是指“读片过程”的自动化。

PartIIproteins

2-1specificproteinscanbepurifiedfromcellextracts

⏹Thepurificationofindividualproteinsiscriticaltounderstandingtheirfunction.（why?

）

⏹Althoughtherearethousandsofproteinsinasinglecell,eachproteinhasuniquepropertiesthatmakeitspurificationsomewhatdifferentfromothers.

⏹Thepurificationofaproteinisdesignedtoexploititsuniquecharacteristics,suchassize,charge,shape,andinmanyinstance,function.

2-2purificationofaproteinrequiresaspecificassay

⏹Topurifyaproteinrequiresthatyouhaveanassaythatisuniquetothatprotein.

⏹Inmanyinstance,it’sconvenienttouseameasureforthefunctionoftheprotein,oryoumayusetheantibodyoftheprotein.

⏹Itisusefultomonitorthepurificationprocess.

2-4Proteinscanbeseparatedfromoneanotherusingcolumnchromatography

⏹Inthisapproach,proteinfractionsarepassedthoughglasscolumnsfilledwithappropriatedmodifiedsmallacrylamideoragarosebeads.

⏹Therearevariouswayscolumnscanbeusedtoseparateproteinsaccordingtotheircharacteristics.

Ionexchangechromatography

⏹Theproteinsareseparatedaccordingtotheirsurfacecharge.

⏹Thebeadsaremodifiedwitheithernegative-chargedorpositive-chargedchemicalgroups.

⏹Proteinsbindmorestronglyrequiresmoresalttobeeluted.

Gelfiltrationchromatography

⏹Thistechniqueseparatetheproteinsonthebasesofsizeandshape.

⏹Thebeadsforithaveavarietyofdifferentsizedporesthroughout.

⏹Smallproteinscanenterallofthepores,andtakelongertoelute;butlargeproteinspassquickly.

2-5affinitychromatographycanfacilitatemorerapidproteinpurification

⏹Ifwefirstlyknowourtargetproteincanspecificallyinteractwithsomethingelse,wecanbindthis“somethingelse”tothecolumnandonlyourtargetproteinbindtothecolumn.

Thismethodiscalledaffinitychromatography.

Immunoaffinitychromatography

⏹Anantibodythatisspecificforthetargetisattachedtothebead,andideallyonlythetargetproteincanbindtothecolumn.

⏹However,sometimesthebindingistootighttoeluteourtargetprotein,unlessitisdenatured.Butthedenaturedproteinisuseless.

⏹Sometimestags（epitopes）canbeaddedtotheN-orC-terminaloftheprotein,usingmolecularcloningmethod.

⏹Thisprocedureallowsthemodifiedproteinstobepurifiedusingimmunoaffinitypurificationandaheterologousantibodytothetag.

⏹Importantly,thebindingaffinitycanchangeaccordingtothecondition.e.g.theconcentrationoftheCa2+inthesolution.

immunoprecipitation

⏹Weattachtheantibodytothebead,anduseittoprecipitateaspecificproteinfromacrudecellextract.

⏹It’sausefulmethodto