第六章工业微生物诱变育种_精品文档.ppt

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第六章第六章工业微生物诱变育种工业微生物诱变育种微生物的微生物的诱变育种诱变育种是以人工诱变手段诱是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。

其在最适的环境条件下合成有效产物。

工业微生物育种过程分为工业微生物育种过程分为三个阶段三个阶段:

11、菌种基因型改变；、菌种基因型改变；22、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株；型或表型的变异株；33、产量评估，全面考察此变异株在工业化、产量评估，全面考察此变异株在工业化生产上的接受性。

生产上的接受性。

理想的工业用菌株必须具备：

理想的工业用菌株必须具备：

11、遗传性状稳定、遗传性状稳定22、纯净无污染、纯净无污染33、能产生许多繁殖单位、能产生许多繁殖单位44、生长迅速，能在较短的时间内生产所要的产物、生长迅速，能在较短的时间内生产所要的产物55、可以长期保存、可以长期保存66、能经过诱变产生变异和遗传、能经过诱变产生变异和遗传77、生产能力具再现性、生产能力具再现性88、具有高产量高收效、具有高产量高收效诱变育种的作用：

诱变育种的作用：

11、提高有效产物的产量、提高有效产物的产量22、改善菌种特性、提高产品质量、改善菌种特性、提高产品质量33、简化工艺条件、简化工艺条件44、开发新品种、开发新品种第一节第一节诱变育种的试验设计和准备诱变育种的试验设计和准备工作工作变异对微生物本身来说使其代谢向着异常变异对微生物本身来说使其代谢向着异常方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却显著地降低了。

显著地降低了。

高产突变型高产突变型是一种数量性状的遗传变异，是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决定的。

结构基因、调节基因、渗是由多基因决定的。

结构基因、调节基因、渗透基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一透基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变。

次诱变全部引起突变。

诱变育种诱变育种工作包括工作包括诱发突变诱发突变、突变株的筛选突变株的筛选和和高高产突变株最佳环境条件的调整产突变株最佳环境条件的调整。

诱发突变诱发突变包括包括出发菌株出发菌株、诱变剂诱变剂及其及其剂量的选剂量的选择择、影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素。

突变株的筛选突变株的筛选包括包括筛选培养基和培养条件筛选培养基和培养条件及及选选择一个简便、快速、有效的筛选方法择一个简便、快速、有效的筛选方法。

环境条件调整环境条件调整是是突变株的最佳培养条件改变。

突变株的最佳培养条件改变。

具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前，具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。

全面的了解。

诱变育种工作量大，周期长，对一般周期诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为为7-10d7-10d的抗生素菌种来说，一代诱变需的抗生素菌种来说，一代诱变需2-32-3个个月。

月。

1诱变育种诱变育种前期准备前期准备23456一、诱变前对出发菌株的了解一、诱变前对出发菌株的了解11、区分不同菌落类型区分不同菌落类型一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会出现多种形态类型的菌落（约有出现多种形态类型的菌落（约有2255种），不同类种），不同类型的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。

型的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。

22、出现不同菌落的原因出现不同菌落的原因遗传因素决定；遗传因素决定；常因为培养基组成或培养条件等的改变，引起菌常因为培养基组成或培养条件等的改变，引起菌落形态的变化落形态的变化。

二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系系11、考查菌种的生活史，了解它们的形态、考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理，生化等生物学特性，以及这些特性生理，生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。

与代谢产物合成的关系。

22、菌种的某些生物学特性与产量合成的相、菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性关性。

三、了解影响菌种生长发育的主要因素三、了解影响菌种生长发育的主要因素11、培养基、培养基22、培养基斜面制备技术、培养基斜面制备技术33、移种的密度、移种的密度44、温度、温度55、湿度、湿度66、药品和原材料质量、药品和原材料质量四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系。

成过程中与培养条件的关系。

五、建立一个准确、简便、快速检测产物的方五、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法法六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件第二节第二节诱变育种的步骤与方法诱变育种的步骤与方法诱变育种的步骤和方法包括：

出发菌株的选择；单孢子（或单细胞）菌悬液的制备；诱变剂及诱变剂量的选择；诱变的处理方法；以及菌种的纯化分离等。

一、出发菌株一、出发菌株1、对一般出发菌株的要求、对一般出发菌株的要求22、选择具有一定生产能力或某种特牲的菌株作为、选择具有一定生产能力或某种特牲的菌株作为出发菌株出发菌株33、选择纯种作出发菌株、选择纯种作出发菌株诱变中要选用单倍体、单核或少核的细胞为出诱变中要选用单倍体、单核或少核的细胞为出发菌株。

发菌株。

44、选择出发菌株应考虑其稳定性、选择出发菌株应考虑其稳定性55、连续诱变育种如何选择出发菌株、连续诱变育种如何选择出发菌株“增变菌株增变菌株”-缺乏缺乏DNADNA修复机制修复机制66、选择出发菌株的其他因素、选择出发菌株的其他因素77、采用多出发菌株、采用多出发菌株88、菌种代谢特点、菌种代谢特点二、出发菌株的纯化二、出发菌株的纯化纯种分离方法纯种分离方法:

常用常用划线分离法划线分离法和和稀释分离法稀释分离法。

显微镜操纵器分离单孢子显微镜操纵器分离单孢子三、单孢子（或单细胞）悬液的制备三、单孢子（或单细胞）悬液的制备11、供试菌株的孢子或菌株要年轻、健壮、供试菌株的孢子或菌株要年轻、健壮。

对数期对数期霉菌孢子浓度约为霉菌孢子浓度约为101066/ml/ml，放线菌孢子约为，放线菌孢子约为101066101077/ml/ml。

菌悬液的孢子或细菌数可用平皿计数，血球计数器计菌悬液的孢子或细菌数可用平皿计数，血球计数器计数或光密度法测定数或光密度法测定。

制备菌悬液通常采用生理盐水。

如果用化学诱变剂处制备菌悬液通常采用生理盐水。

如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制理时，应采用相应的缓冲液配制。

22、菌悬液的制备方法、菌悬液的制备方法细菌：

细菌：

最好在诱变处理前进行振荡预培养，这不仅最好在诱变处理前进行振荡预培养，这不仅使菌体分散，得到单个细胞，还可利用温度和碳源使菌体分散，得到单个细胞，还可利用温度和碳源控制其同步生长，取得年轻的、生理活性一致的细控制其同步生长，取得年轻的、生理活性一致的细胞；胞；孢孢子：

子：

在试验中应尽量采用成熟而新鲜的在试验中应尽量采用成熟而新鲜的孢子，并且置于液体培养基中振荡培养到孢孢子，并且置于液体培养基中振荡培养到孢子刚刚萌发，即芽长相当孢子直径的子刚刚萌发，即芽长相当孢子直径的0.50.511倍、离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液制成倍、离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液制成孢子悬液，用血球计数法进行计数，调整菌孢子悬液，用血球计数法进行计数，调整菌体浓度。

体浓度。

不产孢子的不产孢子的菌丝体菌丝体进行诱变处理进行诱变处理,有三种方法有三种方法:

第一、菌丝尖端法；第一、菌丝尖端法；第二、处理单菌落周围尖端菌丝；第二、处理单菌落周围尖端菌丝；第三、混合处理法。

第三、混合处理法。

33、制备原主质体作为诱变材料、制备原主质体作为诱变材料（11）在丝状真菌中）在丝状真菌中（22）细胞具有细胞壁）细胞具有细胞壁（33）不产生孢子丝状菌）不产生孢子丝状菌四、诱变剂及诱变剂量四、诱变剂及诱变剂量

（一）诱变剂种类的选择

（一）诱变剂种类的选择实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的。

一种诱变剂对是有效的。

一种诱变剂对AA菌株有较高的诱变效应；菌株有较高的诱变效应；对对BB菌株则可能相反。

不同微生物对同一种诱变剂菌株则可能相反。

不同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别。

敏感性有很大区别。

11、根据诱变剂的诱变机制选择、根据诱变剂的诱变机制选择诱变剂诱变剂选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱变剂。

变剂。

22根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂3参考出发菌株原有的诱变系选择诱变剂参考出发菌株原有的诱变系选择诱变剂

（二）最适诱变剂量的选择

（二）最适诱变剂量的选择由于各种微生物间遗传特性的差异，不同微由于各种微生物间遗传特性的差异，不同微生物或同一种微生物的各个菌种对同一种诱变剂生物或同一种微生物的各个菌种对同一种诱变剂的最适剂量是有区别的。

的最适剂量是有区别的。

在实际育种工作中，具体到某个菌种对某种在实际育种工作中，具体到某个菌种对某种诱变剂最适剂量的确定，作突变剂量曲线是比较诱变剂最适剂量的确定，作突变剂量曲线是比较可靠的。

可靠的。

在判断诱变剂量时，采用抗药性突变是比较可在判断诱变剂量时，采用抗药性突变是比较可靠的。

靠的。

剂量的大小常以致死率和变异率来确定剂量的大小常以致死率和变异率来确定。

五、诱变剂的处理方式五、诱变剂的处理方式可分为可分为单因子处理单因子处理和和复合因子复合因子处理。

处理。

单因子处理单因子处理，是采用单一诱变剂处理，一般认为单，是采用单一诱变剂处理，一般认为单因子不如复合因子处理效果好，这己经被很多事实因子不如复合因子处理效果好，这己经被很多事实所证实。

所证实。

但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变因子，那么单因因子，那么单因子子处理同样能够引起基因突变，效处理同样能够引起基因突变，效果也不错果也不错单一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传单一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化作趋向简单化。

当然单因子处理，一般情况突变率。

当然单因子处理，一般情况突变率比复合因子要低，而且突变类型也比较少。

比复合因子要低，而且突变类型也比较少。

复合因子处理复合因子处理是指两种以上诱变因子共同诱发菌是指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。

体突变。

又可以分为以下处理方式：

又可以分为以下处理方式：

11、两种以上因子同时处理、两种以上因子同时处理22、不同诱变剂交替处理、不同诱变剂交替处理通常以化学因子和物理因子交替进行效果较通常以化学因子和物理因子交替进行效果较好。

好。

33、同一种诱变剂连续重复使用、同一种诱变剂连续重复使用经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时之经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时之后（细菌或酵母），使细胞分裂后（细菌或酵母），使细胞分裂1-21-2代，接着再处代，接着再处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。

诱发理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。

诱发能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续重能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续重复使用，有益于变异乎的提高。

但是单因子连续使复使用，有益于变异乎的提高。

但是单因子连续使用代数不能过多，否则也会出现用代数不能过多，否则也会出现“