整理9311农杆菌介导转化体系.docx

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整理9311农杆菌介导转化体系

9311农杆菌介导转化体系

（注：

培养基“+”的为灭菌冷却到60℃后加）

（一）诱导愈伤

幼胚：

取生长一致的植株，剥去主茎外层、叶鞘，将穗子剪成小段，在超净工作台上先用75％酒精浸5min，用无菌水冲洗1次，再用次氯酸钠原液抽真空约10min至不冒气泡，再放于摇床振荡40min，无菌水冲洗4～5次，然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，放于诱导培养基（NB）上。

每皿30粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。

除不能萌发的幼胚外，愈伤诱导率到达98%。

幼胚的萌发和污染受幼胚灭菌效果和接种操作的影响，所以请小心操作。

（大概一周左右能见愈伤从盾片中长出，视愈伤和芽生长情况选择掐芽、继代时间，如图1）

图1适合掐芽作继代的9311幼胚愈伤

成熟种子：

分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。

种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl2消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上（9311为NB+ABA1mg/L），让胚的一半接触培养基。

每皿20粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。

（通过对四种基本培养基NBKNB、NB、MSTC、J0和NB+ABA0.5mg/L、NB+ABA1mg/L、NB+NAA0.5mg/L、NB+NAA1mg/L的研究表明，9311在NB+ABA1mg/L培养基中的诱导率是85%）

大概在两周左右愈伤长出、芽也比较长的时候掐去芽或者直接继代，具体时间视愈伤和芽的生长情况定，如图2、3是比较好的时期。

图2适合掐芽的9311成熟种子

图3掐了芽的9311成熟种子，继续放于诱导培养基中，这样状态的愈伤也可以去除谷粒和愈伤中的芽头直接转到继代J3中，但注意在去除谷粒和愈伤中的芽头时不要伤到愈伤也要去除干净

（二）继代培养

20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基上J3，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1~2次，每次20天。

（注意继代次数越多愈伤活性越差）

图4继代20天后的9311愈伤组织

（注意将愈伤继代的时候，不能用镊子将愈伤强行得分开，这样将导致褐化，需要做的是将愈伤自主分离的剥离，将褐化的愈伤除去，再将愈伤以原来相同的方向放在培养基上。

）

（三）农杆菌介导转基因

1、农杆菌准备：

划LB板（EH105为LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L），两天后挑单菌落划LB板（EH105为LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L）全皿，过夜用将菌洗到50ml液体的共培养基（NBM+As0.1mM）中，调OD600=0.5。

2、愈伤准备：

从没继代或继代1~2次的愈伤组织中挑选表面干爽结构致密的，于灭菌的滤纸上风干至表面发白。

3、农杆菌介导转化：

将愈伤转移到菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。

菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。

将愈伤转移到共培养基（NBM+As0.1mM）其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤，保证愈伤充分与滤纸接触，25~26℃下暗培养3天。

（第三天的时候可以在滤纸上看农杆菌的菌液，愈伤有些发油不过没有菌液）

4、筛选培养：

3天后，将愈伤转入灭过菌的三角瓶中，用菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞和400mg/L羧变青霉素的灭菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。

用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白（注意这点十分重要，这是抑制农杆菌关键的步骤，其他用红字标出的步骤也请多注意）。

转移到筛选培养基（培养基一般都需要放置3——7天再用，这样能保证培养基表面比较干燥，如果培养基表面有水层这样农杆菌很容易生长，同时对愈伤生长也很不利，在这样的条件下生长的愈伤状态不佳，到后面也不能分化，而会褐化或者变成根状的组织）（J3+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素+50mg/L潮霉素）中（注意一个培养皿不能接太多愈伤，大概控制在20个以内，防止没有抑制农杆菌的愈伤感染周围的愈伤，请每天都检查，及时将长农杆菌的愈伤用灭过菌的勺子挖除），25~26℃下暗培养，20天后将长出抗性愈伤的愈伤整体转入新的筛选培养基中，不需要进行分离这样能减少对抗性愈伤的伤害。

（因为不易分辨新长出的抗性愈伤和已经失去活性但没有变褐的愈伤，建议将所有可能的愈伤的移到新培养基上去）

（四）分化培养

1、结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤整体转移到预分化培养基（Y+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素）中，置于光培养培养箱中培养条件为：

25~26℃，14h光照培养，光强1000~1500lx，3~7天陆续有愈伤变绿，7天后统计愈伤变绿的百分率是53.46%。

（最好将预分化培养基装在三角瓶中，因为在光照培养箱中培养皿水汽容易蒸腾到盖子上，三角瓶因为空间比较大形成的微环境适合预分化。

）

图7经过两次筛选产生的抗性愈伤转到预分化培养基

图8经过7天预分化的愈伤状态

图9经过7天预分化的状态比较好的愈伤

2、将预分化培养基中变绿的愈伤转到分化培养基（DL+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素）中，置于25~26℃，14h光照培养，光强1000~1500lx光照培养，每20天更换一次培养基。

图10转入分化培养基7天后愈伤生长情况

图11转入分化培养基40天后愈伤生长情况

（五）生根培养

安全评价是落实“安全第一，预防为主，综合治理”方针的重要技术保障，是安全生产监督管理的重要手段。

绿苗高约5~8cm时，转移到生根培养基（R）上，促进根的生长置于置于25~26℃，14h光照培养，光强1000~1500lx光照培养。

图12转入生根培养基7天后情况

（4）建设项目环境保护措施及其技术、经济论证。

图13转入生根培养基30天后，适合移栽的根生长状态

（2）疾病成本法与人力资本法（六）移栽

2）预防或者减轻不良环境影响的对策和措施。

主要包括预防或者减轻不良环境影响的政策、管理或者技术等措施。

3~4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

四、安全预评价

图14炼苗

另外，故障树分析（FTA）和日本劳动省六阶段安全评价方法可用于定性、定量评价。

总之，因为组织培养是个生长过程，所以请根据实际生长情况调整，可以参考以上的照片和时间。

附表一：

2.环境影响评价技术导则

6.建设项目环境影响评价文件的其他要求NB

B.可能造成重大环境影响的建设项目，应当编制环境影响报告书J0

3）应用污染物排放标准时，依据项目所属行业、环境功能区、排放的污染物种类和环境影响评价文件的批准时间确定采用何种标准。

综合性排放标准与行业性排放标准不交叉执行，即：

有行业排放标准的执行行业排放标准，没有行业排放标准的执行综合排放标准。

NBM

majorsalts

minorsalts

10×B5

CuSO43mg/L

Fesalts

vitamins

糖

蔗33.5g/L

蔗30g/L

麦30g/L

蔗30g/L

20g/L

山梨醇

20g/L

谷氨酰胺

0.5g/L

0.3g/L

0.5g/L

脯氨酸

0.5g/L

水解酪蛋白

0.3g/L

0.8g/L

0.3g/L

2,4-D

3mg/L

2.5mg/L

0.1mg/L

2mg/L

IAA

0.2mg/L

0.5mg/L

NAA

0.2mg/L

1mg/L

0.5mg/L

2mg/L

琼脂

8.5g/L

5.6

Fesalts:

J3为FeSO4·7H2O41.8mg/L+Na2EDTA55.9mg/L

DL为FeSO4·7H2O55.9mg/L+Na2EDTA74.5mg/L

Vitamins:

DL为甘氨酸2.0mg/L+盐酸硫胺素1.0mg/L+盐酸吡哆醇1.0mg/L+烟酸1.0mg/L+肌醇100mg/L

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