发酵染菌原因分析.docx
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发酵染菌原因分析
发酵染菌原因分析
第一部分：
基础知识
1）杂菌的类型
空气中的微生物大多数是细菌和芽孢,还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。
细菌的大小有零点几微米至几个微米.
根据以上特点我们应得出如下结论：
A：
这些微生物在空气中极少单独游离存在,基本上是附着于灰尘、液滴等微粒的表面上。
B：
介质过滤除菌就是把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。
因此我们通常所用的空气过滤器为什么0.3u可以保证无菌发酵生产的原因。
2）无菌检查与染菌的处理
在抗生素生产过程中,为了及早发现染菌并进行恰当处理,保证生产正常进行,对菌种制备、种子罐、发酵罐的接种前后和培养过程中,须要按工艺规程要求按时取样，进行无菌检验。
A：
无菌检查
培养液是否污染杂菌可从三个方面进行分析：
a:
无菌试验
b:
培养液的显微镜拉查
c:
培养液的生化指标变化情况。
其中无菌试验是判断染菌的主要依据。
无菌试验
现在采用的无菌试验方法有肉汤培养法、双碟培养法、斜面培养法。
其中以酚红肉汤培养法和双碟培养法结合起来进行无菌检查用的较多。
（1）肉汤培养法直接用装有酚红肉汤的无菌试管取样,然后放入37℃恒温室（箱）内培养。
定时观察试管内肉汤培养基的颜色变化,同时进行显微镜观察。
（2）斜面培养法先用空白无菌试管取样,然后在无菌条件下接种于斜面培养基上,置于37℃恒温室（箱）内培养。
定时观察有无杂菌菌落生长。
。
（3）双碟培养法种子罐样品先取入肉汤培养基中,然后在无茵条件下在双碟培养基上面划线,剩下的肉汤培养物在恒温室（箱）内培养6小时后复划线一次,发酵罐培养液直接取入空白无菌试管中,于37℃下培养6小时后在双碟培养基上划线。
24小时内的双碟定时在灯光下检查有无杂菌生长。
24小时~48小时的双碟1天检查一次,以防生长缓慢的杂菌漏检。
正常生产过程中,种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次,进行无菌检查。
该方法经常用于单菌落挑选，可以从染有杂菌的培养液中经多次划线挑取单菌落进行分离培养，得到纯种的种子。
无菌试验的结果一般需要8~12小时才能作出判断。
为了缩短判断时间,有时向培养基中加入赤霉素、对氨基苯甲酸等生长激素以促进杂菌的生长。
B:
染菌的判断
培养基的染菌判断是错综复杂的工作,又是一种细微观察、认真分析的王作。
染菌罐的判断方法：
以无菌试验中的酚红肉汤培养和双碟培养的反应为主,以镜检为辅。
每个无菌样品的无菌试验，至少用2只酚红肉汤或斜面同时取样培养。
要定量或用接种环蘸取法取样，公司现阶段基本都直接从发酵罐直接取样。
因取样量不同,影响颜色反应和浑浊程度的观察。
如果连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或产生浑浊,或斜面连续3个时间样品长出杂菌即判断为染菌。
有时酚红肉汤反应不明显,要结合镜检确认连续3个时间样品染菌，即判为染菌。
各级种子罐的染菌判断亦参照上述规定。
对肉汤和无菌斜面的观察及保存期的规定,发酵培养基灭菌后应取无菌样，以后每隔8小时取无菌样一次，直至放罐。
无菌试验的肉汤和双碟应保存并观察至本罐批放罐后12小时，确认无杂菌污染后方可弃去。
无菌检查时间应每6小时观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。
2、染茵率的统计
以发酵罐染菌罐批（次）为基准,染菌罐批（次）应包括染菌重消后的重复染菌的灌（批）次在内。
发酵总过程（全周期）无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处。
发酵罐染菌罐批（次）
染菌率（％）＝一一一一一一一一－－－X100%
总投罐批（次）
3）染菌（包括染噬菌体）的处理
（一）污染杂菌的处理
发酵罐污染杂菌后,依据染菌时间、所染杂菌的危害性及时进行处理,同时对所涉及的设备也要及时处理。
a.种子罐染菌的处理
种子罐染菌后都不能往下道工序移种,要及时用高压蒸汽直接灭菌后经过滤处理放下水。
b.发酵罐染菌的处理
发酵罐前期染菌,污染的杂菌对产生菌的危害性大,采用蒸汽灭菌经过滤处理后放掉;如果危害性不大,可用重新灭菌、重新接种的方式处理,如营养成分消耗较多,可放掉部分培养液补入部分新培养基后进行灭菌,重新接种；如污染的杂菌量少且生长缓慢,可以继续运转下去,但要时刻注意杂菌数量和代谢的变化。
在发酵的中后期染菌,一是加入适量的杀菌剂,如呋喃西林或某些抗生素,抑制杂菌的生长。
二是降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的生长速度。
如果采用上述两种措施仍不见效,就要考虑提前放罐。
c、染菌后的设备处理
..染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理,再用蒸汽灭菌〈包括各种附属设备〉。
在再次投料之前,要彻底清洗罐体、附件,同时进行严密程度检查,以防渗漏。
染菌后的处理尤为重要，很多大面积染菌都是由于处理不彻底而造成的系统污染，造成无法及时处理好各个环节出现连续污染。
（二）污染噬菌体的处理
抗生素等产品发酵过程中有时出现噬菌体污染,轻者造成生产能力大幅度下降,重者造成停产。
一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀,泡沫增多,早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶,最后仅残留菌丝断片,平皿培养出现典型的噬菌斑,溶氧浓度回升提前,营养成分很少消耗,产物合成停止等现象。
发酵过程中污染噬菌体后，一般做如下处理：
1.发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失；2.全部停产,对环境进行全面的清洗和消毒,断绝噬菌体的寄生基础；3.更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体菌种,防止噬菌体的重复污染。
污染烈性噬菌体时出现上述现象。
如果污染温和噬菌体时,其反应温和,平皿培养不出现明显的噬菌斑,只出现部分菌体自溶,生化指标变化不显著,生产能力降低,对生产的危害亦是严重的,但不易被发现。
防止温和噬菌体污染的方法同上所述。
第二部分：
染菌原因分析
染菌是发酵工业的大敌,不制服染菌就不能实现优质高产。
在抗生素发酵生产中造成发酵染菌的原因很多，分析染菌的原因是很困难的。
但在众多的原因分析中，从人、机、料、法、环各个环节进行细致的分析.从多方面查找原因,查出杂菌的来源,采取相应措施予以制服。
一、染菌原因的分析。
染菌的途径多,表现的现象多样。
因而追查杂菌的来源是困难的,从现有的经验可从下述几千方面进行分析。
（一）从染菌的规模和时间分析
在发酵过程中,如果是种子罐和发酵罐同时大面积染菌,杂菌的主要来源可能是空气净化系统,如空气过滤器失效或空气管道渗漏造成的。
其次考虑种子制备工序。
如果只是发酵罐大面积染菌,除考虑空气净化系统带菌外,还要重点考查接种管道、补料系统。
发酵培养基采用连续灭菌工艺时,还要严格检查连消系统是否带入杂菌。
如果是部分发酵罐在发酵早期染菌,可能是培养基灭菌不彻底,或种子罐带菌,或接种管道灭菌不彻底造成的。
如果是发酵的中后期染菌,重点分析补料系统和加消沫剂系统，个别发酵罐连续染菌,就从单个罐体查找杂菌来源,如罐内是否有“死角”或冷却系统有渗漏。
当然还要检查附件,个别罐批的散在性染菌,其原因很难追查,要具体情况具体分析。
（二）从杂菌类型分析
发酵过程染菌,多种菌型出现的机率多,单菌型机率较少。
染的是耐热芽孢杆菌时,这与培养基灭菌不彻底或设备内部有“死角”关系甚大。
空气中也存在芽孢杆菌,污染的杂茵是不耐热的球菌或杆菌时,可从空气净化系统和冷却系统进行追查。
二、制服染菌的要点
从表5－4的抗生素发酵染菌原因分析的统计资料看,空气净化系统带菌是导致染菌的主要因素。
但仔细分析,设备穿孔和渗漏等造成的染菌占33.85％，占第1位。
表5－4染菌原因的系统分析
染菌原因所占百分比,％染菌原因所占百分比,％
1.种子带菌或怀疑种子带菌9.648.接种管穿孔。
0.29
2.接种时罐压降至大气压力0.199.阀门泄漏1.45
3.精养基消毒不透0.79110.搅拌轴封的泄漏2.09
4.总空气系统带菌l·.9611.罐盖泄漏l.54
5.泡沫升至罐顶0.4812.其它设备泄漏10.13.·
6.央套穿孔12.3613.操作问题l0.15'
7.蛇管穿孔5.8914.原因不明24.91
据已有的制服染菌经验,对发酵过程中涉及的空气净化系统、设备系统、蒸汽质量、工艺操作提出下述要求。
1·对空气净化系统的要求
防止空气净化系统带菌的主要措施有提高空气进口的空气洁净度；除尽压缩空气中夹带的油和水,保持过滤介质的除菌效率。
现在公空气系统应该有了很大的进步，不存在油的问题，但在夏秋两季，由于空气湿度较大可能出现预过滤器放出水的现象，因此各个车间应根据车间情况，定时放水。
另外,在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻或烧灼,还要防止发酵液倒流入空气过滤器内。
2·对蒸气的要求
首先要重视蒸汽质量,一般采用饱和蒸汽,严格控制蒸汽中的含水量,按照不同灭茵工艺要求提供稳定的蒸汽压力,灭菌过程中蒸汽压力不可以大幅度的波动,以保证灭菌质量，我公司蒸汽情况是过热蒸汽，希望热电车间在处理蒸汽的时候保证蒸汽喷水的均匀性。
3.对设备的要求
发酵罐及其附属设备应做到无“渗漏”,无“死角”。
凡与物料、空气、下水道连接的管件阀门应保证严密不漏,蛇管和夹层应定期试漏。
连续灭菌设备要定时拆卸清洗。
无菌操作室和菌种培养间定期消毒,以保持无菌状态。
4.对工艺操作的要求
发酵罐放罐之后,对罐体和附属设备进行全面清洗和检查,清除罐内的残渣,除尽罐壁上的污垢,清除罐内附件处的堆积物。
配制培养基时要防止物料结块或带入异物,配料罐和输送料液系统要定时清洗消毒。
在实罐灭菌、空罐灭菌、培养基连续灭菌、各种管道的灭菌等的操作过程中,要严格执行工艺规程要求。
灭菌中要保证蒸汽畅通,保证蒸汽压力与温度的对应关系。
这里重点强调一下关于假压力的问题，保证空气排尽，注意分配主进汽，付进汽。
菌种组的工作人员要严格按工艺规程制备生产种子。
对进入无菌室的全部物料、器械实行灭菌。
坚持无菌间和无菌操作人员的菌落检测制度。
发酵过程的无菌检查工作,要严密取样操作,力求减少取样和平皿划线时的操作误差。
严格镜检岗位的操作要求,降低无菌检查中的错判与误判。
发酵染菌罐批，及时查明杂菌来源,并采取相应措施予以处理，
对空气净化系统、补料系统、转种系统等要严格管理,加强无菌检查。
第三部分：
灭菌的对数残留定律
1）实消灭菌的时间计算：
t=2.303/klogN0/Ns
t-----灭菌时间秒
k----速度常数，1/秒与灭菌采用的温度和菌的种类有关
N0----开始灭菌时原有菌个数
Ns----结束灭菌时菌个数
2）2）连续灭菌的时间计算：
t=2.303/klogC0/Cs
t-----灭菌时间秒
k----速度常数，1/秒与灭菌采用的温度和菌的种类有关
C0----开始灭菌时每毫升原有菌个数
Cs----结束灭菌时每毫升菌个数
第四部分：
空气过滤器膜的介绍
分离机理：
气体—阻留、沉积、扩散、拦截、静电…
膜材料：
醋纤—三醋纤、磺化聚砜、磺化聚醚砜、芳香聚酰胺、陶瓷…
供应厂商：
PAULDHMILIPOR上海过滤器厂上海一鸣
MF分类—膜
材料
金属膜，金属合金膜，高分子膜，高分子合金膜，陶瓷膜…
型式
板状膜，管状膜—毛细管状、多通道管状、圆管状…
制法
相转化，膨化拉伸，烧结，核迹—刻蚀，溶胶—凝胶…
特性
亲水膜，疏水膜，耐腐蚀膜，耐高温膜，高强度膜…
效率
绝对过滤膜，公称过滤膜，预过滤膜…
孔型
绝对过滤膜，公称过滤膜，预过滤膜…
25
膜过滤——微滤（MF）
MF评价
膜评价
内因
孔结构，孔径及其分布，孔隙率
外因
耐热性，耐化学品腐蚀性，机械强度
器评价
可靠性
精度，效率，耐温性，耐化学品腐蚀性，亲疏水性，机械强度
经济性
通量，购买成本，更换频率
内因与精度、效率、通量关联，外因与使用环境关联。
技术关键：
（1）膜无缺陷制作工艺，
（2）器无损伤制作工艺，（3）正确的评价方法。
MF膜评价—孔径及其分布
方法
＊气泡点法，汞压入法，流速
法…
原理
毛细管模型（常规）
孔板模型（YM专有技术）
模型
——
——
r=4kбcosθ/p
r=4kбcosθ/5p
算式
r-孔径，k—修正系数，
б—测试液表面张力，
θ—膜材料与测试液接触角，
p—起泡点压力
分布类型
左倾斜，对称（正态分布），右倾斜
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MF膜评价—耐热性
膜材质
PTFE
PVDF
PES
N6
CA-CN
Ni
SS
长期使用最高温度
80
80
80
70
60
250
400
短期蒸汽消毒温度
142
138
130
121
121
350
600
MF膜评价—耐化学品腐蚀性
实验法：
溶剂中浸泡24hr，其泡点下降＜10％，通量下降＜20％，则可定义为膜能耐该种溶剂。
MF组件评价—过滤精度与效率试验方法
完整性试验：
破坏性实验，非破坏性实验
破坏性实验：
细菌实体试验，杂质实体试验
非破坏性实验：
流量扩散试验，气泡点试验，压力保持试验，油雾实体试验
MF组件评价—常见评价法
方法
扩散流法
压力衰减法
油雾法
泡点法
原理
Fick定律
道尔顿定律
类比原理
Young方程
类型
间接
间接
直接
间接
研究
对象
以流经膜的气体量为考查对象，来评价膜孔大小，推算过滤精度、效率
以膜前气体压力的变化为考查对象，来评价膜孔大小，推算过滤精度、效率
以油雾粒子在过滤前后数量（重量）变化为考查对象，来计算过滤精度、效率
以膜湿润后冒出气泡时的压力为考查对象，来评价膜孔大小，推算过滤精度、效率
局限性
不完全适用于气体
不完全适用于气体
不完全适用于液体
不完全适用于组件
MF过滤机理—气体
机理
意义
直接阻留
膜使所有比膜孔径大的粒子全部阻留在截留表层上
惯性沉积
微粒有足够的惯性力，使它不能随流线绕过膜而被阻留
拦集截留
微粒惯性较小时，虽能随流线运动，但几乎完全沉没在环绕膜体的粘性流中，由于粘性流足够的慢而使颗粒被留下
扩散截留
微粒由于布朗运动而从流线中游离出来，经碰撞膜体而被阻留
静电截留
依靠微粒与膜体间实有的或诱导的静电力，使微粒撞击到膜体上被捕集
图片：
产品名称：
聚偏氟乙烯微孔滤膜（PVDF）
产品特点：
＊双面成膜双重过滤＊有很强负电性＊孔...
产品参数：
尺寸：
280×∞mm。
F-...
产品型号：
F-A、D
材质结构：
聚偏氟乙烯（PVDF），聚酯（PET）无...
使用说明：
产品名称：
玻纤披覆氟聚物微孔滤膜（HFGF）
产品特点：
＊纤维表面经氟聚物处理＊集纤维与膜的过...
产品参数：
尺寸：
280×∞mm。
F-...
产品型号：
F-B、E
材质结构：
氟聚物（HF），玻璃纤维（GF）
使用说明：
请垂询一鸣公司
第五部分：
查找染菌原因的深层次分析案例
大观霉素发酵生产的染菌率较低。
个别发酵罐染菌后，生长代谢所受影响也较小，大多能正常周期放罐，发酵单位所受损失也不大。
99年出现的几批染菌罐却表现出了很大异常：
确定染菌后，发酵罐PH开始急剧下降，糖耗快，氨氮降低，发酵单位开始下滑，只能提前放罐。
严重影响正常。
本文从染菌原因分析，给制服无菌提供了一个新思路，为国内抗生素生产厂家对制服染菌有借鉴作用。
为找清染菌原因，从染菌罐分离出杂菌，考察其培养特性，做耐热实验。
然后根据这种菌在发酵培养基中的生长速度，推算出杂菌进入发酵罐的时间，最终确定了染菌原因，并采取了相应的措施，制服了这次染菌。
现将这次染菌的原因分析及相应的对策介绍如下。
一：
染菌特征
1：
发酵罐培养至50小时左右，33小时后的无菌肉汤跟踪样开始变色，确认染菌。
此后，发酵罐PH开始急剧下滑，糖耗快，氨氮下降，发酵单位停止增长，60小时左右提前放罐。
2：
变色肉汤涂片镜检：
短杆菌。
3：
发酵液（周期60小时左右）涂片镜检：
杆菌，已经形成芽孢。
二：
杂菌分离、培养
1：
把变色肉汤接入无菌红色肉汤，37℃恒温培养。
24小时后肉汤变黄，表明这种菌代谢产生酸性物质。
2：
向变色肉汤中加入2滴5M的NaOH溶液，摇匀（PH为10），放置10分钟。
把该肉汤接入无菌肉汤，37℃恒温培养48小时，肉汤仍不变色。
说明这种杂菌对碱性环境的耐受性较差。
3：
用细菌培养基对这种杂菌进行平板分离，杂菌菌落具有细菌菌落的典型特征。
挑取单菌落接入肉汤，培养特征与直接从染菌罐接入的肉汤中的杂菌一致。
镜检，杂菌呈短杆状，可观察到部分菌体进行二分裂繁殖。
4：
把杂菌接入菌种效价跟踪用的发酵瓶，培养情况与发酵罐的代谢情况类似。
5：
把杂菌接入空白发酵瓶，培养24小时后进行平板分离及肉汤检测，结果证明这种菌能在发酵瓶中存活、生长繁殖。
由于发酵瓶和发酵罐的营养成分、培养条件一致，因此可以用发酵瓶来模拟杂菌在发酵罐中的生长情况。
三：
杂菌耐热性实验
用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养这种菌，吸取定量体积的菌液分别接入11支无菌肉汤。
取1支作对照，另10支每2支为1组，分别在100℃沸水浴中加热5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟。
37℃恒温培养24小时，只有加热25分钟的两支肉汤不变色。
说明这种菌的耐热性较强。
四：
染菌时间判断
把杂菌接入空白发酵瓶，在不同培养时间取样，进行平板菌落计数，计算出发酵瓶内的菌体数。
该菌的繁殖方式为二分裂，根据培养时间和菌体数目的对应关系，可以计算出该菌在发酵瓶内繁殖一代所需的时间（代时）。
1：
制备菌体稀释液（浓度约每毫升几百个）
从平板上挑取单菌落，按梯度稀释法制得菌体稀释液（约520个/毫升）。
2：
代时的确定
吸取1毫升稀释液接入空白发酵瓶（30毫升培养基），发酵瓶培养条件与发酵罐培养条件保持一致。
在不同时间取样，进行平板菌落计数。
计算出对应的菌浓和菌体数，如下表。
培养时间
（小时）
取样量
（毫升）
菌落数
（个）
菌浓
（个/毫升）
菌体数
（个）
0
0.5
16
32
960
1.5
0.5
40
80
2400
3.0
0.2
49
245
7350
4.5
0.2
122
610
18300
6.0
0.1
172
1720
51600
根据公式X2=X1ⅹ2（t2•t1）/T,t2-t1=3.322ⅹTⅹlg（X2/X1）和上表数据，计算得到代时（T）约为1.1小时。
其中，X1为时间t1时的菌体数量，
X2为时间t2时的菌体数量，
T为代时（繁殖一代所需的时间）。
3：
发酵罐染菌时间的推算
出现的连续几批染菌罐，染菌特征一致，染菌为上述耐热短杆菌。
取培养时间为50小时的染菌发酵液，进行梯度稀释、平板菌落计数，计算得到发酵罐在50小时的杂菌浓度为9.08ⅹ107个/毫升。
发酵液的体积按12立方米计算，杂菌总数量为1.09ⅹ1015个。
以杂菌在发酵液中的代时为1.1小时计算，杂菌进入的数量与繁殖到1.09ⅹ1015个所需的时间如下表，可能的染菌时间即为转运周期与杂菌繁殖时间的差值。
排除杂菌一次以极少数目（几个或几十个）进入可能性，大致的染菌时间应为10到20小时之间。
杂菌进入数量
（个）
杂菌繁殖到1.09ⅹ1015个所需时间（t2小时）
染菌时间
（50-t2小时）
1
50
0
100
43
7
1000
40
10
100000
33
17
发酵罐运转至10到20小时正好是补料开始的时间。
所以几乎可以肯定是补料系统出现问题造成了这次染菌。
染菌菌型的一致性以及染菌面积也说明了这一点。
五：
相应的制服染菌的措施
根据染菌原因分析，我们对补料系统进行了一次彻底的检查和改造，并针对这种菌耐热不耐碱的特性制定了相应的清洗消制度，染菌很快得到了控制。
1：
提高补料系统蒸汽消毒的温度和压力，延长消毒时间；
2：
定期用甲醛熏消补料系统；
3：
用稀碱水煮补料罐，然后用稀碱水冲洗补料管道；
4：
对补料系统中可能的消毒死角进行改造。
这次染菌原因分析应用了一些基本的微生物学技术，显示出了基础的理论知识和技能对消毒工等从事发酵工作的人员的重要性。
我们在分析过程中忽略了这种菌和大观霉素产生菌之间的拮抗作用，但这种方法是建立在一定的实践经验的基础上的，的确能够提供一种分析问题解决问题的思路。
另外，如果杂菌繁殖的代时较长，计算出的杂菌在发酵罐中生长到一定浓度所需的时间已超过了发酵罐的培养时间，就要考虑一次性有大量杂菌进入嗨哟种子带菌的可能性了。
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