《黄酒中氨基酸测定方法》行业标准编制说明.docx
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《黄酒中氨基酸测定方法》行业标准编制说明
《黄酒中氨基酸的测定方法》行业标准编制说明
征求意见稿
《黄酒中氨基酸的测定方法》
行业标准起草工作组
二O一一年二月
一、任务来源
根据发改办工业[2008]1242号文件下达的行业标准计划任务，《黄酒中氨基酸的测定方法-高效液相色谱法》由中国食品发酵工业研究院等负责起草，全国食品发酵标准化中心归口管理。
二、制标的原则
《标准编写的规则第4部分：
化学分析方法》的要求编写的。
三、标准化方法研究过程
本标准起草工作组通过查阅大量国内外氨基酸测定的方法，通过对各方法的特点进行对比分析，结合实验室的条件和方法适用性，选择异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前衍生高效液相色谱法进行测定。
对样品的处理方法，衍生反应条件、色谱分离条件等进行了优化，通过回收率、稳定性及精密度等一系列的研究，建立了液相色谱法同时进行天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、4-氨基丁酸（Aba）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Va1）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、赖氨酸（Lys）等18种氨基酸分析方法。
本方法经过中国食品发酵工业研究院、上海金枫酒业股份有限公司、浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、北京市产品质量监督检验所、首都师范大学化学系和中粮酒业有限公司技术中心等6家实验室验证，实验室间的再现性相对标准偏差RSD基本小于10%。
四、研究背景
氨基酸是一种两性化合物,它的分子中既含有氨基又含羧基,由于这两种基团的强弱性不同,所以氨基酸既有酸性的也有碱性的。
饮料酒中氨基酸的种类和含量是影响其风味和衡量其营养质量高低的一项重要指标。
黄酒的甜度和酸度主要由糖类和有机酸决定，而其它诸味则主要决定于游离氨基酸的组成，黄酒中氨基酸主要来自原料及微生物的代谢作用，氨基酸赋予了黄酒较高的营养价值。
因此研究黄酒中游离氨基酸含量快速、准确的测定方法，对研究黄酒的营养价值和质量控制具有十分重要的意义。
国内外早已将氨基酸自动分析仪用于氨基酸的分析测定,自动化程度高，测定准确，但是仪器价格昂贵，应用的范围较窄；大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收,进行化学衍生化生成具有紫外或荧光吸收的化合物，然后采用液相色谱法进行测定，已成为氨基酸分离和分析的重要手段.。
氨基酸衍生化方法可分为两大类：
（1）柱后衍生法。
AOAC官方采用的氨基酸分析标准方法就是以茚三酮为柱后衍生试剂的HPLC-UV法。
该法准确、可靠、重现性好，但缺点是灵敏度不高，仅达到100pmol，而且需双波长检测（440nm处检测脯氨酸，570nm处检测其它氨基酸）。
随后，有人用荧光胺、OPA代替茚三酮作为柱后衍生试剂，采用荧光检测，灵敏度提高了三个数量级，但其不与二级氨基酸（如脯氨酸）反应。
（2）柱前衍生法。
相对柱后衍生法，柱前衍生法具有省时、仪器配置简单的优势。
柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择。
常用的衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA），9-芴基甲氧基羰酰氯（FMOC-CL），Dansyl-Cl、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐（AQC）、异硫氰酸苯酯（PITC）等。
其中OPA衍生效率高，但是不能与二级氨基酸直接反应，需要用FMOC（能同时与一级氨基酸和二级氨基酸反应）来补充，过多的FMOC-Cl还会对结果造成干扰而不利于定量测定；同时它们的分离效果不够理想；Dansyl-Cl与氨基酸的反应较慢，且过多的衍生剂会对测定结果产生干扰；AQC可以同时和一级和二级氨基酸直接反应，衍生效率较好，但是它为专利产品，应用成本较高；相比之下异硫氰酸苯酯（PITC）和氨基酸和亚氨基酸均能反应，反应的产物稳定见图1，试剂的成本较低，是目前氨基酸分析中具有吸引力的方法之一，因此本研究采用PITC对18种氨基酸进行柱前衍生，液相色谱法进行测定。
图1氨基酸和PITC反应方程
五、本标准分析条件的优化
1衍生反应条件的选择
1.1反应时间的确定
采用氨基酸混标工作液，将衍生方法中的衍生时间设定为10，20，30，45，60min，按上述时间衍生，进样分析后，比较各氨基酸峰面积的变化（以Glu、Ser、Arg、Gly、Pro、Try代表），试验结果表明氨基酸在45min趋于稳定，60min后衍生完全见图2，因此本文选择60min为衍生反应的时间。
图2反应时间的影响
1.2衍生剂的去除和介质酸度的调节
过量衍生试剂PITC的存在，对色谱峰会有一定干扰，去除PITC常用的方法有真空干燥和有机溶剂萃取，经过比较发现前者操作繁琐，本方法采用正己烷萃取去除PITC，达到净化的目的；反应产物的介质为偏碱性介质，对色谱的峰形和重现性有一定的影响，且该产物在中性介质较为稳定，因此本方法采用加入10%乙酸，将反应后的介质调节为中性。
2色谱条件的选择优化
2.1色谱分离条件的优化
18种氨基酸衍生物性质较为接近，尤其是Gly-His、Arg-Thr、Thr-Aba、Aba-Ala、Ile-Leu等较难分离，同时黄酒中存在大量干扰物质，如含量较高的氨根离子等也和PITC反应，其产物与Ala，Pro较为接近，因此，能否有效的分离18种氨基酸是定量测定的重要因素；本研究首先选用不同C18色谱柱进行18种氨基酸的测定，选择对18种氨基酸分离效果好的色谱柱，然后开展流动相比例的选择优化，对流动相pH、柱温及离子对试剂的等因素进行了研究，最终采用梯度洗脱的方式，40min内18种氨基酸达到良好分离见图3，图4。
图318种氨基酸标准溶液的色谱图
图4黄酒的色谱图
2.2流动相pH值对分离的影响
流动相pH值对氨基酸分离度较大的影响，固定缓冲盐的浓度和三乙胺的浓度，pH流动相，主要研究了对Gly-His，Arg-Thr，Thr-Aba,Aba-Ala,Ile-Leu,等5组较难分离氨基酸分离度的影响，由图5可以看出Thr-Aba和Gly-His随pH提高，分离度提高，Aba-Ala和Ile-Leu随pH的提高分离变化较小，Arg-Thr虽pH的升高，分离度迅速降低，因此本研究选择pH为的流动相。
图5流动相pH值对氨基酸分离的影响
（1）Gly-His，
（2）Arg-Thr，（3）Thr-Aba，（4）Aba-Ala，（5）Ile-Leu。
3标准曲线、相关系数及检出限
将18种氨基酸混合标准液，稀释配置成5个梯度混标，以紫外检测器检测，以峰面积y对浓度x（mmol/L）进行回归处理，计算线性回归方程。
结果表明：
18种氨基酸的浓度在0.125～mmol/L时其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数≥0.99。
表1线性关系分析及相关系数
序号
氨基酸
线性方程
相关系数
检测限（μM）
1
Asp
y=2862x+2269
0.134
2
Glu
y=2716x+33281
3
Ser
y=2978x-2906
4
Gly
y=2889x-2806
5
His
y=2989x-4843
6
Arg
y=2680x-25344
7
Thr
y=2084x+14428
8
Aba
y=3388x+72428
9
Ala
y=3084x+12428
10
Pro
y=3469x-7540
11
Tyr
y=4446x+63483
12
Val
y=4052x+43483
13
Met
y=3692x-23754
14
Ile
y=3642x-2965
15
Leu
y=5575x-18680
16
Phe
y=3859x+10343
17
Trp
y=3125x-39380
18
Lys
y=8059x+464343
4样品加标回收率
在黄酒样品中加入3种不同浓度氨基酸标样后衍生，根据氨基酸对照品的加入量计算回收率，测定结果见表2，平均回收率在83.52~%之间。
表2氨基酸的加标回收率（n=3）
氨基酸
名称
黄酒加标（mM）
回收率（%）
平均回收率（%）
Asp
Glu
Ser
Gly
His
Arg
Thr
Aba
Ala
Pro
Try
Val
Met
Ile
Leu
Phe
Trp
10
Lys
5方法的精密度试验
（1）将同一标样连续进样8次，得到18种氨基酸峰面积的RSD在2％～6％
（2）对同一黄酒样品平行衍生六次进行测定，保留时间的RSD2%~2%之间，峰面积的RSD在1.17%~4.92%见表3，说明该方法日内测定结果重复性，精密度较高。
表3方法重复性试验
氨基酸
保留时间
RSD（%）
峰面积
RSD（%）
氨基酸
保留时间
RSD（%）
峰面积
RSD（%）
Asp
Pro
Glu
Tyr
Ser
Val
Gly
Met
His
-
-
Ile
Arg
0.20
Leu
Thr
Phe
Aba
Trp
Ala
Lys
注：
样品中未测定出His
6样品的稳定性试验
采用同一标品进行衍生后，室温放置8h,24h,36h,48h,64h等不同时间，在相同的色谱条件下测定，进行保留时间和峰面积比较，由表4可以看出保留时间的RSD%~%之间，峰面积在%%，说明衍生物具有较好的稳定性。
表4氨基酸衍生物稳定性试验
氨基酸
保留时间
RSD（%）
峰面积
RSD（%）
氨基酸
保留时间
RSD（%）
峰面积
RSD（%）
Asp
Pro
Glu
Tyr
Ser
Val
Gly
Met
His
Ile
Arg
Leu
5.27
Thr
Phe
Aba
Trp
Ala
Lys
六、本方法的验证结果
本方法经过中国食品发酵工业研究院、上海金枫酒业股份有限公司、浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司等6家实验室的进行了方法验证，黄酒样品稀释10倍后，加入不同浓度的18种氨基酸，制备了1#，2#，3#，4#，5#对照样品，验证结果见表5，由表可见实验室间的再现性相对标准偏差RSD基本小于10%。
表56个实验室验证实验统计表（mg/L）
验证单位
Asp
Glu
1#
2#
3#
4#
5#
1#
2#
3#
4#
5#
Lab1
25.62
41.20
48.20
52.15
69.41
12.00
30.82
39.65
46.46
58.95
24.45
40.32
45.34
53.45
68.66
13.82
31.34
38.25
46.34
60.24
Lab2
24.80
41.83
48.00
52.61
69.20
11.09
30.95
40.31
46.97
56.90
25.44
42.15
46.33
53.04
72.77
13.18
34.28
44.02
49.78
66.28
Lab3
26.01
44.27
52.64
57.56
71.42
15.04
35.90
42.41
51.24
68.25
27.14
44.22
51.01
58.62
69.49
16.27
36.28
45.71
52.95
70.66
Lab4
24.56
43.75
48.33
54.64
69.15
10.36
30.58
40.45
49.63
58.90
23.83
40.32
47.93
52.48
63.08
10.14
32.47
39.77
44.83
54.43
Lab5
26.83
55.99
64.80
84.47
91.03
12.28
34.99
40.91
57.25
63.28
29.22
57.19
65.40
84.59
93.18
13.25
35.24
40.62
57.59
69.36
Lab6
24.18
41.05
49.58
57.64
64.45
11.65
30.49
37.09
43.99
59.75
24.25
42.34
48.98
58.98
66.76
12.78
32.45
39.87
45.23
62.23
平均值
25.53
44.55
51.38
60.02
72.38
12.65
32.98
40.76
49.35
62.44
RSD%
6.15
13.00
13.02
19.53
13.27
14.37
6.73
5.78
9.39
8.31
验证单位
Ser
Gly
1#
2#
3#
4#
5#
1#
2#
3#
4#
5#
Lab1
20.99
39.98
48.23
58.04
70.83
49.36
68.17
79.41
86.66
97.71
19.25
37.58
48.68
57.45
68.45
47.25
65.89
76.25
85.76
95.54
Lab2
18.40
40.02
46.44
51.65
66.24
45.59
67.88
75.66
83.15
96.48
18.80
39.17
43.27
51.14
65.52
46.81
66.69
74.91
85.10
92.83
Lab3
20.66
40.35
49.06
57.87
69.92
46.61
67.93
76.15
89.89
97.06
21.02
40.80
50.35
60.52
71.78
48.54
69.37
79.45
84.29
101.87
Lab4
18.93
38.33
44.01
55.77
70.44
44.91
63.73
74.88
85.49
95.26
19.18
37.33
43.27
52.68
67.49
46.30
65.22
73.90
86.36
94.04
Lab5
21.99
43.47
52.84
64.03
73.41
47.11
70.08
78.26
89.42
98.47
22.15
43.70
52.94
64.42
75.15
47.32
70.25
77.97
89.86
101.94
Lab6
19.28
38.13
44.08
51.47
66.67
45.22
66.21
76.53
87.28
96.00
21.02
39.77
46.74
53.04
68.88
46.88
67.34
77.34
88.21
98.23
平均值
20.14
39.89
47.49
56.51
69.56
46.82
67.40
76.73
86.79
97.12
RSD%
6.48
5.15
7.29
8.36
4.23
2.73
2.92
2.34
2.54
2.86
验证单位
His
Arg
1#
2#
3#
4#
5#
1#
2#
3#
4#
5#
Lab1
3.36
20.77
33.83
43.82
51.68
27.90
49.64
57.72
67.75
78.19
3.23
23.54
35.24
44.35
52.35
26.25
46.35
55.68
65.25
76.25
Lab2
2.20
21.87
33.74
43.91
46.59
25.04
42.92
55.12
62.34
69.51
2.80
22.05
34.84
44.96
49.79
25.80
49.27
57.55
61.35
73.04
Lab3
6.00
25.40
32.68
43.46
54.96
29.06
49.22
57.54
66.20
78.36
6.40
25.56
34.98
45.00
56.16
29.78
49.29
58.90
68.48
80.35
Lab4
3.97
22.93
32.43
45.87
53.22
22.99
42.50
53.44
62.89
70.01
4.48
25.35
37.55
41.95
56.38
24.14
43.13
52.60
61.62
69.02
Lab5
6.72
26.41
35.83
46.08
54.98
28.83
50.50
59.46
70.32
79.54
6.64
26.61
35.91
46.31
56.48
28.94
50.69
59.31
70.49
81.55
Lab6
2.03
21.04
28.85
41.77
45.74
23.45
42.18
55.49
61.01
69.16
2.30
22.55
29.88
42.02
49.44
24.33
44.59
56.33
63.88
71.22
平均值
4.18
23.67
33.81
44.12
52.31
26.38
46.69
56.60
65.13
74.68
RSD%
43.56
8.87
7.47
3.64
7.17
9.22
7.32
3.92
5.34
6.47
验证单位
Thr
Aba
1#
2#
3#
4#
5#
1#
2#
3#
4#
5#
Lab1
10.70
31.51
43.51
51.77
57.73
10.33
29.22
40.04
46.91
58.66
9.25
30.55
41.56
50.45
56.21
9.68
28.56
39.02
44.25
56.24
Lab2
9.98
29.11
39.31
50.07
55.30
9.25
25.71
36.85
45.00
53.55
9.86
30.13
40.29
49.55
58.59
10.43
29.48
38.55
48.77
59.34
Lab3
9.67
30.00
39.48
51.28
59.21
12.08
29.92
38.10
46.82
57.58
10.25
30.64
41.26
48.99
61.98
12.17
29.76
38.56
47.85
58.86
Lab4
9.44
29.23
37.67
42.50
57.38
9.24
26.34
33.57
46.64
52.42
9.78
30.29
40.45
42.98
55.53
9.32
27.06
36.50
42.92
52.68
Lab5
12.37
33.38
42.16
52.70
60.81
13.11
31.96
40.74
50.80
59.24
12.87
33.03
41.78
52.97
64.84
13.13
32.10
40.66
50.95
60.64
Lab6
9.56
29.59
39.40
50.10
59.43
9.20
24.70
39.59
42.27
55.15
10.33
30.
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