RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响doc.docx
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RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响doc
·中文论著摘要·
RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响
南方医科大学刘一柏
目的
构建针对靶向基因FUBP1（farupstreamelementbindingprotein1，FUBP1）的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi，转染胃癌SGC-7901细胞，探讨应用RNA干扰技术抑制FUBP1基因的表达对人胃癌细胞增殖、细胞迁移、细胞周期和凋亡等生物学功能的影响，初步评价FUBP1基因沉默在胃癌基因治疗中的应用价值。
方法
构建三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体LV-FUBP1-RNAi及阴性对照序列的慢病毒载体Negative-RNAi，通过慢病毒转染预实验选择合适的感染复数分别转染胃癌细胞SGC7901后利用荧光定量逆转录-聚合酶链反应（QRT-PCR）检测FUBP1在mRNA的表达水平，筛选出有效的RNA干扰序列用于后续实验。
将实验分为FUBP1-RNAi组、Negative-RNAi阴性对照组（标记为NC）和空白对照组（标记为CON），应用QRT-PCR及蛋白免疫印迹（Westernblot）检测FUBP1在mRNA和蛋白质水平的表达量。
应用CCK-8法检测各组细胞增殖、Transwell及划痕实验检测各组细胞迁移能力、流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况及细胞凋亡。
结果
成功构建了三组不同RNA干扰序列的慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD1、FUBP1-RNAi-KD2、FUBP1-RNAi-KD3；通过慢病毒转染预实验选择MOI=30的感染复数成功转染各组胃癌SGC7901细胞并筛选出有效的RNA干扰序列FUBP1-RNAi-KD2（相对于NC组FUBP1抑制效率高达70.4%）；QRT-PCR结果显示：
相对于NC组，RNA干扰组（FUBP1-RNAi-KD2）FUBP1mRNA的表达量明显下调，抑制率达70.4%（P<0.05）；Westernblot结果显示：
相对于NC组，RNA干扰组FUBP1蛋白质的表达量明显下调，抑制率达74.4%（P<0.05）；CCK-8结果显示：
相对于NC组和CON组，RNA干扰组连续5天胃癌细胞增殖倍数降低（P<0.05）；PI-FACS细胞周期检测结果显示：
相对于NC组和CON组，RNA干扰组S期细胞比例明显升高（达60.74%，P<0.05），G0/G1期和G2/M期细胞比例分别降低达30.48%（P<0.05）、8.78%（P<0.05）；细胞凋亡、Transwell及划痕实验结果显示：
通过RNA干扰技术沉默FUBP1基因后对胃癌SGC7901细胞凋亡和迁移无明显影响（P>0.05）。
结论
慢病毒载体FUBP1-RNAi-KD2介导的FUBP1基因沉默能够有效的抑制FUBP1在人胃癌SGC7901细胞系内mRNA和蛋白质水平的表达量；通过RNA干扰技术沉默FUBP1基因的表达能够抑制胃癌细胞SGC7901的增殖，影响细胞周期的分布，将细胞周期阻滞在S期，抑制细胞生长；但是对细胞凋亡及迁移能力无明显影响；通过RNA干扰技术特异而有效的沉默FUBP1基因在胃癌的基因治疗中具有一定的价值。
关键词
RNA干扰；慢病毒转染；远端上游元件结合蛋白1；胃癌；基因治疗
·英文论著摘要·
TheeffectofRNAinterferenceinhibitingFUBP1geneexpressiononthebiologicalfunctionofhumangastriccancercelllineSGC7901
Objective
ThispaperaimedtoconstructFUBP1-RNAilentiviralvectortotransfectintohumangastriccancercelllineSGC7901andinvestigatetheeffectofinhibitingFUBP1geneexpressiononthebiologicalfunctionofgastriccancercellproliferation,metastasis,cellcycleandapoptosis.Throughthisstudy,wecanevaluatethevalueofFUBP1genesilencinginthetreatmentofgastriccancer.
Methods
TodesignFUBP1-RNAilentiviralvectorwiththreedifferentkindsofRNAinterferencesequencesandNegative-RNAilentiviralvectorwithnegativecontrolsequence.ThenchoicethereasonableMOIviapreliminaryexperimentoflentiviraltransfectiontotransfectintohumangastriccancerSGC7901.Thequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction（QRT-PCR）wasusedtodetectthemRNAexpressionlevelofFUBP1toselecttheeffectiveRNAinterferencesequencewhichwasusedinthefollowingexperiment.Wedividetheexperimentintothreegroups,whichwereFUBP1-RNAinterferencegroup,Negative-RNAicontrolgroupandblankcontrolgroup.TheQRT-RCRandWesternblottingwereusedtodetectthemRNAandproteinexpressionlevelofFUBP1.CCK-8wasusedtodetectcellproliferationofeachgroup.TranswellandScratchTestwereusedtodetecttheacticityofcellmigration.PI-FACSwereusedtodetectCellcycledistributionandapoptosisofeachgroup.
Results
LentiviralvectorwiththreedifferentkindsofRNAinterferencesequencesweresuccessfullyconstructed,includingFUBP1-RNAi-KD1,FUBP1-RNAi-KD2andFUBP1-RNAi-KD3.ThenchoiceMOI=30viapreliminaryexperimentoflentiviraltransfectiontotransfectintohumangastriccancerSGC7901andselectFUBP1-RNAi-KD2astheeffectiveRNAinterferencesequence（inhibitionrateofFUBP1wasupto70.4%WhichcomparedwithNegative-RNAigroup）.ComparedwithNegative-RNAigroup,RT-PCRandWesternblottingresultsshowedthatthemRNAandproteinexpressionlevelofFUBP1geneinFUBP1-RNAi-KD2groupwererespectivelyreducedby77.6%（P<0.05）and74.4%（P<0.05）.
TheCCK-8testshowedthatgastriccancercellproliferationfoldinfivedaysofFUBP1-RNAi-KD2groupweredecreased（P<0.05）Whichcomparedwithnegativecontrolgroupandblackcontrolgroup.FlowcytometryresultsshowedthatthenumberofgastriccancercellinSphaseofFUBP1-RNAi-KD2groupwasupto60.74%（P<0.05）WhichcomparedwithNegative-RNAigroupandblackcontrolgroup,whilethenumberofgastriccancercellinG0/G1phaseandG2/Mphasewererespectivelydecreasedto30.48%（P<0.05）and8.78%（P<0.05）.Onthecontrary,silencingofFUBP1geneviaRNAinterferencetechnologyhadnosignificanteffectonapoptosisandmigrationofgastriccancerSGC7901cells（P>0.05）.
Conclusions
SilencingofFUBP1geneviaFUBP1-RNAilentiviralvectorcaneffectivelysuppressthemRNAandproteinexpressionlevelofFUBP1ingastriccancercellSGC7901.SilencingofFUBP1genecaneffectivelyinhibitgastriccancercellproliferation,affectdistributionofcellcycle,arrestcellcycleinSphasetosuppresscellgrowth.Whilethereisonsignificanteffectonapoptosisandmigration.ThespecificandeffectivesilencingofFUBP1geneviaRNAinterferencetechniquehasacertainvalueinthegenetherapyofgastriccancer.
Keywords
RNAinterference;lentiviraltransfection;FUBP1;gastriccancer;genetherapy
·英文缩略语表·
英文缩写
英文全称
中文译名
FUBP
Farupstreamelementbindingprotein
远端上游元件结合蛋白
RNA
Ribonucleicacid
核糖核酸
RNAi
RNAinterference
RNA干扰
dsRNA
DoublestrandedRNA
双链RNA
siRNA
smallinterferingRNA
小干扰RNA
RISC
RNAindecedsilencingcomplex
RNA诱导的沉默复合物
FUSE
Farupstreamelement
远端上游元件
TFIIH
Transcription/repairfactorIIH
转录修复因子IIH
FBS
Fetalbovineserum
胎牛血清
PBS
Phosphatebuffersaline
磷酸盐缓冲液
DMSO
Dimethylsulfoxide
二甲基亚砜
RT-PCR
Reversetranscription-polymerasechainreaction
逆转录-聚合酶链反应
WB
WesternBlot
免疫印迹法
Rnase
Ribonuclease
核糖核酸酶
DEPC
Diethypyrocarbonate
焦炭酸二乙酯
PAGE
Polyacrylamidegelelectrophoresis
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS
Sodiumdodecylsulfonate
十二烷基磺酸钠
TBST
Tris-BufferedSalineTween-20
缓冲液
PVDF
Polyvinylidenefluoride
聚偏二氟乙烯
ECL
Electrochemiluminescence
电化学发光
MOI
Multiplicityofinfection
感染复数
OD
Opticaldensity
光密度
·论文·
RNA干扰抑制FUBP1基因表达对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响
前言
胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，尤其是在发展中国家，具有恶性程度高、发展迅速、预后差等特征。
在常见癌症中，胃癌的发病率居第四位，致死率居第三位[]。
根据2012年全球癌症统计数据显示，胃癌的新发病例数接近100万，其中超过70万病例的患者发生死亡，数据显示几乎一半以上的胃癌患者来自中国[]。
随着早期胃癌诊疗技术和水平的不断发展提高，胃癌的发病率和死亡率都有所下降，但是进展期患者的预后仍然比较差，胃癌患者的五年生存率仍然比较低，而传统的治疗方法已不能满足胃癌发展的现状，因此，寻找胃癌基因治疗的方法成为目前研究的热题。
RNA干扰是真核生物体内一种基因沉默现象，具有高度的保守性和特异性。
首先由Guo和Kemphues[]等在1995年利用反义RNA抑制秀丽隐杆线虫基因表达的过程中发现并证实反义RNA和正义RNA均能有效抑制C.eleganspar-1基因的表达，但是这种现象产生的原因并未得到解释。
随后，Fire等人在1988年通过研究发现dsRNA能够识别内源性mRNA的特异性序列，诱导mRNA的降解从而抑制特定基因的表达，并且比单链反义RNA或正义RNA抑制基因表达的作用更强，后来这种现象被称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）[]。
RNA干扰机制可以简单的概括如下，由于外源性基因的入侵诱导体内细胞产生长双链RNA，这些长dsRNA在核酸内切酶Dicer作用下被分割成许多小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA），siRNA长约21-23个核苷酸片段，之后siRNA再与一些核酸酶复合物结合，形成RNA诱导的沉默复合物（RNAindecedsilencingcomplex,RISC），活化后的RISC能够与目的mRNA特异性结合，从而抑制目的基因的表达[]。
近几十年来随着分子生物学技术和遗传学的不断发展，人们逐渐认识到RNA干扰作为一种强大而有效的基因沉默技术能够特异性的抑制肿瘤相关致癌基因的表达而被广泛应用于胃癌的研究中。
远端上游元件结合蛋白（FUBPs）是由FUBP1、FUBP2和FUBP3三种调节蛋白所组成的DNA结合蛋白家族[]，而c-myc作为原癌基因通过编码一种重要的转录因子家族参与细胞生长、增殖、分化及凋亡。
1990年，Avigan[]等研究发现在未分化的白血病细胞内，FUBP1通过与远端上游元件FUSE结合调控c-myc基因的转录表达，首次证实FUBP1是一种DNA结合蛋白。
随后一些研究表明，FUBP1在多种恶性肿瘤中呈表达上调，与c-myc基因的表达呈正相关，影响c-myc基因所介导的细胞生长、增殖、分化及凋亡，从而导致多种癌症的发生、发展[]。
本课题应用RNA干扰技术使FUBP1基因表达沉默，通过体外细胞实验观察FUBP1沉默后对人胃癌细胞系SGC7901生物学功能的影响，初步探讨RNA干扰技术在胃癌基因治疗中的应用价值。
实验材料与方法
一、实验材料
（一）实验对象
人胃腺癌细胞株SGC-7901（山东省肿瘤医院基础实验中心提供）
（二）实验试剂与仪器
1、细胞培养及转染
（1）主要试剂与溶液
RPMI1640基础培养基
美国Gibco公司
胎牛血清（FBS）
美国Gibco公司
磷酸盐缓冲液（PBS）
北京鼎国昌盛生物技术有限公司
青/链霉素混合液
美国Gibco公司
0.25%胰酶
美国Gibco公司
二甲基亚砜（DMSO）
shRNA慢病毒载体
Polybrene原液
感染增强液（Eni.S.）
美国Gibco公司
上海吉凯基因科技有限公司
上海吉凯基因科技有限公司
上海吉凯基因科技有限公司
（2）主要试剂的配置
①15%RPMI1640完全培养基
取1640培养基420ml，加入FBS75ml，加入5ml双抗（青/链霉素混合液），置于4℃冰箱保存备用。
②细胞冻存液
按照DMSO：
1640培养基：
FBS的比例为1：
7：
2进行配制，冻存细胞时现用现配。
③Polybrene稀释液
Polybrene原液（10mg/ml）用RPMI1640基础培养基稀释200倍，至终浓度为50ug/ml，置于-20℃冰箱保存备用。
（3）主要仪器设备
Ⅱ级生物安全柜
新加坡ESCO公司
二氧化碳培养箱
日本SANYO公司
微量移液器
德国Eppendorff公司
倒置显微镜
倒置荧光显微镜
日本Olympus公司
日本Olympus公司
BY-R18医用低速离心机
BIO-RAD公司
冷藏冷冻箱（4℃、-20℃）
青岛海尔股份有限公司
超低温冰箱（-80℃）
日本SANYO公司
电热恒温水槽
细胞培养板
细胞计数板
山东潍坊精密医疗器械有限公司
美国Costar公司
美国Coster公司
2、RT-PCR
（1）主要溶液与试剂
Trizol试剂
美国Invitrogenlifetechnologies
DEPC处理水（无RNase）
大连宝生物工程有限公司
氯仿
上海试剂一厂
异丙醇
上海试剂一厂
无水乙醇
上海试剂一厂
反转录试剂盒
日本TaKaRa公司
荧光定量PCR试剂盒
日本TaKaRa公司
PCR引物合成
ThermoFisherScientific
（2）主要试剂配制的方法
75%乙醇：
按照无水乙醇：
DEPC处理水=3:
1的比例，置于常温保存备用。
（3）主要设备仪器
微量反应管
美国Axygen公司
微量移液器
德国Eppendorff公司
SIGMA3K30超速冷冻离心机
德国Sigma-Aldrich公司
NANODROP2000分光光度计
ThermoFisherScientific
MyCycler型PCR仪（BIOER）
美国伯乐公司
LightCycler480Ⅱ型PCR扩增仪
德国RocheDiagnostics公司
超低温冰箱（-80℃）
日本SANYO公司
3、Westernblot
（1）主要溶液与试剂
兔抗人FUBP1单克隆抗体
英国Abcam公司
NP-40lysisbuffer
BCA定量试剂盒
5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液
美国Amresco公司
碧云天生物研究所
上海生工生物工程有限公司
30%PAGE（聚丙烯酰胺）
APS（过硫酸铵）
TEMED（四甲基乙二胺）
10×TBST
济南军区总医院检验科提供
美国Amresco公司
济南军区总医院检验科提供
北京索莱宝科技有限公司
β-actin
美国Epitomics公司
SDS
1.0mol/LTris（PH6.8）
1.5mol/LTris（PH8.8）
德国Sigma公司
济南军区总医院检验科提供
济南军区总医院检验科提供
蛋白质Marker
ThermoFisherScientific
PVDF膜
ECL-PLUS试剂盒
Millipore公司
瑞典Amersham公司
X线胶片显影粉
上海冠龙照相材料厂
医用X射线胶片
中国Kodak公司
（2）主要试剂配制的方法
①10%APS：
0.1gAPS+1ml去离子水溶解，置于4℃保存备用。
②封闭液：
2.5g脱脂奶粉+50ml1×TBST溶解，置于4℃保存备用。
③10ml10%分离胶：
去离子水4ml+30%PAGE3.3ml+1.5mol/LTris（PH8.8）2.5ml+10%SDS100µl+10%APS100µl+TEMED4µl，混匀备用。
④5ml5%浓缩胶：
去离子水3.4ml+30%PAGE0.83ml+1.0mol/LTris（PH6.8）0.63ml+10%SDS50µl+10%APS50µl+TEMED5µl，混匀备用。
（3）主要仪器、设备
5417R台式冷冻高速离心机
德国Eppendorff公司
SDS-PAGE蛋白电泳仪
上海天能科技有限公司
蛋白转膜仪
上海天能科技有限公司
电热恒温干燥箱
山东省潍坊医疗器械厂
脱色摇床
兴化仪器厂
显影仪
美国AlphaInnotech公司
4、细胞功能学实验
（1）主要溶液与试剂
CCK-8试剂
德国Sigma公司
PI（碘化丙啶）
德国Sigma公司
RNaseA
Fementas公司
凋亡试剂盒
美国eBioscience公司
Transwell试剂盒
GIEMSA染色液
美国Corning公司
德国Sigma公司
（2）主要仪器、设备
酶标仪
ThermoFisherScientific
流式细胞仪
划痕仪
倒置显微镜
倒置荧光显微镜
Millipore公司
VPscientific
日本Olympus公司
日本Olympus公司
二、实验方法
（一）RNA干扰慢病毒载体的构建与包装
针对靶基因FUBP1的RNA干扰慢病毒载体由上海吉凯基因科技有限公司协助设计、构建、包装及测序。
慢病毒载体名称为GV248，元件序列为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，设计的siRNA干扰序列如表1所示；设计的DNAoligo序列如表2所示；慢病毒滴度如表3所示：
表1FUBP1-RNAi序列
VirusNumber
TargetSeq
FUBP1-RNAi-KD1
TGAGTATTATAGACAACAA
FUBP1-RNAi-KD
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