实验性毕业论文范例终审稿.docx

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实验性毕业论文范例终审稿

文稿归稿存档编号：

[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-MG129]

实验性毕业论文范例

学号:

泰山医学院毕业设计（论文）

题目：

蜂胶黄酮抗H2O2诱导PC12细胞

凋亡机制的研究

院（部）系

药学院

所学专业

药学

年级、班级

完成人姓名

指导教师姓名

专业技术职称

2013年6月18日

论文原创性保证书

我保证所提交的论文都是自己独立完成，如有抄袭、剽窃、雷同等现象，愿承担相应后果，接受学校的处理。

专业：

班级：

签名：

20年月日

摘要

目的观察蜂胶黄酮对过氧化氢（H2O2）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）凋亡的影响及机制。

方法培养PC12细胞，取对数生长期细胞分为五组，空白对照组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组，剂量分别为200mg/L、100mg/L、50mg/L.药物预处理2h后，孵育H2O2（140μmol/L）24h诱导过氧化损伤。

TUNEL试剂盒检测原位细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞内活性氧水平以及细胞周期，ELISA检测细胞内Caspase-3蛋白含量。

结果TUNEL细胞凋亡染色显示,H2O2组与空白对照组比较染色明显加深,而蜂胶黄酮组染色明显变浅，说明蜂胶黄酮能对抗H2O2诱导细胞凋亡；周期结果显示H2O2组处于G0/G1细胞明显增多，而处于G2/M、S期细胞明显减少，细胞增殖降低，而蜂胶黄酮增加S期细胞促进细胞增殖；与空白对照组相比H2O2组活性氧水平、细胞内Caspase-3含量明显增高，而蜂胶黄酮各剂量组活性氧水平降低，Caspase-3含量减少。

结论蜂胶黄酮对H2O2诱发PC12神经细胞凋亡有显着的抑制作用，其机制可能其影响细胞周期、清除氧自由基、降低凋亡因子Caspase-3有关。

关键词蜂胶黄酮；PC12细胞；H2O2;Caspase-3；细胞凋亡

Abstract

Objective:

Toobservetheprotectionofpropolisflavonoidsonratwithinjuriedpheochromocytomacells（PC12）inducedby?

hydrogenperoxide（H2O2）

andtoexploreitspossiblemechanism.

Methods:

Culture?

PC12cells,thecellsinthelogarithmicgrowthphaseweredividedintofivegroups,blankcontrolgroup,modelgroup,propolisflavoneofhigh,mediumandlowdosegroup,thedoseof200mg/L,100mg/L,50mg/L.After2h0fPharmacologicalpreconditioning,thecellswereincubatedwithH2O2（140μmol/L）for24htoinduceoxidativedamage.TUNELKitisusedfordeterminingCellapoptosis,FlowcytometrywasusedtodetecttheintracellularROSlevelandcellcycle,ELISAisusedfordeterminingtheconcentrationofproteinCaspase-3incells.

Results:

ApoptosisofTUNELcellsstaining,H2O2groupcomparedwiththecontrolgroup,stainingwasdeepened,andthepropolisflavonegroupwassignificantlylighter,thatpropolisflavonoidscanantagonizetheapoptosisinducedbyH2O2CycleshowedthatH2O2groupinG0/G1cellswereincreased,andintheG2/M,Sphasecellsdecreasedsignificantly,reducedcellproliferation,andpropolisflavonoidsincreasedSphasecellspromotingcellproliferation;comparedwiththeblankcontrolgroup,caspase-3inH2O2group,thelevelsofreactiveoxygenspeciesincellsincreasedsignificantly,whilethepropolisflavoneinalldosegroupsdecreasethelevelsofreactiveoxygenspecies,reducedcaspase-3content.

Conclusion:

PropolisflavonoidsonH2O2-inducedPC12cellsdamageasignificantprotectiveeffect,Themechanismmaybeitseffectoncellcycle,scavengingoxygenfreeradicals,decreasetheapoptosisrelatedfactorcaspase-3.

Keywords:

Propolis;flavonoids;PC12cells;H2O2;apoptosis

正文………………………………………………………………………………………………01

1前言…………………………………………………………………………………………01

2仪器与试剂…………………………………………………………………………………01

3实验方法……………………………………………………………………………………02

3.1蜂胶总黄酮的提取与含量测定………………………………………………………02

3.2PC12细胞的培养及分组给药…………………………………………………………02

3.3TUNEL细胞凋亡原位检测………………………………………………………………02

3.4流式细胞仪检测细胞周期……………………………………………………………02

3.5流式细胞仪检测细胞内活性氧水平…………………………………………………03

3.6ELISA试剂盒检测细胞内Caspase-3蛋白含量……………………………………03

4实验结果……………………………………………………………………………………03

4.1TUNEL细胞凋亡原位检测……………………………………………………………03

4.2流式细胞仪检测细胞周期……………………………………………………………04

4.3流式细胞仪检测细胞活性氧水平……………………………………………………05

4.4ELISA检测细胞内Caspase-3蛋白含量……………………………………………06

5讨论………………………………………………………………………………………07

6结论………………………………………………………………………………………08

参考文献………………………………………………………………………………………09

文献综述………………………………………………………………………………………10

致谢……………………………………………………………………………………………15

蜂胶黄酮抗H2O2诱导PC12细胞凋亡机制的研究

学生：

***指导教师：

***

（泰山医学院药学院，泰安271016）

1前言

老年性痴呆（Alzheimer′sdisease,AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力受损为主的中枢神经系统退行性疾病。

该病严重威胁中老年人的健康，对社会和经济造成巨大压力。

因此，研究AD发病机制及寻求有效药物防治已成为目前世界医药界的热点和难点。

氧化应激损伤神经元在神经退行性病变中具有重要的病因学意义。

研究表明老年性痴呆与氧化应激损伤密切相关。

H2O2是和氧化应激反应密切相关的活性氧之一，它参与了许多神经系统疾病的发病，与多种疾病如自身免疫病，肿瘤，炎症以及细胞凋亡的发生有关，长期用作神经细胞氧化损伤的诱导剂。

蜂胶（Propolis）被誉为“紫色黄金”，是蜜蜂从植物新生枝嫩芽或花蕾处采集的树脂类物质，掺入其舌腺及蜡腺分泌物，经蜜蜂反复混合而成的胶状物质。

蜂胶富含多种具有药用价值的活性成分，其中主要是黄酮类化合物。

本课题组前期研究发现蜂胶醇提物对东莨菪碱、亚硝酸钠、三氯化铝诱导的小鼠学习记忆障碍模型具有明显保护作用，对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠学习记忆功能也有保护作用，其作用机制可能与其对抗小鼠体内过氧化反应有关[1-2]。

通过MTT、流式细胞术等前期研究也发现蜂胶黄酮能有效的保护H2O2诱导的PC12细胞损伤，提高细胞存活率，抑制细胞凋亡，为进一步研究其抗痴呆作用奠定了基础。

PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，在细胞形态，结构，功能上与多巴胺神经元有许多相似特征，能够表达多巴胺转运体，是体外神经细胞损伤及保护作用研究使用最为广泛的细胞系。

本实验拟培养大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞株，以H2O2诱导神经细胞损伤，蜂胶黄酮干预，TUNEL染色观察蜂胶黄酮的抗凋亡作用，并通过检测细胞周期、活性氧及Caspase-3对蜂胶黄酮的抗凋亡机制进行研究。

2仪器与试剂

2.1材料和试剂

蜂胶原胶，购自山东省实验种蜂场；PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株），购自南京凯基生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,购自于索莱宝；完全DMEM培养基、新生牛血清（NBS），购自于南京凯基生物技术有限公司；TUNEL细胞原位凋亡测定试剂盒、活性氧试剂盒及细胞周期检测试剂盒（购自于南京凯基生物技术有限公司）、ELISA试剂盒（蓝基生物技术有限公司）。

其它试剂均为分析纯。

2.2仪器

二氧化碳孵箱（Thermo）；单人双面超净工作台（SW-CJ）；倒置式生物显微镜（XDS-1B）；酶标仪（Infinitef200）；流式细胞仪（FACSCalibur）；高速离心机（TGL-16G）；数控超声波清洗器（KQ-600DB）；旋转蒸发仪（RE-52A上海亚荣生化仪器厂）、恒温干燥箱（施都宝Bao-80A）、恒温水浴锅（HW.SY21-K）、超低温冰箱（Thermo）。

3.实验方法

3.1蜂胶黄酮的提取与含量测定

取蜂胶50g粉碎，用85%乙醇浸泡4天，配料比蜂胶（g）：

85%乙醇（ml）为1:

30，在30℃条件下超声50min后，旋转蒸发仪蒸发成浸膏状，冰箱4℃内保存备用。

以芦丁为标准品，得标准曲线y=13.656x+0.0404，R2=0.9969，计算蜂胶中黄酮含量为：

4.86mg/g。

3.2PC12细胞的培养及分组给药

在37℃，恒湿的5%CO2细胞培养箱内培养PC12细胞，完全培养基为高糖DMEM培养基中含10%新生小牛血清，加入100μg/ml链霉素和100μg/ml氨苄青霉素。

细胞为上皮样贴壁生长，每2～3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

将细胞分为五组：

空白对照组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组。

加药前先将蜂胶黄酮溶于DMSO中，再用完全培养基稀释，使药物终浓度为200mg/L、100mg/L、50mg/L，DMSO终体积为1‰，空白对照组及模型组加入含1‰DMSO完全培养基。

药物预处理2h后，再加入H2O2培养24h，24h后检测各项指标。

3.3TUNEL细胞凋亡原位试剂盒检测

细胞以2×105个/孔接种量接种于24孔带爬片的培养板上，药物分组处理后，取出爬片，自然晒干后用4%多聚甲醛室温固定20-30min，PBS漂洗三次，每次5min，1%TritionX-100通透5min，PBS漂洗，3%H2O2封闭10min，PBS漂洗吸干，每个样本滴加50μlTdT酶反应液，加盖玻片放入温盒，37℃避光反应60min，PBS漂洗吸干，加5oμlStreptavidin-hrp工作液，加盖玻片放入温盒，37℃避光反应30min，PBS漂洗吸干，加50μlDAB工作液，反应5min，显微镜下观察，拍照。

3.4流式细胞仪检测细胞周期

细胞以1×106个/孔的接种量接种于6孔培养板上。

药物分组处理后，加入不含EDTA的胰酶消化，加培养基终止消化，PBS冲洗2次，加入2ml-20℃预处理12h的70%乙醇固定24小时后，离心5min（小于1000r/min），弃去乙醇，每管加入PBS洗两遍，将细胞混悬后离心5min（小于1000r/min），按照1:

50的RNaseA和PBS，37℃恒温水浴锅水解30min，过20目细胞筛于流式管内，加入5μlPI染色10-15min，流式细胞仪测细胞周期。

通常用细胞增殖指数PI（proliferationindex）作为衡量细胞增殖的指标，PI即指处于DNA合成期及有丝分裂期的细胞在全部细胞中所占比例，公式表示为:

PI=[（S+G2/M）/（G0/G1+S+G/M）]*100%

3.5流式细胞仪检测细胞内活性氧

细胞以1×106个/孔接种量接种于6孔培养板上，药物分组处理后，加入不含EDTA的胰酶消化，加培养基终止消化，提取细胞，PBS离心冲洗2次，收集于流式管中，离心5min（1000r/min），按照1:

1000有用无血清的培养基稀释DCFH-DA，去PBS加入稀释好的DCFH-DA，37℃孵育20min，3-5min摇匀一次使充分安装探针，PBS洗三次，流式仪测细胞内氧自由基含量。

3.6Elisa检测Caspase-3

细胞以1×106/孔的接种量接种于6孔培养板上。

药物分组处理后，加入不含EDTA的胰酶消化，加培养基终止消化，提取细胞,PBS洗三次，加微量PBS反复冻融三次，每次半小时，使细胞离解，细胞液检测Caspase-3含量，取试剂盒至于室温平衡30min，再取酶标板按照标准品的次序加50μl于空白孔，空白孔加50μl样品，空白50μlPBS，在每个空加100μl酶标记溶液（不含空白孔），封口37℃培养箱孵育1h（时间可适当延长），反复充分洗5次，拍干，各加50μlA.B显色剂，避光37℃孵育15min，加50μl终止液，450nm检测OD值。

4实验结果

4.1蜂胶黄酮对细胞凋亡的影响

蜂胶黄酮作用2h后加入终浓度为140μmol/LH2O2作用24h后做TUNEL原位细胞凋亡染色，结果图1所示，蜂胶黄酮组颜色明显低于H2O2损伤组，说明蜂胶黄酮的凋亡率比模型组明显降低。

图1TUNEL染色观察蜂胶黄酮对H2O2损伤保护作用

（A空白对照组×200BH2O2损伤组×100C蜂胶黄酮保护组×100）

4.2流式细胞仪法检测细胞周期

与空白组比较，给予H2O2后，G0/G1期细胞明显增多，G2/M、S期细胞明显减少（P＜0.01）,细胞增殖降低，而蜂胶黄酮组G0/G1期细胞明显减少，G2/M、S期细胞明显增多，说明蜂胶黄酮具有促进细胞增殖（P＜0.05）。

其中蜂胶黄酮组S期细胞增加较多，说明蜂胶黄酮可能会促进细胞有丝分裂。

结果见表1、图2。

表1蜂胶黄酮对细胞周期的影响

分组

G0/G1

G2/M

S

增殖指数（PI）

空白对照组

47.62±3.2**

17.31±1.71**

35.07±2.51**

52.38±3.22**

模型组

（H2O2140μmol/L）

63.34±2.5

10.75±0.98

23.42±3.55

34.17±3.81

蜂胶高剂量组

（200mg/L）

54.61±1.62**

8.97±0.84

34.48±1.54**

45.39±1.61**

蜂胶中剂量组

（100mg/L）

57.85±1.23*

9.92±1.11

32.17±1.40*

41.15±1.23*

蜂胶低剂量组

（50mg/L）

61.83±1.00

8.89±1.79

29.29±1.04

38.18±2.42

图2蜂胶黄酮对细胞周期的影响

（A空白组B模型组C蜂胶黄酮高剂量组D蜂胶黄酮中剂量组E蜂胶黄酮低剂量组）

4.3蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响

与空白组比较，给予H2O2后，细胞内活性氧水平明显提高（P＜0.05）,而蜂胶黄酮各剂量组能明显降低细胞内活性氧水平（P＜0.01），且具有剂量依赖性，结果见表2、图3。

表2蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响（x±s,n=3）

组别

活性氧（mg/ml）

空白组

76.36±1.83**

模型组

（H2O2140μmol/L）

171.79±24.01

蜂胶黄酮高剂量组

（200mg/L）

82.75±14.73**

蜂胶黄酮中剂量组

（100mg/L）

103.27±15.20**

蜂胶黄酮低剂量组

（50mg/L）

151.96±26.70*

注：

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

图3蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响

（A空白组B模型组C蜂胶黄酮高剂量组D蜂胶黄酮中剂量组E蜂胶黄酮低剂量组）

4.4蜂胶黄酮对细胞内Caspase-3蛋白含量的影响

与空白组比较，给予H2O2后，细胞内Caspase-3蛋白含量明显提高（P＜0.05）,而蜂胶黄酮各剂量组能明显降低细胞内Caspase-3蛋白含量（P＜0.01），说明蜂胶黄酮可抑制凋亡因子的产生。

结果见表3。

表3蜂胶黄酮对细胞内Caspase-3蛋白含量的影响（x±s,n=3）

组别

Caspase-3（ng/ml）

空白组

7.74±3.09**

模型组

（H2O2140μmol/L）

34.63±1.19

蜂胶黄酮高剂量组

（200mg/L）

13.98±4.13**

蜂胶黄酮中剂量组

（100mg/L）

25.56±3.19**

蜂胶黄酮低剂量组

（50mg/L）

29.79±2.46*

注：

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

5讨论

PC12细胞在细胞生物学特征上和某些神经元在发生上都源自神经嵴细胞，因此在国内外广为用作研究神经细胞的模型[3]。

H2O2对细胞的损伤是通过在代谢过程中产生活性氧（ROS），ROS再引发一些氧化毒性产物的细胞毒作用损伤细胞[4]。

本实验通过H2O2损伤PC12细胞，蜂胶黄酮作用细胞，TUNEL细胞凋亡原位检测染色，流式细胞仪检测细胞活性氧水平和细胞周期，ELISA检测细胞内Caspase-3蛋白含量，结果显示，TUNEL细胞凋亡原位检测染色，蜂胶黄酮组颜色明显低于模型组且接近空白组，说明蜂胶黄酮各剂量组明显降低3-OH断裂诱导的细胞凋亡作用[5、6]。

细胞周期检测中，与空白组比较，给予H2O2后，G0/G1期细胞明显增多，G2/M、S期细胞明显减少,细胞增殖降低，而蜂胶黄酮组G0/G1期细胞明显减少，G2/M、S期细胞增加,说明蜂胶黄酮具有促进细胞增殖的潜势[7]。

通过流式细胞仪检测细胞活性氧水平，蜂胶黄酮组明显低于模型组且接近空白组，说明有清除细胞内氧自由基，抗氧化作用；ELISA检测细胞内Caspase-3蛋白含量，蜂胶黄酮组明显低于模型组且接近空白组，说明抑制细胞凋亡因子产生，减少细胞凋亡，并且随蜂胶黄酮浓度增大效果更加明显，所以还具有一定的剂量依赖性。

以上实验结果均显示蜂胶黄酮对PC12具有明显的抗凋亡作用。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素标记dUTP在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端，并可与连接辣根过氧化酶的链酶亲和素特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺的存在下，产生很强的颜色反应（深棕色），特异准确的定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或者正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，没有3-OH的形成，很少能够被染色[8]。

流式细胞仪检测细胞内活性氧水平，是一种利用荧光探针DCPH-DA进行的活性氧检测的试剂盒，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酶水解生成DCFH，而DCFH不能通过细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内，细胞内的活性氧使无荧光的DCFH生成有荧光的DCF,检测DCF的荧光就可以知道细胞内的活性氧水平，实验结果显示，模型组细胞活性氧水平明显高于正常组与蜂胶黄酮组，说明H2O2可使细胞过氧化，而蜂胶黄酮的三个剂量组细胞活性氧水平率稍高于正常组，明显低于模型组，说明蜂胶黄酮对细胞有保护作用，可清除细胞内氧自由基水平[9]。

Caspase-3是调控凋亡最直接的基因，被称为凋亡的执行者，在许多凋亡过程中，Caspase-3被凋亡信号激活后由其前体形式转变为成熟的酶，介导下游的凋亡效应，在正常细胞中以酶原形式存在，氧自由基等刺激因子使线粒体通透性增加，线粒体跨膜电位下降，释放细胞色素C，细胞色素C主要激活Caspase-9，进而激活下游的Caspase-3，引起细胞形态的变化如出现皱缩、DNA裂解、染色体浓缩和凋亡，小体的形成，最终导致细胞凋亡[10]。

本文结果表明，蜂胶黄酮在抗H2O2对PC12细胞的凋亡发挥抑制作用的机制可归结为减少G0/G1细胞，增加G2/M、S期细胞，而促进细胞增殖；抗氧化、清除氧自由基作用，与自由基直接结合，阻止Caspase-3蛋白活化。

本研究结果表明蜂胶黄酮具有抗PC12神经细胞凋亡作用，为蜂胶黄酮的临床应用和AD病的临床治疗提供了极有意义的药理和药物学依据[11、12]。

6结论

蜂胶黄酮对H2O2诱发PC12神经细胞凋亡有显着的抑制作用，其机制可能其影响细胞周期、清除氧自由基、降低凋亡因子Caspase-3有关。

参考文献

[1]王浩,张庆乐,许利军等.蜂胶醇提物对小鼠学习记忆的促进作用[J].中国蜂业，2008,59（8）:

5-6,9.

[2]王浩,张庆乐,徐晓燕等.蜂胶总黄酮对衰老小鼠学习记忆影响的实验研究[J].中国老年学杂志，已接收.

[3]ISHISAWAR,UTSUMIK,UTSUMIT.InvolvementoflysosomalcysteineproteasisinhydrogenperoxideinducedapoptosisinHL-60cells[J].BiosciBiotechnolBiochem,2002,66（9）:

1865-1872.

[4]徐颖.方金凤，顾岚，蜂胶黄酮清除自由基作用的研究_2008年《食品工业》第一期[5]杨明,朱姝,隋殿军等.蜂胶总黄酮对大鼠心肌缺血-再灌注损伤诱导细胞凋亡的影响[J].