食品微生物检验课程设计指导书2.docx

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食品微生物检验课程设计指导书2

吉林工程技术师范学院

食品工程学院

《食品微生物检验》

综合实训

设计题目：

《国标》沙门氏菌检测

学生姓名：

王林

班级学号：

34号

指导老师：

金明晓王陆玲

2012年11月30日

食品微生物检验综合实训

前言

本标准代替GB/T4789.4-2008《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》。

本标准与GB/T4789.4-2008相比，主要变化如下

——修改了标准的中英文名称；

——修改了标准的范围；

——修改了培养基和试剂；

——修改了设备和材料；

——修改了附录A。

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准所代替的历次版本发布情况为：

——GB4789.4-84、GB4789.4-1994、GB/T4789.4-2003、GB/T4789.4-2008。

食品安全国家标准

食品微生物学检验沙门氏菌检验

1范围

本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。

本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

2设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

冰箱：

2℃～5℃。

恒温培养箱：

36℃±1℃，42℃±1℃。

均质器。

振荡器。

电子天平：

感量0.1g。

无菌锥形瓶:

容量500mL，250mL。

无菌吸管：

1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

无菌培养皿：

直径90mm。

无菌试管：

3mm×50mm、10mm×75mm。

无菌毛细管

pH计或pH比色管或精密pH试纸。

全自动微生物生化鉴定系统。

培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）：

四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液

亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 

亚硫酸铋（BS）琼脂 

HE琼脂

木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂

沙门氏菌属显色培养基。

三糖铁（TSI）琼脂

蛋白胨水、靛基质试剂

尿素琼脂（pH7.2）

氰化钾（KCN）培养基

赖氨酸脱羧酶试验培养基

糖发酵管

邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基

半固体琼脂

丙二酸钠培养基

沙门氏菌O和H诊断血清

生化鉴定试剂盒

课程目的：

掌握沙门氏杆菌的国家标准检查方法

课程意义：

通过对本课程设计的学习，要求学生掌握食品微生物检验的基础理论知识、沙门氏杆菌常规的检验原理，了解检验新技术的发展概况；并通过检验操作技能的训练，正确掌握微生物检验的方法和技能，包括微生物检验常用器材的使用方法和技能、生化试验和血清学试验方法和技能、微生物检验的样品处理技术、食品微生物卫生指标菌沙门氏杆菌的检验和报告的撰写等内容，对《中华人民共和国国家标准　食品卫生检验方法　微生物部分》（简称国标）具有较强的应用能力和执行能力，使学生能较好地胜任食品微生物检验的有关工作。

同时还重视学生的职业道德教育和法制教育，重视培养学生的诚信品质、敬业精神和责任意识、遵纪守法意识、团结合作意识，以提高学生的实践能力、创造能力、就业能力，为毕业后的就业打下良好的基础。

材料准备：

　　1．器材：

灭菌锅、干燥箱、水浴锅、温箱、冰箱、 电子天平、无菌吸管、三角瓶、培养皿、试管、无菌毛细管、精密pH试纸、酒精灯、接种环等。

　　2．培养基：

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂（TSI）、蛋白胨水（靛基质试验用）、 赖氨酸脱羧酶试验培养基、尿素琼脂、ONPG培养基。

方法步骤:

（一）培养

　　前增菌牛乳称取25 mL样品放入盛有225 mL BPW的无菌锥型瓶中，振荡混匀。

于36℃ 士1℃ ，18h进行培养。

1、增菌

 对已污染的被检材料牛乳等先用煌绿增菌培养基增菌培养后再进行分离。

37℃培养18～24h，观察其在各种培养基上的菌落特征。

 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mLTTB内，于42℃ 士1℃ 培养18h一24h。

2、分离培养

 分别用接种环取增菌液1环，划线接种：

二个BS琼脂平板36℃ 士1℃ 40h一48h

二个XLD琼脂平板36℃ 士1℃ 18h一24h

二个HE琼脂平板36℃ 士1℃ 18h一24h  

观察各个平板上生长的菌落。

　沙门氏杆菌在木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、HE琼脂、形成无色或与培养基颜色相同、透明或半透明、中等大小、表面光滑的菌落。

（二）生化试验

 钩取鉴别培养基上的几个可疑菌落分别纯培养，自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃ 士1℃ 培养18h-24h，必要时可延长至48h，观察结果。

沙门氏杆菌只发酵葡萄糖，不利用乳糖和蔗糖，故在三糖铁培养基生长后，培养基底层呈黄色，斜面部分仍为红色；多数菌株产生硫化氢，使培养基底层呈黑色；因其尿素酶阴性，故在尿素琼脂上生长，培养基不变色。

接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、将已挑菌落的平板储存于2℃-5 ℃ 或室温至少保留24h，以备必要时复查。

　糖发酵试验　取纯培养物接种甘露醇、山梨醇发酵管，37℃培养2～3d，观察结果。

　　吲哚试验　取纯培养物接种蛋白胨水，37℃培养2～3d，加入吲哚试剂，观察结果。

尿素挑取琼脂培养物接种，在36℃±1℃培养24h，观察结果。

尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

（1） A1典型反应判定为沙门氏菌属。

如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌属。

如有2项异常，为非沙门氏菌属。

（2）A2：

补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

（3）A3：

补做ONPG。

ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

（三）血清学鉴定

试剂（诊断血清）：

含抗体

检测对象：

特异性抗原

方法：

用接种环沾取少许沙门氏杆菌血清置于玻片上，再钩取几个菌落于之混匀，出现凝集为阳性反应。

诊断血清

（含沙门氏菌抗体）+待检测细菌细菌凝集

（对照：

加1-2菌环生理盐水）

玻片凝集试验：

阳性

报告：

检出沙门氏菌

现象分析

1.在三糖铁试验中，能看到试管斜面底部有黑色沉淀，在斜面表面有浅黄色菌落，部分还是红色，为阳性。

2.在尿素琼脂实验中，培养基不变色，为阴性。

3.在吲哚实验中，在液面与吲哚试剂界面出现粉红色圈，为阳性。

4.在糖发酵试验中，山梨醇与甘露醇变成了黄色，即为阳性。

结果报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌属细菌。

一、缓冲蛋白胨水（BPW）

1成分

蛋白胨10g

氯化钠5g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）9g

磷酸二氢钾1.5g

蒸馏水1000ml

pH7.2

2制法按上述成分配好后以大烧瓶装，121℃高压灭菌15min。

临用时无菌分装每瓶225ml。

注：

本培养基供沙门氏菌前增菌用

二、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）

1基础培养基

多胨或胨5g胆盐1g

碳酸钙10g硫代硫酸钠30g

蒸馏水1000ml

2碘溶液

碘6g

碘化钾5g

蒸馏水20ml

3制法将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100ml。

分装时应随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。

121℃高压灭菌15min备用。

临用时每100ml基础培养基中加入碘溶液2ml，0.1%煌绿溶液1ml。

三、亚硫酸铋琼脂（BS）

1.成分

蛋白胨10g

牛肉膏5g

葡萄糖5g

硫酸亚铁0.3g

磷酸氢二钠4g

煌绿0.025g

柠檬酸铋铵2g

亚硫酸钠6g

琼脂18~20g

蒸馏水1000Ml

PH7.5

2.制法将面前5种成分溶解于300mL蒸馏水中；将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解；将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解,冷至80度。

将以上三液混合并补充蒸馏水至1000mL,校正PH,加0.5%煌绿水溶液5mL,摇匀.冷至50~55度,倾注平皿.

注:

此培养基不需高压灭菌.制备过程不宜过分加热,以免降低其选择性.应在临用前一天制备,贮存于室温暗处.超过48小时不宜使用.

四、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂

1.成分

酵母粉     3.0gL-赖氨酸    5.0g乳 糖    7.5g蔗 糖     7.5g

木糖     3.5g氯化钠     5.0g硫代硫酸钠   6.8g柠檬酸铁铵  0.8g

去氧胆酸钠 2.5g酚红   0.08g琼 脂13.5g蒸馏水1000mL

PH值   7.4±0.2 

2.制法

制备  将上述成分（酚红除外）溶解于1 000 mL蒸馏水，加热溶解。

调至pH7.4士0.2。

再加入指示剂，待冷至50℃-55 ℃ 倾注平皿。

注：

本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。

本培养基宜于当天制备，第二天使用。

五、HE琼脂

1.成分胨12g牛肉膏3g乳糖12g蔗糖12g水杨素2g胆盐20g氯化钠5g

琼脂18~20g蒸馏水1000mL

0.4%溴麝香草酸蓝溶液16mLAndrade指示剂20mL

甲液20mL乙液20mL

2.制法

将前面7种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内,加热溶解.加入甲液和乙液于基础液内,校正PH.再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃,倾注平板.

注1:

此培养基不可高压灭菌

注2:

甲液的配制

硫代硫酸钠34g柠檬酸铁铵4g蒸馏水100mL

注3:

乙液的配制

去氧胆酸钠10g蒸馏水100mL

注4:

Andrade指示剂

酸性复红（酸性品红）0.5g1mol/L氢氧化钠溶液16mL蒸馏水100mL

将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。

室温下放置过夜。

如果复红至草黄色，再入氢氧化钠溶液1~2mL。

六、三糖铁琼脂（TSI）

1.成分

蛋白胨20g牛肉膏5g

乳糖10g蔗糖10g

葡萄糖1g氯化钠5g

硫酸亚铁钠[Fe（NH44）2（SO4）2.6H2O]0.2g

硫代硫酸钠0.2g琼脂12g

酚红0.025g蒸馏水1000mlPH7.4

2.制法

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正PH。

加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。

加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀。

分装试管，装置宜多些，以便得到较高的底层。

121摄氏度高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

七、蛋白胨水（靛基质试验用）

成分：

蛋白胨（或胰蛋白胨）20g

氯化钠5g

蒸馏水1000ml

PH7.4

制法：

按上述成分配制，分装小试管，121℃高温灭菌15min。

靛基质试剂：

柯凡克试剂：

将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25ml

欧-波试剂：

将1g对二甲氨基甲醛溶解于95ml乙醇内，然后缓慢加入浓盐酸20ml

实验方法：

挑取小量培养物接种，在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。

加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管，阳性者于试管层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：

蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。

每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

八、尿素琼脂

成分：

蛋白胨10g氯化钠5g葡萄糖1g

磷酸二氢钾2g0.4%酚红溶液3ml琼脂20g

蒸馏水1000ml20%尿素溶液100mlPH7.2±0.1

制法：

将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正PH，加入琼脂，加热熔化并分装烧瓶。

121℃高压灭菌15min。

冷至50℃～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。

尿素的最终浓度为2%，最终PH应为7.2±0.1。

分装于灭菌试管内，放成斜面备用。

实验方法：

挑取琼脂培养物接种，在36℃±1℃培养24h，观察结果。

尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

九、ONPG培养基

1成分

邻硝基酚β—D—半乳糖苷（ONPG）60mg

0.01mol/L磷酸钠缓冲液（PH7.5）10mL

1%蛋白胨水（PH7.5）30mL

2制法

将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。

3实验方法

自琼脂斜面上挑取培养物一满环接种于36℃±1℃培养1h～3h和24h观察结果。

如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

十、赖氨酸

成分：

蛋白胨                  5.0g

酵母浸膏                3.0g

葡萄糖                  1.0g

蒸馏水                  1000.0ml

1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液   1.0ml

L-赖氨酸或DL-赖氨酸                0.5g/100ml或 1.0g/100ml

pH6.8±0.2

制法：

除赖氨酸以外的成分加热熔解后，分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸。

L-赖氨酸按0.5%加入，DL-赖氨酸按1%加入。

调节pH。

对照培养基不加赖氨酸。

分装于灭菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层液体石蜡，115摄氏度高压灭菌10min。

实验方法：

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36士1摄氏度培养18-24 h，观察结果。

赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。

阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。

对照管应为黄色。

十一、糖发酵管

1成分

牛肉膏5g

蛋白胨10g

氯化钠3g

磷酸氢二钠（Na2HPO4﹒12H2O）2g

0.2%溴麝香酚蓝溶液12mL

蒸馏水1000mL

PH7.4

2制法

（1）葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。

（2）其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。

另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌，将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：

蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

（3）实验方法：

从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养，一般观察2d~3d。

迟缓反应观察14d~30d。

糖发酵管

1成分

蛋白胨1g

氯化钠0.5g

0.2%溴百里香酚蓝溶液1.2mL

蒸馏水100mL

糖（醇）1g

2指示剂配制

0.2%溴百里香酚蓝的配制

溴百里香酚蓝0.2g0.1MNaOH5ml蒸馏水95mL

溴百里香酚蓝pH6.0（黄）-7.6（蓝）

沙门氏菌检验步骤（GB/T4789.4-2008）

 操作步骤

 1 前增菌

  称取25g（ mL）样品放入盛有225 mL BPW的无菌均质杯中，以8 000r/ min一10 000 r/ min均质1min一2 min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min一2min。

若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。

如需要，测定pH值，用1mol/mL无菌氢氧化钠或盐酸调pH至6.8士0.2。

无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃ 士1℃ 培养8h- 18h。

如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃-5 ℃ 不超过18h解冻。

 2 增菌

  轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mLTTB内，于42℃ 士1℃ 培养18h一24h。

同时，另取1 mL，转种于10 mLSC内，于36℃ 士1℃ 培养18h一24h。

 3 分离

  分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或科玛嘉显色培养基平板）。

于36℃ 士1℃ 分别培养18h-24h （ XLD琼脂平板、HE琼脂平板、科玛嘉显色培养基平板）或40h一48h （ BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。

 4 生化试验

 4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃ 士1℃ 培养18h-24h，必要时可延长至48h。

在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

  表2说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。

其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。

 4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种于36℃ 士1℃ 培养18h-24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。

将已挑菌落的平板储存于2℃-5 ℃ 或室温至少保留24h，以备必要时复查。

 4.2.1 反应序号 A1典型反应判定为沙门氏菌属。

如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌属。

如有2项异常，为非沙门氏菌属。

 4.2.2 反应序号A2：

补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

 4.2.3 反应序号A3：

补做ONPG。

ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

 4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

 4.3 如选择API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

 5 血清学鉴定

 5.1 抗原的准备

  一般采用1.2％一1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

 5.2 抗体的准备

由免疫学实验课制备的抗体保留在此使用。

 6 结果报告

  综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌属。

沙门氏菌检验培养基和试剂

 缓冲蛋白胨水（BPW ）

 四硫磺酸钠煌绿（TTB ）增菌液

 亚硒酸盐胱氨酸（SC ）增菌液

 亚硫酸秘（Bs）琼脂

 HE（Hoktoen Entoric）琼脂。

 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂

 沙门氏菌属显色培养基

 三糖铁（TsI）琼脂

 蛋白胨水、靛基质试剂

 尿素琼脂（pH7.2 ）。

 赖氨酸脱羧酶试验培养基

 糖发酵管

 邻硝基酚份B-D半乳糖苷（ONPG）培养基

 半固体琼脂

 丙二酸钠培养基

沙门氏菌检验-设备和材料（GB/T4789.4-2008）

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

 冰箱：

2℃ -5 ℃ ．

 恒温培养箱：

36℃ 士1℃ ，42℃ 士1℃ 。

 天平：

感量0.1g。

 无菌锥形瓶：

容量500 mL , 250 mL。

 无菌吸管：

1 mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1lmL刻度）或微量移液器及吸头。

 无菌培养皿：

直径90 mm。

 无菌试管：

3mm*50mm、10 mm*75 mm。

 无菌毛细管。

 pH计或pH比色管或精密pH试纸。