离子色谱法IC.docx
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离子色谱法IC
离子色谱法（IC）
一、离子色谱（IC）基本原理
离子色谱是高效液相色谱（HPLC）的一种，其分离原理也是通过流动相和固定相之间的相互作用，使流动相中的不同组分在两相中重新分配，使各组分在分离柱中的滞留时间有所区别，从而达到分离的目的。
二、离子色谱仪的结构
离子色谱仪一般由四部分组成，即输送系统、分离系统、检测系统、和数据处理系统。
输送系统由淋洗液槽、输液泵、进样阀等组成；分离系统主要是指色谱柱；检测系统（如果是电导检测器）由抑制柱和电导检测器组成。
离子色谱的检测器主要有两种：
一种是电化学检测器，一种是光化学检测器。
电化学检测器包括电导、直流安培、脉冲安培、和积分安培；光化学检测器包括紫外－可见和荧光。
电导检测器是IC的主要检测器，主要分为抑制型和非抑制型（也称为单柱型）两种。
抑制器能够显著提高电导检测器的灵敏度和选择性，其发展经历了四个阶段，从最早的树脂填充的抑制器到纤维膜抑制器，平板微膜抑制器和先进的只加水的高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。
三、离子色谱基本理论
离子色谱主要有三种分离方式：
离子交换离子排斥和反相离子对。
这三种分离方式的柱填料树脂骨架基本上都是苯乙烯/二乙烯苯的共聚物，但是树脂的离子交换容量各不相同，以下就主要介绍离子交换色谱的分离机理。
在离子色谱中应用最广的柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。
这类树脂的基球是用一定比例的苯乙烯和二乙烯基苯在过氧化苯酰等引发剂存在下，通过悬浮物聚合制成共聚物小珠粒。
其中二乙烯基苯是交联剂，使共聚物称为体型高分子。
典型的离子交换剂由三个重要部分组成：
不溶性的基质，它可以是有机的，也可以是无机的；固定的离子部位，它或者附着在基质上，或者就是基质的整体部分；与这些固定部位相结合的等量的带相反电荷离子。
附着上去的集团常被称作官能团。
结合上去的离子被称作对离子，当对离子与溶液中含有相同电荷的离子接触时，能够发生交换。
正是后者这一性质，才给这些材料起了“离子交换剂”这个名字。
离子交换法的分离基理是离子交换，用于亲水性阴、阳离子的分离。
阳离子分离柱使用薄壳型树脂，树脂基核为苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核的表面是磺化层，磺酸基以共价键与树脂基核共聚物相连；阴离子分离柱使用的填料也是苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核外是磺化层，它提供了一个与外界阴离子交换层以离子离子键结合的表面，磺化层外是流动均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒，这些胶乳微粒提供了树脂分离阴离子的能力，其分离基理基于流动相和固定相（树脂）阳离子位置之间的离子交换。
淋洗液中阴离子和样品中的阴离子争夺树脂上的交换位置，淋洗液中含有一定量的与树脂的离子电荷相反的平衡离子。
在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是CO32-和HCO3-；在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是H+。
离子交换进行的过程中，由于流动相可以连续地提供与固定相表面电荷相反的平衡离子，这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的离子电荷平衡。
随着样品离子与连续离子（即淋洗离子）的交换，当样品离子与树脂上的离子成对时，样品离子由于库仑力的作用会有一个短暂的停留。
不同的样品离子与树脂固定相电荷之间的库仑力（即亲和力）不同，因此，样品离子在分离柱中从上向下移动的速度也不同。
样品阴离子A-与树脂的离子交换平衡可以用下式表示：
阴离子交换A-＋（淋洗离子）－＋NR4-R＝A-+NR4-R＋（淋洗离子）
对于样品中的阳离子，树脂交换平衡如下（H+为淋洗离子）：
阳离子交换C+＋H+－O3S-R＝C+－O3S-R＋H+
在阴离子交换平衡中，如果淋洗离子是HCO3-，可以用下式表示阴离子交换平衡：
K是选择性系数。
K值越大，说明样品离子的保留时间越常。
选择性系数是电荷、离子半径、系统淋洗液种类和树脂种类的函数。
离子半径
样品离子的价数越高，对离子交换树脂的亲和力越大。
因此，在一般的情况下，保留时间随离子电荷数的增加而增加。
也就是说，淋洗三价离子需要采用高离子强度的淋洗液，二价离子可以用较低浓度的淋洗液，而低于一价离子，所需淋洗液浓度更低。
离子半径
电荷数相同的离子，离子半径越大，对离子交换树脂的亲和力越大，即随着离子半径的增加，保留时间延长。
例如：
卤素离子的洗脱顺序依次是F-、Cl-、Br-、I-；碱金属离子的洗脱顺序是：
Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+。
淋洗液的pH值
淋洗液的pH值影响多价离子的分配平衡，例如：
随着淋洗液pH值的增加，PO43-从一价变为二价或三价。
因此，pH值较低时，它在NO3-之后，SO42-之前洗脱，pH>11时，在SO42-之后洗脱。
树脂的种类
离子交换树脂的粒度、交联度、功能基性质及亲水性等因素对分离的选择性也起很大作用。
四、检测器
电导检测器是离子色谱中使用最广泛的检测器。
其作用原理是，用两个相对电极测量溶液中离子型溶质的电导，由电导的变化测定淋洗液中溶质的浓度。
电导检测器的电导池结构如图所示。
电导池体一般采用材质较硬的工程塑料如PEEK等，电极通常为316不锈钢并固定在电导池内。
另外，电导池上通常有一个温度传感器，用于探测液体流出电导池时的温度和补偿由于温度改变而导致的电导变化。
改变两电极之间的距离可以调整池的常数，对检测的灵敏度有很大的影响。
通常电极间的距离越小，死体积越小，灵敏度越高。
目前先进的商品电导池的池体积为0.5～1ul左右。
测量电导过程中的物理化学原理如图：
当电场施加于两电极时，溶液中阴离子趋向阳极，阳离子趋向阴极。
溶液中离子数目和迁移速度的大小决定溶液的电导值。
离子的相对迁移率，由其极限当量电导值决定。
离子在电场作用下的运动速度，除受离子电荷和离子的大小等因素影响外，还与温度、介质的性质及施加电压的大小有关。
两电极之间可以施加直流电压，但通常是施加正旋波或方波型交流电压。
当施加的有效电压确定后，测量出电路中的电流值，即能测出电导值。
然而，如上图所示，由于电极表面附近形成的双电层极化电容（或称法拉第交流阻抗）的影响，会引起有效电压的改变，因而电路施加于两极的电压不等于有效电压。
双电层形成机理的解释如下：
当电极两端的电压低于离子的分解电压时，电极附近的溶液层将吸引反电荷的离子形成一双电层，此双电层由两部分组成：
（1）内壁薄层，在此层内离子浓度随电极距离的增加而减少呈现线性关系；
（2）扩散层，在此层内离子浓度随电极距离的增加而减少呈指数关系。
双电层的存在，亦会产生电压降，实际上施加电压为有效电压（由溶液电阻产生的电压降）和双电层电压降的总和。
为了消除电极表面附近形成的双电层极化电容对有效电压的影响，电导池的设计多采用双极脉冲技术。
该技术是通过在持续很短的时间内（约100us），连续施加两个脉冲高度和持续时间相同而极性相反的脉冲电压于电导池上，并采用测量第二个脉冲终点时的电流，此点的电导池电流遵从欧姆定律，不受双层极化电容的影响，可以准确测量池电阻。
将电解质溶液置于施加电场的两个电极间，则溶液将导电，此时溶液中的阴离子移向阳极，阳离子移向阴极。
并遵从以下关系：
式中，κ为电导率，是电阻率的倒数（κ＝1/R）；A为电极截面积；L是两电极间的距离；Ci是离子浓度，以mol/l为单位；λi为离子的极限摩尔电导（指溶液无限稀释后离子的电导）。
在测量中，对一给定电导池电极截面积A和两极间的距离L是固定的，L/A称为电导池常数K，则电导值κ等于：
当知道λio后，就可以计算溶液中所含离子的电导值。
例如：
25℃时，NaCl的当量电导值是Na+和Cl-的当量电导值（50.1，76.4）之和（126.5），因此，0.1mMNaCl溶液的电导值＝0.1×126.5＝12.65us/cm。
由此可知0.1mMNaCl和0.1mMNa2SO4溶液的电导值如下：
离子数电荷数浓度λious/cm
3×1×0.1×50.1＝15.0（Na+）
1×1×0.1×76.4＝7.6（Cl-）
1×2×0.1×80.0＝16.0（SO42-）
我们仅讨论稀释溶液。
因为随着溶液浓度的增加，电导和浓度之间的比例关系将消失。
不过在离子色谱正常的分析浓度范围内（<1mM），电导与浓度仍成正比关系。
例如：
25℃时，KCl的当量电导为149.9，在浓度为1mM时为146.9，仅减少2%。
然而淋洗液样品的电导不被假定与浓度成比例，因为流动相的离子成分被包含在淋洗体积当中。
如果电解液是部分电离的弱酸和弱碱，那么Ci将被已电离部分的浓度所取代，pK和pH将被用来计算电离程度。
影响电导测定的几个因素：
1、浓度
溶液的电导与溶液中溶质的浓度呈线性关系。
同时这种线性关系也受溶液中离子的离解度、离子的迁移率和溶液中离子对的形成等因素的影响。
对弱电解质溶液，影响检测器线性的主要因素是解离度或离子化程度。
解离度代表了总溶质中能够传递电流的部分，它由溶质的浓度和溶剂的性质所决定。
弱电解质在溶液中不能完全电离，因此总有某些分子以非离子化的形式存在着。
非离子化的分子是不能传递电流的，因此，测量的离子浓度会小于溶液中该组分的总浓度。
对大多数离子来说，若线性范围能够达到mg/l或ug/l级，离解基本上被认为是完全的。
对强电解质来说，溶液中它们是完全离解的，影响检测器线性的主要因素是离子的淌度（迁移率）。
离子淌度的定义是：
在一个电场中，电位改变1V/cm时离子的迁移速度。
影响离子迁移的因素是每一离子周围形成的溶剂化电荷球对离子运动产生的阻滞力。
在溶液中，离子被带相反电荷的溶剂化电荷球所包围着。
在外加电位的影响下，离子和它的溶剂化电荷球向相反的方向移动，减少了离子的迁移速度。
离子本身性质的不同对其迁移率的影响也很大。
具有较大水合半径的离子，其活性较差，电导值较低；而具有较小水合半径的离子其活性大，淌度较高，因此其电导值较高。
2、温度对电导的影响
离子的流动性和电导受温度的影响很大。
温度每升高1℃时，水溶液的电导将增加2%。
因此，流动相的温度应该尽可能的保持稳定。
另外，可以将所测量的电导值修正至25℃时的测量值。
现在的电导检测器都设计有能消除温度影响的功能。
例如Dionex公司的电导检测器中，其电导池中设计有能对电导池流出液体的温度进行连续自动测量的热敏元件，通过在检测器中设定一个以25℃时为基准的温度补偿系数进行归一化处理，来消除温度变化对测量结果的影响。
电导检测器的常见故障以及处理方法
1、电导池的清洗
电导检测器常见的故障是检测池被污染。
污染物主要来源于没有经过前处理的样品，如浓度过高、复杂的样品基体等。
检测池被污染后可使检测器的基线噪音变大，灵敏度下降。
当确认是检测池受到污染时，可以采用下列方法清洗，使其恢复原来的性能。
具体步骤如下：
（1）配置少许3mol/lHNO3溶液；
（2）在电导池的入口处连接一个可接驳注射器的接头；
（3）用一个10ml的注射器向电导池内推注约20ml3mol/lHNO3溶液；
（4）用去离子水冲洗电导池至pH值达中性。
注意：
清洗时应当将电导池的出口处直接连接至废液，严禁强酸进入抑制器。
2、电导池的校正
电导池清洗后一般需重新校正。
在正常使用的情况下，电导池应每年校正一次。
校正的方法如下：
（1）将分析泵的出口管路直接连接到电导池的路口。
（2）以8.0ml/min的流速泵入0.001mol/lKCl校正溶液，2min后将流速降至分析时的正常流速。
最大不要超过2ml/min。
（3）此时电导值显示因为147us，如果不是，调节检测器上的校正螺丝至147us。
（4）用去离子水以8ml/min的流速冲洗电导池2min，停泵，将系统管路恢复至正常状态。
五、抑制器的工作原理
电导检测器是离子色谱最通用的检测器，但本身存在着一个问题，即对淋洗液有很高的检测信号，这就使它难以识别淋洗时样品离子所产生的信号。
为了降低淋洗液的背景电导，就需要用到抑制器，抑制器就是在这种情况产生及发展起来的。
抑制器主要起两个作用，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。
下图说明了离子色谱中化学抑制器的作用：
图中的样品为阴离子的混合液，淋洗液为NaOH。
若样品经分离柱直接进入检测器，则得到右图上部的色谱图。
图中非常高的背景电导来自于淋洗液NaOH，被测离子的峰很小，即信噪比不好。
而当洗脱液通过抑制器之后再进入检测器，则达到右下部的色谱图。
在抑制器中，OH-和H+结合成水，样品离子在很低的电导下进入电导池，这样淋洗液的背景电导就变成水的电导，从而降低了背景电导，改善了信噪比。
电化学抑制（阳离子交换）
为了提高离子交换的速度，提高抑制容量和缩短平横时间，现在的抑制器为电化学抑制柱，采用电场力为离子迁移的动力，采用电解水的方法来提供再生液。
下图为阴离子抑制器使用NaOH为流动相时的抑制机理图：
所分析的离子与Na+结成离子对，从分离柱洗脱，两层离子交换膜底部都有电极，其极性与流动相相反，水被电解成OH-和H+后，H+穿过离子交换膜，与流动相中的OH-中和成水；同时Na+穿过另一离子交换膜，与阳极提供的OH-结成离子对。
因此，流动相中的NaOH将穿过离子交换膜，而不会到达检测器。
因此，流动相的背景电导几乎为零（大大低于抑制以前），并且所分析的离子与H+结成离子对后，其电导比Na＋离子高7倍，所以其相应值提高。
这种抑制作用也可以通过在离子交换膜的另一侧加入稀H2SO4（再生液）而达到。
对于阳离子检测而言，其抑制器中是阴离子交换膜，允许阴离子只有穿行。
流动相中经常使用甲烷磺酸，在抑制器中，甲烷磺酸离子对被电解水产生的OH-所取代，它可以中和酸性流动相，以便为分析离子提供低的背景电导。
六、离子色谱的定性与定量分析
（一）定性分析
离子色谱的定性是将检测器输出的信号，经过放大，用记录议或积分仪以峰的形式记录出来。
确定色谱峰所代表的离子对组分时，要根据其保留时间进行判断。
这种定性方法必须依靠与自己已知成分和浓度的标准物对照，如果标准与样品显示出相同的保留行为，说明样品组分与标准相同。
（二）定量分析
在一定条件下，色谱峰高或峰面积与离子浓度成正比，这是离子色谱分析的定量依据。
测量峰高或峰面积主要有以下四种方法：
1、峰高法
测量从峰的顶点到基线之间的垂直距离就是峰高法。
其理想条件是：
洗脱条件一致，色谱峰形尖锐呈正态分布，重现性好，基线稳定，线性范围宽，样品数不宜过多等。
峰高法的测量精密度通常为1～2%。
2、峰面积
3、近似三角形
4、电子学方法测量峰面积――面积积分
（三）定量方法
1、标准曲线法
如同HPLC一样，离子色谱首先用标准溶液制成高于仪器检测限的标准系列。
在给定的色谱条件下，依次做出标准系列的响应值，并以横坐标为浓度、纵坐标为响应值在坐标纸上做出标准曲线。
在正常情况下，标准曲线的线性范围内，可找出对应的含量。
在大量的例行分析中，可用单点标准法求得到未知溶液的含量：
2、标准加入法
标准加入法用于存在基体干扰的样品测定。
该方法是在至少三份具有相同体积的试样中，分别加入不同量的待测元素的标准溶液（其中有一份不加标准溶液），稀释到相同的体积后进样，分别测量其峰或峰面积。
如图所示，以横坐标为浓度、纵坐标为响应值做出一条直线，直线向左延长至与横坐标相交，交点与坐标原点的距离即为试样中离子的浓度。
七、色谱参数（条件）的优化
（一）改善分离度
1、稀释样品
对组成复杂的样品，若待测离子对树脂亲和力相差颇大，就要作几次进样，并用不同浓度或强度的淋洗液或梯度淋洗。
若待测离子之间的浓度相差较大，而且对固定相亲和力差异较大的离子，增加分离度的最简单方法是稀释样品或作样品前处理。
2、样品的前处理
对高浓度基体中衡量离子的测定，例如海水中阴离子的测定，最好的方法是对样品作前处理。
除去过量的Cl-的前处理方法有：
使样品通过Ag+型前处理柱除去Cl-，或进样前加入AgNO3到样品中沉淀Cl-。
（二）参数的设置
1、流动相的流速
2、电导池电流（电压）
3、设定时间
4、电解电压（再生液流速）
（三）纯水电导
为了提高检测灵敏度，要求流动相的电导被很好的抑制下来。
假设流动相的电导被很好的抑制，那么剩下的电导是由配制流动相的纯水及反应生成的水两者所产生的。
为了使检测器检测到很低的背景电导，那么所用纯水应具有较低的电导值。
（四）基线不稳产生的原因………基线噪音和基线漂移
1、由于再生液是通过电解纯水产生的，那么在电解过程会产生气体。
由于抑制柱的材质有可能会吸附气体，使气泡在抑制柱中聚集。
这样以来会影响再生液通过离子交换膜与流动相相中和，造成抑制效果产生波动。
2、流动相的流速产生波动或者是流动相中有气泡存在
3、系统平衡时间过短
4、流路泄漏
5、环境温度明显变化
（五）检测器输出高
1、抑制器安装不正确
2、抑制器不抑制
3、淋洗液或再生液的流速或浓度不合适
（六）检测器输出高
1、进样量少
2、淋洗液或再生液的流速或浓度不合适
3、电导池被污染
（七）没有信号响应
1、电导池电缆开路
2、没有溶液通过电导池
（八）柱效低，强保留组分不能被淋洗液分离
1、淋洗液太弱
2、试剂吸水
3、试剂含有结晶水
（九）柱效低、峰拖尾、保留时间延长
1、淋洗液离子不能有效地与分析离子竞争
（十）保留时间短，样品峰与死体积峰共存淋洗
1、淋洗液太强
2、淋洗离子的价态与分析离子的价态不匹配
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