几丁质对海洋生防酵母Rhodosporidiumpaludigenum抑菌活性的影响及相关机理的研究毕业论文.docx

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几丁质对海洋生防酵母Rhodosporidiumpaludigenum抑菌活性的影响及相关机理的研究毕业论文

工学学士毕业论文

几丁质对海洋生防酵母（Rhodosporidiumpaludigenum）抑菌活性的影响及相关机理的研究

AThesisfortheDegreeofB.Eng

ImpactandMechanismofChitinontheMarineYeast’sAntibacterialActivity（TimesNewRoman二号加粗居中）

Candidate：

LaifengLu

Supervisor：

GuangfengKan

AcademicDegreeAppliedfor：

BachelorofEngineering

Specialty：

FoodScienceandEngineering

DateofOralExamination：

June,2010

University：

：

HarbinInstituteofTechnology

摘要

生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。

本实验通过利用酵母细胞壁组分之一几丁质诱导培养本实验室分离得到的拮抗菌株海洋酵母RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman（经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心CABIBioscienceIdentificationServices鉴定为RhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman）以提高其采后果实病害生物防治效果。

……

关键词：

Rhodosporidiumpaludigenum；几丁质；诱导；生物防治

ABSTRACT

Biologicalcontrolisamethodthatusingmicrobialstrainsorantibioticsubstances,bysprayingordipping,todecreasepostharvestdecayoffruits.Weplannedtousechitin（oneoftheyeastcellwallcomponents）toco-culturewithRhodosporidiumpaludigenumFell&TallmanisolatedbyourlaboratoryColleagueinmarineyeast（IdentifiedbyCABIBioscienceIdentificationServicesasRhodosporidiumpaludigenumFell&Tallman）toenhancetheeffectivenessofitsbiologicalcontrolofpostharvestdecaysoffruits.……

Keywords:

R.paludigenum;Chitin;Induction;BCPD

毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明

原创性声明

本人郑重承诺：

所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。

尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。

对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。

作者签名：

　　　　　日　期：

指导教师签名：

　　　　　日　　期：

使用授权说明

本人完全了解大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：

按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。

作者签名：

　　　　　日　期：

学位论文原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

作者签名：

日期：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权　　　　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

涉密论文按学校规定处理。

作者签名：

日期：

年月日

导师签名：

日期：

年月日

指导教师评阅书

指导教师评价：

一、撰写（设计）过程

1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神

□优□良□中□及格□不及格

2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度

□优□良□中□及格□不及格

3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力

□优□良□中□及格□不及格

4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性

□优□良□中□及格□不及格

5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况

□优□良□中□及格□不及格

二、论文（设计）质量

1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？

□优□良□中□及格□不及格

2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？

□优□良□中□及格□不及格

三、论文（设计）水平

1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义

□优□良□中□及格□不及格

2、论文的观念是否有新意？

设计是否有创意？

□优□良□中□及格□不及格

3、论文（设计说明书）所体现的整体水平

□优□良□中□及格□不及格

建议成绩：

□优□良□中□及格□不及格

（在所选等级前的□内画“√”）

指导教师：

（签名）单位：

（盖章）

年月日

评阅教师评阅书

评阅教师评价：

一、论文（设计）质量

1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？

□优□良□中□及格□不及格

2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？

□优□良□中□及格□不及格

二、论文（设计）水平

1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义

□优□良□中□及格□不及格

2、论文的观念是否有新意？

设计是否有创意？

□优□良□中□及格□不及格

3、论文（设计说明书）所体现的整体水平

□优□良□中□及格□不及格

建议成绩：

□优□良□中□及格□不及格

（在所选等级前的□内画“√”）

评阅教师：

（签名）单位：

（盖章）

年月日

教研室（或答辩小组）及教学系意见

教研室（或答辩小组）评价：

一、答辩过程

1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况

□优□良□中□及格□不及格

2、对答辩问题的反应、理解、表达情况

□优□良□中□及格□不及格

3、学生答辩过程中的精神状态

□优□良□中□及格□不及格

二、论文（设计）质量

1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？

□优□良□中□及格□不及格

2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？

□优□良□中□及格□不及格

三、论文（设计）水平

1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义

□优□良□中□及格□不及格

2、论文的观念是否有新意？

设计是否有创意？

□优□良□中□及格□不及格

3、论文（设计说明书）所体现的整体水平

□优□良□中□及格□不及格

评定成绩：

□优□良□中□及格□不及格

（在所选等级前的□内画“√”）

教研室主任（或答辩小组组长）：

（签名）

年月日

教学系意见：

系主任：

（签名）

年月日

目录

摘要Ⅰ

ABSTRACTⅡ

第一章文献综述1

1.1我国水果产业发展概述1

1.2果蔬采后病害的侵染研究1

1.2.1采后病原真菌的侵染方式1

1.2.2采后病原真菌的致病机理2

1.3果蔬采后病害的控制方法2

1.3.1化学杀菌剂的使用3

1.3.2果实采后病害防治物理方法3

1.3.3果实采后病害生物防治4

1.4采后拮抗酵母作用机制4

1.4.1营养和空间的竞争4

1.4.2重寄生作用5

1.4.3胞外活性物质的产生5

1.4.4诱导抗性6

1.4.5抗生作用6

1.5拮抗菌生理调控及机理的研究7

1.5.1逆境培养7

1.5.2拮抗物质的分泌和积累8

1.5.3基因工程技术的应用8

1.6本课题研究目的8

1.7应用前景和学术价值9

第二章海洋酵母R.paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究10

2.1前言10

2.2实验材料和方法10

2.2.1主要仪器10

2.2.2拮抗菌及其培养10

2.2.3病原菌培养和孢子悬浮液的制备10

2.2.4试剂11

2.2.5果实选择与预处理11

2.2.6几丁质对R.paludigenum生防效果的影响11

2.2.7数据处理分析与作图13

2.3结果13

2.3.1不同浓度几丁质对R.paludigenum生防效力的影响13

2.3.2几丁质诱导后不同浓度R.paludigenum酵母的生防效果15

2.3.3不同培养时间对几丁质诱导下R.paludigenum生防效力的影响17

2.3.4几丁质与NaCl结合诱导对R.paludigenum生防效力的影响19

2.4讨论20

第三章海洋酵母R.paludigenum对果实采后真菌病害抑制机理研究24

3.1前言24

3.2实验材料和方法24

3.2.1主要仪器24

3.2.2拮抗菌及其培养26

3.2.3病原菌培养和孢子悬浮液的制备26

3.2.4果实选择与预处理26

3.2.5几丁质对R.paludigenum生防机理的影响26

3.2.6数据处理分析与作图27

3.3结果28

3.3.1几丁质对R.paludigenum在果实伤口处生长动态的影响28

3.3.2几丁质处理后R.paludigenum对果实诱导抗性的影响29

3.3.3几丁质处理后R.paludigenum发酵上清液的抑菌效果30

3.3.4几丁质培养后R.paludigenum对果实POD酶活性的影响31

3.4讨论32

第四章结果与展望34

4.1本论文的主要研究结果34

4.2本实验的后续研究及展望34

致谢32

参考文献33

附录37

章节，小二黑体居中，下同

第一章文献综述

二级标题，小三黑体，下同

1.1我国水果产业发展概述

水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源，是人们维持身体健康，增进营养必不可少的主要食品，是世界上仅次于粮食的农产品。

…….

正文内容为小四字体，行距1.25，中文为宋体，英文为TimesNewRoman，下同

1.2果蔬采后病害的侵染研究

三级标题，四号黑体，下同

由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一。

…….

1.2.1采后病原真菌的侵染方式

采后病原真菌主要通过3种途径或方式入侵果实：

（1）通过机械伤或虫害等造成的伤口；

（2）通过自然开放的皮孔、气孔、果实和花梗结合部位；（3）通过分泌寄主细胞壁水解酶等直接突破果实表皮的防御机制（Prusky和Lichter,2007）。

病原菌孢子一旦接触伤口组织，侵染就开始了（Janisiewicz和Korsten,2002；Prusky和Lichter,2007）。

引用的参考文献多于1篇时，按照论文发表时间的先后次序时行引用

1.2.2采后病原真菌的致病机理

四级标题，小四号黑体，下同

物种拉丁名第一次出现属名写出全称，随后用其缩写

采后病原真菌具有众多而且复杂的致病机理，但其最终目的都是成功的侵染寄主。

……

1.2.2.1致病菌酸化果实组织

Pseudomonasexpansum、P.digitatm和P.italicum等酸性病原真菌能产生柠檬酸和葡萄糖酸等有机酸，使寄主果实组织发生酸化，进而促进病原菌致病因子，如PG基因（pepgl）的表达（Pruskyetal.,2004）。

1.2.2.2致病因子CAT

非共知的英文缩写在文中第一次出现时需要写出全称，并给出中文意思

活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）在植物和微生物相互作用过程中具有重要作用（Torresetal.,2006）。

最近，中科院植物所Qin等（2007）利用蛋白组学技术发现，……。

1.2.2.3病原菌破坏植物自身防御机制

植物在遭到病原菌侵染时，通过体内木质素和羟脯氨酸糖的沉积，植物抗菌素的积累，蛋白质酶抑制剂和溶菌酶的合成来增强细胞壁的保卫反应。

……

1.3果蔬采后病害的控制方法

果蔬贮藏保鲜是果蔬生产减损、保值和增值的关键因素。

……。

1.3.1化学杀菌剂的使用

目前，化学杀菌剂是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一。

……。

1.3.2果实采后病害物理防治

果蔬采后病害防治物理方法主要有：

热处理；低温冷藏；微波处理；气调；辐射处理；低压处理。

低温冷藏技术已经在部分地区得到实际运用，热杀菌和辐照杀菌也是目前报道比较多的方法。

……。

1.3.3果实采后病害生物防治

从可持续发展的角度出发，开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。

……。

1.4采后拮抗酵母作用机制

根据已有的研究结果显示，微生物对病原菌有直接作用和间接作用两种方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，间接作用包括营养和空间的竞争，胞外活性物质的产生和诱导抗性等。

……

1.4.1营养和空间的竞争

为了抑制病原菌的侵染,拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内在果实表面侵染部位占据优势。

……。

1.4.2重寄生作用

许多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（几丁酶，β-1,3-葡聚糖酶等），从而分解病原菌的细胞壁或菌丝体。

……。

1.4.3胞外活性物质的产生

五号宋体加粗居中

图表在文中一定要有引用，且图表紧随文字描述之后

一些研究结果显示，拮抗菌与病原菌互作时,在果实伤口部位生长的酵母细胞外围有大量的新生物质。

这些胞外活性物质可能参与了拮抗菌与病原菌之间的相互作用（表1-1）。

抗生素名称

产生菌株

针对病原菌

蒿属香豆素、东莨菪亭

无名假丝酵母（C.famata）

指状青霉

毒性蛋白（killerprotein）

毕赤酵母属（Pichiasp.）

抗细菌物质

罗伦隐球酵母

（C.laurentii）

荧光假单胞菌、

Staphylococcusaureus

挥发性物质

乳酸克鲁维酵母

（Kluyveromyceslactis）

扩展青霉

表1-1主要产胞外物质菌株

三线表

1.4.4诱导抗性

近5年来，拮抗菌诱导采后果实抗性成为了生物防治的研究热点。

……。

1.4.5抗生作用

通过拮抗菌产生抗生素抑制病原菌作用是人们最早发现的一种拮抗机理，也是大多数拮抗细菌最主要的机制之一（表1.3）（JanisiewiczandRoitman,1988;Janisiewiczetal.,1991）。

……。

表1-2采后拮抗菌对果实抗性的诱导及对抗性相关反应的刺激

果实

拮抗菌

备注

苹果

出芽短梗霉

C.saitoana

刺激果实几丁质酶、葡聚糖酶和POD

诱导抗性，并刺激果实几丁质酶、-1,3-葡聚糖酶

分泌-1,3-葡聚糖酶

柚子

柑橘

C.oleophila

诱导抗性，并刺激果实乙烯、PAL,几丁质酶、-1,3-葡聚糖酶、积累植保素等

刺激果实硫还原蛋白基因表达

刺激几丁质酶cDNA的表达

刺激-1,3-内葡聚糖酶基因表达

草莓

出芽短梗霉

诱导抗性

樱桃

番茄

膜醭毕赤酵母

刺激果实POD，降低CAT和SOD，提高总蛋白，增强33和47kDa蛋白

刺激果实几丁质酶、-1,3-葡聚糖酶

桃、梨、枣、苹果

罗伦隐球酵母

诱导果实抗性；刺激果实几丁质酶、-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL活性

刺激果实-1，3-葡聚糖酶基因表达

表1-3主要产抗生素菌株

抗生素名称

产生菌株

作用对象

病原菌

伊枯草菌素

枯草芽孢杆菌B-3

核果类水果

M.fructicola

吡咯菌素

洋葱假单胞菌（P.cepacia）LT-4-12W

梨果、柑橘

核果类水果

扩展青霉、灰葡萄孢

丁香霉素E

丁香假单胞杆菌ESC-10和ESC-11（BioSave）

柠檬

吡喃酮

木霉

草莓、苹果

灰葡萄孢

1.5拮抗菌生理调控及机理的研究

近年来，随着拮抗菌和病原菌之间的细胞学、生物化学和分子生物学研究的不断深入发展，研究者发现通过调节采后拮抗酵母的生理代谢机制可能是增强其拮抗能力的有效途径之一（Janisiewicz和Korsten,2002）。

1.5.1逆境培养

Teixidó等（1998）研究表明通过低水分活度培养Candidasake后其在采前使用时生长数量明显增加并增强了酵母的拮抗效力，其机理与积累糖醇和海藻糖有关；……。

1.5.2拮抗物质的分泌和积累

阿根廷学者发现粘红酵母（Rhodotorulaglutini）产生的一种酸（rhodotorulicacid）能抑制许多病原真菌，而且发现整合使用rhodotorulicacid和该粘红酵母能增强其对果实病害的控制（Calventeetal.,2001；Sansoneetal.,2005）。

……

1.5.3基因工程技术的应用

利用分子生物学和基因工程的手段研究拮抗菌的遗传背景并开展相应分子水平的改造是生物防治领域的一个研究热点，……。

1.6本课题研究目的

近年来，采后生物保鲜剂的发展遇到了瓶颈。

……。

本试验目的是解决瓶颈问题之一，探讨通过在培养基中添加几丁质等培养酵母R.paludigenum提高其拮抗效力的可行性，以提高酵母的生防效果。

研究几丁质诱导后R.paludigenum对苹果、梨采后主要真菌病害扩展青霉（P.expansum）体内的抑制效果，筛选出最佳诱导剂量及诱导时间，并结合其他诱导因子为苹果、梨采后病害提供一种安全、经济有效的防治方法，并对可能存在的相关机理，包括促进酵母菌生长、分泌抗菌物质和诱导抗性等进行系统研究。

1.7应用前景和学术价值

利用拮抗酵母对水果采后病害进行生物防治是目前国内外研究的热点，其对于保护生态环境、减少食品农药残留、保障公众健康具有重要意义。

但是要实现拮抗酵母的商业化推广应用，迫切需要解决的问题是提高其生物学效力。

……。

章节间要有分页符

第二章海洋酵母R.paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究

2.1前言

生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。

……。

2.2材料和方法

2.2.1主要仪器

TH-3560全自动灭菌锅造鑫（TSAOHSIN）企业有限公司 

SW-CJ-1F超净工作台苏州安泰空气技术有限公司

SIGMA3K-15离心机德国希格玛（SIGMA）公司

QYC-211全温空气摇床上海福玛实验设备有限公司

Sartrious电子天平北京赛多利斯天平有限公司

200l、1000l、5ml移液器德国Eppendorf公司

血球计数板（25×16）上海医用光学仪器厂

光学显微镜日本奥林巴斯有限公司

LRH-250生化培养箱上海一恒科技有限公司

2.2.2拮抗菌及其培养

2.2.2.1拮抗菌

Rhodosporidiumpaludigenum，分离自中国东海近海海域，并经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心（CABIBioscienceIdentificationServices）鉴定。

……

2.2.2.2酵母诱导培养

保存的酵母菌种首先在NYDA斜面培养基中进行活化，……。

2.2.3病原菌培养和孢子悬浮液的制备

2.2.3.1病原菌

病原菌为扩展青霉（Penicilliumexpansum），……。

2.2.3.2病原菌菌悬液的制备

从病原菌保存斜面中挑取适量的霉菌孢子，……。

2.2.4试剂

几丁质（Chitin）为生化纯试剂，使用前先研磨，并用100目筛网过滤后备用。

2.2.5果实选择与预处理

试验所用果实为正常商业成熟度的苹果（Malusdomestica）果实，……。

2.2.6几丁质对R.paludigenum生防效果的影响

2.2.6.1不同浓度几丁质对拮抗酵母生防活性的影响

酵母活化和液体培养、菌体收集同2.2.2.2，……。

2.2.6.2几丁质诱导后不同浓度R.paludigenum酵母的生防效果

用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。

……。

2.2.6.3不同培养时间对几丁质诱导拮抗酵母生防活性的影响

酵母活化和液体培养、菌体收集同2.2.2.2，……。

2.2.6.4几丁质与NaCl结合诱导对拮抗酵母生防活性的影响

酵母活化和液体培养、菌体收集同2.2.2.2，……。

2.2.7数据处理分析与作图

采用SPSS软件（StatisticalProductandServiceSolutions）进行数据统计，数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法（取p<0.05）。

采用OriginPro7.5软件作图。

2.3结果

2.3.1不同浓度几丁质对R.paludigenum生防效力的影响

在不同浓度的NYCB中诱导培养后，R.paludigenum对梨青霉病的生防效力显著提高（图2-1和图2-2）。

……。

图题五号字，加粗，居中排列，中文英对照一致，图注字体为小五号

能用图表示的结果最好用图，不要用表格，数据尽量作统计学分析

能用图表示的结果最好用图，不要用表格，数据尽量作统计学分析

图2-1不同浓度几丁质培养后的R.paludige