AcidActiveCellPenetratingPeptidesforinVivoTumorTargeted课案.docx
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AcidActiveCellPenetratingPeptidesforinVivoTumorTargeted课案
Acid-ActiveCell-PenetratingPeptidesforinVivoTumor-TargetedDrugDelivery
ErleiJin,BoZhang.JACS.2013,135,933−940
摘要：
细胞穿透肽（CPPs）像反式转录肽（TAT）对于提高细胞内的穿透力和多种物质细胞核靶标已经被探索很长时间，但他们的正电荷引起强烈的非特异性相互作用，使它们不适用于许多体内应用。
在这次工作中，我们使用TAT证明小分子修饰方法在血液中可以抑制CPPs非特异性反应，之后在靶组织或细胞重新激活它们的功能。
TAT赖氨酸残基胺基被酰胺化成琥珀酰胺（aTAT）,就可以完全抑制TAT在血液中的非特异性反应；当在酸性肿瘤间质或内化到细胞内或溶酶体中，aTAT的琥珀酰胺迅速被水解，完全恢复TAT的功能。
因此，aTAT官能化成聚乙二醇嵌段聚ε-己内酯胶束可以在血液中实现长循环，有效积累传递阿霉素到肿瘤组织，从而产生较高的抗肿瘤活性和较低的心脏毒性。
酰胺化方法有效和方便地实现了CPPs在体内的应用。
前言
细胞穿透肽（CPPs），高度阳离子肽通常富含精氨酸和赖氨酸等氨基酸，其特征在于它们能够快速转运进入几乎任何活细胞中。
一些序列，如从HIV反式转录（TAT）蛋白（GRKRRQRRRPPQ）中蛋白转导结构域，可以被核孔复合物识别，因此可以积极地从胞浆转运蛋白质、DNA、纳米颗粒和其他物质进入细胞核。
因此，CPPs已经被用作十分有效的“火车头”对于细胞内和核内多种物质转运，从抗癌小分子药物到生物大分子蛋白、甚至纳米颗粒。
大量的体外研究表明具有巨大的应用潜力，然而，CPPs是不能应用在许多体内细胞的，因为它们固有非特异性阳离子导致的。
例如，β-半乳糖苷酶-TAT复合蛋白注射入小鼠的腹腔内，发现在几乎所有的组织都有分布。
一旦静脉注射（I.V.）给药，CPPs激活网状内皮系统识别;因此，它们被迅速从循环中清除，并且很容易地渗透到大多数器官。
CPPs的阳离子电荷用聚阴离子屏蔽被用来抑制它们的非特异性反应。
例如，CPP和阴离子肽结合通过一个可切割的连接臂，来掩盖它的细胞穿透功能和非特异性反应。
当在靶组织如肿瘤中，接头的蛋白水解促进了两个结构域的解离，激活了CPP的功能。
然而，一个最近的报到显示，激活在肿瘤细胞是少数的，绝大多数都发生在血管中。
Sethuraman和Bae提出用合成的pH响应聚合物去屏蔽酸敏感，在中性条件下显负电性，但是在酸性条件下呈中性。
因此，在中性pH值的聚合物形成复合物，但在酸性pH释放TAT。
主要关注这个方法体内复合物的稳定性，因为一个短的TAT肽包含的阳离子数目有限；因此，它的静电相互作用非常微弱。
作为参考，甚至TAT用大的阴离子作为复合物如DNA也会迅速溶解在血清蛋白中。
Bae和同事也提出了其中的TAT由pH敏感的聚组氨酸（polyHis）锚定到胶束表面的一个“pop-up”的方法。
聚组氨酸在pH7.4是难溶的，因此TAT被包埋在亲水层PEGk中；在酸性pH中，聚组氨酸开始具有水溶性，暴露TAT在胶束表面对于结合。
这个方法并不适用核内转运，然而：
当在细胞浆中pH大约在7.4，TAT部分将再次埋藏在PEG层中。
在这里，我们展示了小分子修饰方法在体内CPP的应用。
几乎所有的CPP含有赖氨酸残基;它们的伯胺是非特异性相互作用的主要原因，但它们也在膜转导和核定位功能中发挥关键作用。
一些β羧基酰胺在中性pH中是稳定，但在酸性pH很快水解再得到相应的胺。
我们因此假设，酰胺化的赖氨酸残基胺基对于酸不稳定可能使CPPs失活，抑制它们在血液中的非特异性反应。
在酸性肿瘤间质（pH<7）或细胞内/溶酶体（pH4-5）,酸不稳定的酰胺将被水解，CPPs被活化和显示它们的功能（如图1a）。
这个方法将使CPPs被应用在体内，尤其在传递系统中。
这一假说的关键问题是酰胺化赖氨酸残基胺基是否足以灭活CPP，因为它们还含有精氨酸残基，其阳离子基团不能容易地酰胺化。
这里我们选择富含精氨酸的TAT肽包含两个赖氨酸残基和五个精氨酸残基去测试我们合成的。
（如图1b）我们将TAT和酰胺化产物与聚乙二醇嵌接聚ε-已内酯胶束连接，比较体内和体外胶束功能化性质。
与TAT功能化胶束相反的是aTAT-PEG-PCL胶束在血液中没有非特异性反应，因此体内循环与非功能化PEG-PCL胶束相同。
更重要的是，aTAT-PEG-PCL的优先积聚在肿瘤组织中，其中aTAT在肿瘤的酸性胞外间质和溶酶体被再生为TAT;TAT恢复了功能在体内产生了不错的治疗功效。
图1.（a）一个细胞渗透肽（CPP）使用TAT作为例子插图证明，CPP在血液中失活和在肿瘤间质或体内肿瘤靶向药物传递细胞被激活。
CPP的赖氨酸残基胺基酰胺化后，抑制在血液中的非特异性相互作用，而不会影响纳米载体“隐身特性”。
当纳米载体溢出进入高渗透性血管产生EPR效应，酰胺键水解，CPP在酸性肿瘤细胞外液（pH值<7）恢复原功能快速细胞摄取或在酸性细胞内/溶酶体进行快速逃脱。
（b）TAT的伯胺酰胺化为琥珀酰胺和它们的遇酸水解。
结果与讨论
TAT酰胺化和胶束功能化。
TAT赖氨酸残基胺基被酸酐首先酰胺化，包括4-环己烯-1,2-二羧酸酐，2,3-二甲酐，和2,2,3,3-四甲基琥珀酸酐。
但是从这些酸酐的酰胺水解速度非常快，即使在中性pH值。
我们最终用过量的琥珀酰氯的酰胺化产生预期的产品（如图1b）。
如由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOFMS）（如图2a），aTAT和TAT之间的分子量差371,对应于三个琥珀残基三钠离子，这表明在除了两个赖氨酸残基的胺的琥珀酰胺的酰胺化，谷氨酰胺酰胺也酰胺化，得到琥珀酰亚胺，而胍基未受影响（如图1b）。
图2.（a）TAT酰胺化前后分子量通过MALDI-TOF测定。
分子量差对应3个OCCH2CH2COONa基团。
（b）aTAT在pH5.0和37oC下作出不同时间的HPLC曲线。
（c）ATAT官能化的聚乙二醇嵌段聚ε-己内酯装入重量13.6％多柔比星（DOX），通过动态光散射测定胶束（ATAT-PEG-PCL）的粒度分布。
（d）aTAT-PEG-PCL的形态使用透射电子显微镜（比例尺=200纳米）观察到，胶束用2％磷钨酸进行染色。
aTAT的稳定性通过HPLC在pH5.0监测水解来评价（如图2b）。
一些TAT被培养2小时后再生，而且几乎所有的aTAT在24小时转化为原始的TAT。
这是非常令人惊讶的，因为之前通过其他人和我们的工作发现伯胺在聚赖氨酸（PLL）琥珀酰胺和聚酰氨基胺树枝状聚合物在pH5.0或更低的pH几乎不水解。
我们推测在aTAT琥珀酰胺中的较大水解可能是由于相邻胍基的催化作用。
为了证明这个，我们将PLL伯胺胍化50％为2kDa的数均分子量和酰胺化的剩余的伯胺为琥珀酰胺。
在pH7.4胍基PLL琥珀酰胺是非常稳定的，但在pH5.0快速水解。
TAT和aTAT被PEG-PCL胶束功能化制作成TAT-PEG-PCL或ATAT-PEG-PCL的混合物。
优化后发现在胶束15mol%TAT-PEG-PCL或aTAT-PEG-PCL最适合比较胶束性质和接下来的研究。
胶束既可以用亲水染料DiR追踪也可以用抗癌药物多柔比星（DOX）进行治疗。
该aTAT-PEG-PCL胶束是在直径约70nm的磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）中，通过动态光测散射测量。
它们装载了13.6wt%阿霉素直径变成了75nm。
装载了14.3wt%DiR直径变成92nm。
这些尺寸是已知的最适合于被动积累到肿瘤组织中经由增强的渗透和保留（EPR）效应。
细胞内化和细胞内分布。
多柔比星装载的胶束细胞摄取通过流式细胞仪比较。
PEG-PCL/DOX胶束进入SKOV-3细胞是非常缓慢的（如图3a）。
在PEG-PCL/DOX胶束培养1或5小时，只有3.2或15.3％的细胞有荧光，几乎没有可测量的DOX的荧光。
然而，用TAT-PEG-PCL/DOX胶束，培养1小时后58.6%和培养5小时后73.7%细胞产生强烈的多柔比星荧光。
（如图3b）aTAT-PEG-PCL/DOX的细胞摄取是PEG-PCL/DOX非常相似，相比TAT-PEG-PCL/DOX明显要慢（如图3c）。
这就表明aTAT不能像TAT那样与细胞相互作用。
然而，当aTAT-PEG-PCL/DOX胶束在pH5.0下8小时，细胞摄取也和TAT-PEG-PCL/DOX一样快。
（如图3d）这表明胶束表面完全功能的TAT部分已经恢复。
如图3.DOX的阳性细胞群由SKOV-3卵巢癌细胞培养流式细胞仪测定
细胞摄取和随后胶束的细胞内分布通过共聚焦荧光显微镜研究。
我们我们用活细胞荧光显微镜研究。
尼罗红而不是DOX被用来跟踪胶束，因为DOX本身有效地集中在细胞核但尼罗红不会。
流式细胞仪和其他文献报到的是一致的，TAT-PEG-PCL/尼罗红的细胞摄取比PEG-PCL/尼罗红要快的多，更重要的是发现胶束在核膜上有点缀。
TAT-PEG-PCL/尼罗红细胞内化与PEG-PCL/尼罗红在培养初期是十分相似的（如图4a,b）。
在细胞培养后1小时，少数的aTAT-PEG-PCL/尼罗红胶束被观察，在细胞时培养时间延长至12或24小时越来越多的红点被发现（如图4c,d）。
内化胶束最初定位通过溶酶体，胶束的图像（红色，如图4e）和溶酶体（绿，如图4f）重叠图像就是黄色斑点（如图4g）证明胶束内化。
PEG-PCL的胶束表明，aTAT-PEG-PCL的纳米颗粒通过内吞作用途径进入细胞/溶酶体内，其中aTAT可以水解和再生为TAT。
培养5小时后，许多微胶粒不再位于细胞/溶酶体内（红点，如图4g），表明从细胞/溶酶体内成功逃逸。
此外，许多aTAT-PEG-PCL的胶束发现穿插在核膜（如图4c和细胞放大图在4h）。
这个现象是非常不同于PEG-PCL胶束，即使长时间培养仍然在细胞/溶酶体内和并未与细胞核有关联。
但是与TAT-PEG-PCL/尼罗红都横穿核膜。
这些发现一致说明TAT功能可以导致物质快速从细胞/溶酶体内逃脱和快速转运到细胞核周边区域甚至细胞核定位。
TAT，作为核定位信号（NLS），可以结合NPC和携带小物质进入细胞核。
一个NLS直径达39纳米通过核孔。
最近的研究表明TAT连接纳米分子小于50nm可以自由进出NPCs，当分子大于67nm就不行了。
然而，因为粒径过大（75nm），这些胶束不能进入细胞核，但是停靠在核孔。
图4.细胞吸收和ATAT-PEG-PCL/尼罗红胶束细胞内定位通过激光扫描共聚焦显微镜观察。
SKOV-3卵巢癌细胞和aTAT-PEG-PCL/尼罗红（尼罗红剂量1µg/mL）分别培养（a）1,（b）5,（c）12,和（d）24小时。
图h是细胞c的放大图。
aTAT-PEG-PCL/尼罗红的溶酶体共定位在细胞培育5小时，在37℃后，通过共聚焦显微镜观察至尼罗红信道（e）和溶血跟踪绿色通道（f）。
图（g）是图（e）和（f）重叠所得。
aTAT的胞内行为通过比较胶束传递DOX的细胞毒性进行探讨（如图5）。
DOX通过aTAT-PEG-PCL和PEG-PCL胶束对非耐药BCAP-37乳腺癌细胞展现出非常相似的细胞毒性，并且毒性远低于游离的DOX（如图5a）。
因为游离DOX可以非常迅速地扩散到非耐药细胞，诱导细胞毒性高，而这aTAT-PEG-PCL和PEG-PCL的胶束进入细胞以相似的慢速率（如图3），从而慢慢地递送DOX进入细胞。
然而，游离DOX在剂量小于8微克/毫升几乎没有表现出细胞毒性对DOX耐MCF-7细胞（如图5b），因为它们的使用多药耐药性的机制，这些细胞能有效地降低了细胞内的DOX积累。
胶束装载DOX可以绕过这些机制，并且，用半最大抑制浓度（IC50）2微克/毫升aTAT-PEG-PCL/DOX呈剂量依赖性细胞毒性，比PEG-PCL/DOX稍好。
为了增强细胞摄取和阐明TAT的再生，叶酸（FA）引入到胶束作为一个靶标基团。
叶酸可以和细胞膜上的叶酸受体结合，引发快速内吞进入溶酶体。
（FA/aTAT）-PEG-PCL胶束是PEG-PCL，ATAT-PEG-PCL和FA-PEG-PCL按85/15/10比例混合制成。
在叶酸的培养基中SKOV-3卵巢癌细胞过度表达诱导叶酸受体，进行了比较DOX由aTAT-PEG-PCL和（FA/aTAT）-PEG-PCL递送的细胞毒性。
如图5c中，（FA/ATAT）-PEG-PCL/DOX有细胞毒性比ATAT-PEG-PCL/DOX高得多，甚至游离DOX还要高，尽管该细胞系不是DOX抗性。
这种比较是与上面讨论的结果一致：
aTAT与细胞没有相互作用，因此，ATAT-PEG-PCL胶束非常缓慢地进入细胞/溶酶体内;然而，当进入细胞/溶酶体内，aTAT被有效地水解为TAT，导致快速溶酶体逃逸和核定位，其中DOX可以发挥其药理作用。
图5.DOX和胶束装载DOX的细胞毒性。
（a）非耐药BCAP-37乳腺癌细胞胶束，（b）DOX的抗性MCF-7乳腺癌细胞，（c）叶酸受体过表达SKOV-3卵巢癌细胞。
酰胺化的TAT体内稳定性和肿瘤靶向给药。
aTAT的体内稳定性通过监测相应胶束的血液清除为评价（如图6a）。
近红外荧光染料DIR，在胶束装载作为示踪剂，的DiR的激发和发射波长不与血液的自身荧光重叠，使得其浓度直接从全血荧光测定。
在与其他报告一致，静脉注射TAT-PEG-PCL胶束迅速地从血液中清除：
在注射后短短1小时，TAT-PEG-PCL/DIR的血液中的荧光几乎检测不到。
相比之下，aTAT-PEG-PCL/DIR与PEG-PCL/DIR有相似的非常缓慢清除轮廓。
这些结果表明，aTAT确实没有与血液成分造成非特异性相互作用，而在aTAT琥珀酰胺是在血液中非常稳定。
延长的血液循环时间应增强胶束从肿瘤血管经由EPR效应外渗进入肿瘤组织可能性。
在肿瘤组织累积和DOX由胶束递送的治疗功效随后使用异种移植物肿瘤模型测试（如图6b）。
给药aTAT-PEG-PCL/DOX小鼠的肿瘤生长比与TAT-PEG-PCL/DOX或PEG-PCL/DOX小鼠的要慢得多，并且15天之后这种差异变得更加显著（P<0.01）。
处死小鼠后，并将肿瘤称重，各组的肿瘤抑制率（TIR）进行相应计算。
47％的TIR是用aTAT-PEG-PCL/DOX处理的小鼠获得，相比PEG-PCL/DOX和TAT-PEG-PCL/DOX的TIRS分别是29和18％。
因此，aTAT-PEG-PCL/DOX与TAT-PEG-PCL/DOX和PEG-PCL/DOX相比表现出显著提高治疗效果（P<0.05）。
进一步观察通过共聚焦显微镜在DOX（图6c）激发波长肿瘤切片的显示，显示aTAT-PEG-PCL/DOX中DOX在肿瘤比其他要高。
DOX在匀浆解剖肿瘤的定量表明，aTAT-PEG-PCL/DOX治疗的肿瘤是PEG-PCL/DOX或DOX治疗的肿瘤2倍，是TAT-PEG-PCL/DOX中DOX浓度的8倍（如图6d）。
在DOX纳米粒的抗肿瘤机制通过组织学检查和免疫组化法进一步分析。
Hematoxylin/eosin（H&E）染色显示用PBS和TAT-PEG-PCL/DOX治疗的肿瘤细胞通常排列紧密,由于肿瘤生长迅速导致一些区域坏死（如图7a-e）。
然而，在DOX和aTAT-PEG-PCL/DOX的治疗的肿瘤观察到大量的细胞核的收缩和碎裂。
如图7a’-e’，末端转移酶缺口末端标记（TUNEL）染色，DOX和aTAT-PEG-PCL/DOX治疗的肿瘤有大面积的凋亡;这种细胞凋亡出现在PEG-PCL/DOX，与H＆E染色结果一致。
在三个凋亡细胞随机选择肿瘤截面图数据分析显示，DOX和aTAT-PEG-PCL/DOX细胞比PEG-PCL/DOX细胞更为活跃。
在这项研究中，DOX治疗伴随着小鼠体重下降，但aTAT-PEG-PCL/DOX组中没有被发现。
因心肌损伤产生不可逆的心脏毒性是DOX的治疗一种常见的副作用。
为了评估诱导DOX治疗的心肌损害，心肌组织学改变光镜下观察。
如图7a”-e”，PBS-，aTAT-PEG-PCL/DOX，TAT-PEGPCL/DOX，和PEG-PCL/DOX
治疗组心肌细胞排列紧密，但是DOX治疗组表现出对心肌细胞严重的伤害。
图6.（a）胶束的血液清除，（b）DOX和胶束装载DOX体内细胞抑制，和（c,d）DOX在肿瘤细胞的积累（c）通过聚焦显微镜观察（d）每克肿瘤组织中含有的DOX以微克计。
非常令人惊讶的是aTAT对本PEG-PCL胶束隐形性能没有影响，而大大提高了在肿瘤组织积累和DOX的治疗功效。
增强的肿瘤积累可能是由于由aTAT增强的细胞摄取，作为活性纳米载体。
纳米载体配体功能化，例如叶酸和整合ανβ3已经发现与未官能化的同行相比提高肿瘤积累，只是因为配位体可以结合其上的受体的肿瘤细胞和增强活性的纳米颗粒通过受体介导细胞摄取内吞作用。
在这项研究中，后aTAT-PEG-PCL胶束从血流渗出进入肿瘤组织，一些aTAT在pH值酸性肿瘤间质转化为天然的TAT，导致纳米颗粒的快速细胞摄取（见图3）和增强在肿瘤组织中的积累。
结论
用TAT作为一个例子，我们已证明本文所涉及阳离子CPPs的可逆阻断/活化的高效分子修饰的方法。
CPPs的赖氨酸残基酰胺化为琥珀酰胺可以有效地阻断其在体内的非特异性相互作用;一旦酰胺在酸性环境中被水解，如肿瘤细胞外液，或细胞/溶酶体内，CPPs的膜-转导和细胞核定位活性就完全恢复。
与阳离子电荷屏蔽的方法，CPPs酰胺化是非常稳定的，并已完全抑制在血液中的非特异性相互作用。
因此，再加上组织特异性靶向基团，这种方法可能大大拓宽CPPs在体内应用的大门。
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