食用植物油中痕量游离棉酚的超高效液相色谱串联质谱测定.docx
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食用植物油中痕量游离棉酚的超高效液相色谱串联质谱测定
食用植物油中痕量游离棉酚的超高效液相色谱-串联质谱测定
王雅朦郭咪咪魏征段章群张东李晓宁薛雅琳
（国家粮食局科学研究院,北京100037）
摘要：
本实验建立了超高效液相色谱-三重四级杆-串联质谱法（UPLC-ESI-MS/MS）测定食用植物油中游离棉酚的含量，实验以乙醇为提取溶剂提取食用植物油中的游离棉酚，采用WatersAQUITYUPLCBEHC18色谱柱进行分离，以乙腈-0.1%的甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱。
在电喷雾离子源（ESI）负离子模式和多反应通道监测（MRM）模式下进行定量分析。
结果表明：
棉酚的质量浓度在0.005~5.0μg/mL范围内线性关系良好，方法检出限LOD（S/N≥3）为10μg/kg，定量限LOQ（S/N≥10）为50μg/kg。
以0.25、2.5、25μg/g三个不同棉酚浓度进行加标后测得平均加标回收率为80.3%~112.6%，相对标准偏差小于11%，精密度0.42%。
该方法灵敏度高，测定结果准确，回收率稳定，适用于确证检测食用植物油中的棉酚残留。
关键词：
食用植物油棉酚超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号：
O657.63;TS207.3文献标志码：
A文章编号：
Determinationoffreegossypolinediblevegetableoilbyultraperformanceliquidchromatographywithtandemmassspectrometry
WangYameng,GuoMimi,WeiZheng,DuanZhangqun,ZhangDong,LiXiaoning,XueYalin,
（AcademyofStateAdministrationofGrain,Beijing100037）
Abstract:
Amethodwasdevelopedforthedeterminationoffreegossypolinediblevegetableoilbyultraperformanceliquidchromatographywithtandemmassspectrometry（UPLC-ESI-MS/MS）.Inthismethod,ethanolwasusedastheextractionsolventtoextractfreegossypolfromediblevegetable.TheseparationwascarriedoutonaWatersAQUITYUPLCBEHC18columnwithgradientelution.Acetonitrileandwater（containing0.1%（v/v）formicacid）wereusedasthemobilephase.Thedetectionwasachievedusingelectrosprayionizationinnegativeion（ESI-）modeandmultireactionchannelmonitoring（MRM）modeforquantificationoftheanalytes.Agoodlinearityforgossypolintherangeof0.005~5.0μg/mLundertheoptimalconditions.Thelimitofdetection（LOD,S/N≥3）was10μg/kgandthelimitofquantification（LOQ,S/N≥10）was50μg/kg.Theaveragerecoveriesofgossypolatthreespikedlevelsof0.25、2.5、25μg/gwere80.3%~112.6%withtherelativestandarddeviationlessthan11.0%,andthedegreeofprecisionwas0.42%.Withtheadvantagesofeasyandfastoperation,higherrecoveries,accurateresultsandgoodprecision,themethodwassuitablefortheconfirmationandquantificationofgossypolresidueinediblevegetableoil.
Keywords:
ediblevegetableoil,gossypol,ultraperformanceliquidchromatographywithtandemmassspectrometry（UPLC-ESI-MS/MS）
棉酚主要存在于锦葵植物棉花的种子、根皮及茎秆等色腺体中的一种黄色有毒多酚物质[1,2]。
我国拥有丰富的棉花资源，除小部分留作种用，大部分均用于榨油，在棉籽制油过程中，棉酚主要残留在棉籽油和棉籽饼粕中[3,4]。
研究表明，当棉籽油中游离棉酚含量过高会对动物的神经系统、血管组织、生殖系统等有毒害作用[5-7]，长期食用棉酚含量较高的棉籽油会引起中毒。
鉴于棉酚的危害，美国食品药品监督管理局和世界卫生组织分别建议将食品中游离棉酚的含量限制为450mg/kg和600mg/kg，我国要求棉籽油中游离棉酚的限量需小于等于0.02%[8,9]。
现如今我国毛油加工企业中有现代化的大型企业，也有遍布乡镇的榨油小作坊，榨油的技术水平差别很大，导致部分经精炼的棉籽油仍含有过量棉酚。
与此同时，由于食用植物油的品种、产量、营养价值等不同，其价格差异也非常大，这就导致一些不法经营者为谋取暴利而进行食用植物油掺假，如在芝麻油、花生油中掺入大豆油、棉籽油等低附加值食用油，2013年台湾爆发黑心油掺假事件，就是在橄榄油中掺入棉籽油，为此台湾地区卫生福利部将食用油中棉酚限量值规定为1mg/kg。
棉酚作为棉籽油的特征物质可以为不法商家以廉价棉籽油冒充高附加值食用油的佐证。
因此，该方法的建立旨在建立棉酚高选择性、高灵敏度的检测方法，鉴别是否在食用植物油中掺有棉籽油[10-12]。
目前游离棉酚常用的分析检测技术主要有分光光度法[13]、薄层色谱法[14]、高效液相色谱法（HPLC）[15,16]、高效液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）等[17]。
其中分光光度法操作简便，但是稳定性差，易受其它因素干扰；薄层色谱法使用设备简单，但是由于棉酚类似物较多，实验条件或处理方式不当会造成定量结果不准确；高效液相色谱法虽然得到广泛的应用，但该方法的检出限和定量限较高。
食品安全国家标准中数据显示，以植物油体样品取样1.0g时，该方法的检出限为2.5mg/kg，定量限为7.5mg/kg，检出限较高，不满足痕量棉酚的检测要求[18,19]。
HPLC-MS将色谱对化合物的分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度以及精准分析化合物分子结构等优点相结合，在检测痕量残留时具有很大的优势，UPLC是一种基于小颗粒填料的液相色谱技术，比传统的HPLC具有更高的分析能力，与质谱联用能够进行更加精确的测定[20,21]，该法的定量限可以低至50μg/kg，能满足目前市场的检测需求。
施琦贻等[22]建立了HPLC-MS法测定鲜蛋黄中的棉酚残留，该方法的定量下限为1ng/mL，棉酚含量在1~100ng/mL范围内线性关系良好。
张文华等[23]建立了HPLC-MS法测定饲料中棉酚的残留，方法的定量下限为1mg/kg，棉酚含量在10~100μg/L范围内线性关系良好。
Coward等[24]使用芹菜素作为内标，建立HPLC-MS内标法定量分析小鼠血浆中的棉酚类似物，该方法线性范围为10~2000ng/mL，加标回收率为90.8%±12.9%，精密度小于15%，但是目前采用液质联用法测定食用植物油中的游离棉酚至今鲜少有人报道。
本文旨在建立测定食用植物油中痕量棉酚的超高效液相色谱-三重四级杆-串联质谱测定方法（UPLC-ESI-MS/MS），对于推进食用植物油中痕量游离棉酚残留的有效监测具有重要意义。
1材料与方法
1.1材料与试剂
棉籽、食用植物油样品均来自于国内市场。
标准品：
棉酚（HPLC级，纯度≥95%，美国sigma公司）；乙醇、丙酮、乙腈、甲酸均为色谱纯。
1.2仪器与设备
TSQQuantumUltra三重四级杆质谱仪（搭配Acquity超高效液相系统）美国Thermo公司；AB204-S分析天平瑞士MettlerToledo公司；KQ5200DE超声发生器昆山市超声仪器有限公司；3-18KS高速冷冻离心机德国sigma公司；RotavaporR-215旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司；JSP-100型高速多功能粉碎机浙江省金德机械有限公司。
1.3试验方法
1.3.1标准溶液的配制
准确称取适量棉酚标准品，用丙酮溶解并定容，配成1mg/mL的标准储备液；用无水乙醇逐级稀释溶液至5,1,0.5,0.1,0.05,0.01,0.005μg/mL的梯度溶液。
用UPLC-ESI-MS/MS进行MRM扫描，绘制标准曲线。
1.3.2样品前处理
将不同产地的棉籽脱壳，粉碎机粉碎，过筛。
将经处理的棉籽放入锥形瓶中，按料液比1：
10加入正己烷，采用超声强化提取，过滤出渣，提取液于40℃减压蒸馏，即得粗制棉籽油。
准确称取食用植物油样品0.5000g于10mL离心管，加入2.5mL无水乙醇，涡旋振荡混匀，超声10min，静置分层2h，13000r/min高速离心10min，转移上清液至5mL容量瓶中，下层重复提取棉酚一次，合并上清液，定容，以备UPLC-ESI-MS/MS检测。
1.3.3色谱条件
WatersACQUITYC18柱（100×2.1mm,1.7μm），柱温25°C，流速为0.3mL/min，进样量5μL。
流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈。
洗脱梯度：
0~2min,50%B;2~3min,50%~90%B;3~8min,90%B;8~9min,90%~50%B;9~12min,50%B。
1.3.4质谱条件
电喷雾离子源（ESI）；负离子检测模式；喷雾电压3kV；鞘气（N2）压力60psi；辅气（N2）压力5psi；去簇电压-121V；离子传输毛细管温度300°C；MRM多反应离子扫描模式，定量离子对为m/z517/231（碰撞电压45V），定性离子对为m/z517/471（碰撞电压33V）。
2结果与分析
2.1标准溶液稳定性考察
棉酚是一种不稳定的多酚羟基联萘醛类化合物，易溶于绝大多数有机溶剂，如丙酮、乙醇、乙醚、甲醇、乙腈等，难溶于低沸点的石油醚和水。
为了选择合适的标准品溶剂，本文对棉酚在不同溶剂中的稳定性进行考察。
将配制好的5μg/mL棉酚乙醇溶液、甲醇溶液、丙酮溶液和乙腈溶液分别放置在室温下和4℃条件下保存，分别在第1,2,3,4,5和8天的同一时间测定棉酚含量，图1（A）和图1（B）所示。
棉酚在乙腈和丙酮溶液中最为稳定，甲醇中最不稳定。
对比图1（A）和图1（B）可以发现，相同棉酚溶液分别放置在室温和4℃时，温度越低稳定性越好，这与文献报道的分别测定棉酚甲醇溶液、乙醇溶液、乙腈溶液、丙酮溶液在5℃和22℃下的半衰期结果相符[25]。
因此，选用丙酮作为配制标准品储备液的溶剂，并将配制好的储备液于4℃保存，后采用无水乙醇逐级稀释至梯度溶液，用UPLC-ESI-MS/MS进行MRM扫描，并绘制标准曲线。
图1不同溶剂中的棉酚标准溶液在4℃（A）和室温（B）下的稳定性
2.2提取溶剂的选择
研究表明，无水乙醇、无水甲醇、乙腈和丙酮对食用植物油中的棉酚具有良好的溶解性和提取能力[26-28]，本文为选取适合植物油中棉酚提取的提取溶剂，对上述溶剂的棉酚提取效率进行考察，4种溶剂的提取回收率均大于70%，其中丙酮和乙醇的要优于乙腈和甲醇，但考虑到丙酮溶剂毒性较大且对油脂溶解度较高，导致提取液中杂质较多，因此本实验选用无水乙醇作为提取溶剂。
本实验也对提取次数对于提取回收率的影响进行探究，将棉酚标准溶液加入至已知棉酚浓度的棉籽油样中，使得棉酚标准品在提取液中的终浓度为1μg/mL，计算不同提取次数的提取回收率。
结果表明，提取一次，棉酚的平均提取回收率为75.48%，提取两次，棉酚的平均提取回收率为91.46%，随着提取次数的增加，棉酚的提取回收率增高，因此本文采用两次提取方式。
2.3棉酚检测条件优化
2.3.1质谱条件的优化
实验将1μg/mL的棉酚标准溶液通过蠕动泵打入质谱，分别在ESI源的正离子模式和负离子模式下进行离子监测，该物质在负离子模式下，棉酚的准分子离子峰（m/z）517具有较高的响应值且背景干扰低。
同时对离子化温度，喷雾电压，离子传输毛细管温度等各质谱参数进行自动优化，得到最优参数，棉酚的一级扫描质谱分析如图2所示，化合物的准分子离子峰[M+H]-为m/z517。
同时对碰撞能量进行优化，碎片离子峰的质荷比包括231,471,489,259。
其中如图3显示离子对517/231的响应为最高，确定为定量离子对；离子对517/471的响应其次，确定为定性离子对，其二级扫描质谱分析如图3所示，碎片离子峰与化学结构进行一一对应。
图2棉酚的一级全扫描质谱图
图3棉酚的二级全扫描质谱图
2.3.2色谱条件的优化
通常流动相的组成和添加剂会直接影响目标化合物的保留时间和峰形，还会影响目标化合物离子化效率，进而影响灵敏度。
本实验对甲醇-0.01%甲酸，乙腈-0.01%甲酸，乙腈-0.1%甲酸等多种流动相体系进行一系列预实验，其中使用甲醇-0.01%甲酸和乙腈-0.01%甲酸作为流动相，色谱峰的峰形均有拖尾，而乙腈-1%的甲酸峰形并无太大改变。
结果表明，用乙腈-0.1%甲酸做流动相色谱峰保留时间适中，峰形良好且信噪比较低。
由于食用植物油的基质较为复杂，选用梯度洗脱能有效的分离不同组分且峰形良好。
根据以上分析，最终选用乙腈-0.1%甲酸为流动相，梯度洗脱模式，棉酚的MRM扫描离子流图如图4所示，棉酚的出峰时间为5.48min。
图4棉酚标准品的多反应监测（MRM）色谱图
2.4方法学考察
2.4.1线性关系、检出限和定量限的考察
取一系列棉酚标准工作溶液（0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5μg/mL），进样量为5μL，以峰面积和质量浓度C（μg/mL）绘制标准曲线（如图5所示），得到线性回归方程为Y=9070890.978X，R2=0.9999。
表明棉酚在0.005~5μg/mL范围内，线性关系良好。
按信噪比（S/N）大于等于3计算，本方法的检出限（LOD）为10μg/kg，按信噪比（S/N）大于等于10计算，本方法的定量限（LOQ）为50μg/kg。
图5棉酚的标准曲线
2.4.2精密度、重复性和加标回收率
取0.02μg/mL的棉酚标准溶液5μL进入UPLC-ESI-MS/MS分析，在同一条件下连续进样6次，测得峰面积分别为157550,158719,158425,158930,157807,157315，峰面积的相对标准偏差（RSD）值为0.42%（n=6），表明仪器的精密度良好。
称取1号样品（产地山东的粗制棉籽油）6份，按照1.3的方法进行样品前处理并采用UPLC-ESI-MS/MS进行分析，记录峰面积分别为645.03,658.42,650.52,648.69,648.22,621.03。
RSD结果为1.97%（n=6），表明该方法的重复性良好。
取1号样品（产地山东的粗制棉籽油），向样品中添加0.25、2.5和25μg/g的棉酚标准溶液，每个添加水平重复测定6次，计算各个添加水平的回收率。
同时，为了能扩大应用范围，为以后食用植物油掺伪提供技术支持。
取一级橄榄油、大豆油、芝麻油样品0.5000g，添加0.25、2.5和25μg/g的棉酚标准溶液，分别按照1.3的方法进行样品前处理，UPLC-ESI-MS/MS分析，提取液进入液质联用产生的离子流图如图6所示，各个添加水平的回收率见表1。
所有样品的回收率在80.3%~112.6%之间，相对标准偏差在2.4%~10.7%之间，表明该方法具有较好的准确度和精密度。
图6不同样品基体中添加棉酚的多反应监测（MRM）色谱图
注:
不同样品基体中添加棉酚的MRM色谱图A.空白棉籽油样品；B.添加棉酚后的棉籽油样品；C.空白橄榄油样品；D.添加棉酚后的橄榄油样品；E.空白芝麻油样品；F.添加棉酚后的芝麻油样品；G.空白大豆油样品；H.添加棉酚后的大豆油样品。
表1不同样品基体中棉酚的回收率和相对标准偏差（n=6）
样品
添加水平/μg/g
回收率/%
平均回收率/%
相对标准偏差/%
棉籽油
0.25
90.8~104.5
96.5
5.1
2.5
92.5~103.2
98.2
4.6
25
91.2~95.8
93.1
1.6
橄榄油
0.25
95.4~111.7
102.2
5.4
2.5
83.7~102.3
90.1
7.7
25
83.8~93.0
88.7
4.0
芝麻油
0.25
87.2~112.6
94.5
10.0
2.5
80.3~85.9
82.9
2.4
25
86.8~103.6
98.4
6.4
大豆油
0.25
82.6~96.9
86.8
5.9
2.5
82.9~109.3
91.3
10.7
25
88.4~99.4
94.8
4.5
2.5样品测定
对5种不同棉籽油中的棉酚含量进行测定，每个样品取2份，按照1.3的方法进行样品前处理，UPLC-ESI-MS/MS分析，结果见表2。
样品3-5三种精炼成品油中均含有微量游离棉酚，其含量小于8μg/g，远小于标准规定限量值0.02%。
粗制棉籽油中游离棉酚含量有较大差别，其中样品1（来自山东的粗制棉籽油）的棉酚含量较高，达653.6μg/g，样品2（来自河北的粗制棉籽油）的棉酚含量较低为263.1μg/g。
表2不同样品中游离棉酚的含量（n=2）
实测棉酚的含量
/μg/mL
样品中棉酚含量
/μg/g
平均值
/μg/g
相对标准偏差
/%
样品1
（山东粗制棉籽油）
2.65
658.42
653.6
1.1
2.61
648.69
样品2
（河北粗制棉籽油）
1.05
262.19
263.1
0.5
1.06
263.94
样品3
（棉籽成品油）
0.022
2.09
2.0
2.9
0.021
2.01
样品4
（棉籽成品油）
0.050
4.84
4.8
0.3
0.050
4.86
样品5
（棉籽成品油）
0.080
7.68
7.6
1.9
0.076
7.48
3结论
本研究采用UPLC-ESI-MS/MS分析方法定量分析食用植物油中的痕量棉酚，采用无水乙醇为提取溶剂，外标法定量。
结果表明该方法的检出限可达10μg/kg，定量限达50μg/kg，远低于目前常用棉酚检测方法的检出限，可以精准测定精炼后植物油中的棉酚含量。
该方法灵敏度高，分离效果好，重现性好，回收率稳定。
为监测食用植物油中痕量游离棉酚的残留，采用液质联用技术开展食用植物油真实性判别和探索工作提供技术支持。
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