花卉组织培养技术资料.docx

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花卉组织培养技术资料

花卉组织培养技术

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2009-5-1316:

39:

54来源：

青岛海博生物

1、应用价值

   花卉组织培养，就是分离花卉植物体的一部分，如茎类、茎段、叶、花、幼胚等，在无菌试管，并配合一定的营养、激素、温度、光照等条件，使其产生完整植株。

由于其条件可以严格控制，生长迅速，1-2个月即为一个周期，因此在花卉植物的生产上有重要应用价值。

   快速大量繁殖方面：

对一些难繁殖的名贵品种花卉及一些短期内大量急需生产的花卉，应用很广。

兰花、菊花、唐菖蒲等花卉利用腋芽增生，短期得到大量植株。

非洲紫罗兰可通过叶片，水仙可通地鳞片，诱导产生不定芽，来达到大量繁殖的目的。

   花卉育种方面：

百合、鸢尾等许多花卉可以进行远缘杂交，由于生理代谢等方面的原因，常使杂种胚早期败育，因而得不到杂种植物。

而在试管中进行胚培养，可使其顺利生长，得到远缘杂种。

此外还可采用愈伤组织诱变、花粉培养等多种方法，来进行花卉育种。

   培育无病毒苗方面：

菊花、唐菖蒲、水仙、郁金香、大丽花等一大批花卉靠无性繁殖法繁殖，病毒逐代传递积累，危害日趋严重。

而分离花卉植物0.1-0.5毫米大小的生长点，培养得到的基本上是无病毒苗。

2、花卉组织培养对实验室及设备的要求

   花卉组织培养是在人工控制的条件下培养花卉。

实验室方面

①化学实验室：

主要承担配制培养基的任务。

要求具有各种化学药品试剂、各种玻璃器皿、称量天平等。

②洗涤室：

主要进行玻璃器皿的洗涤，要求有自来水装置，同时有烘箱，以便洗后烘干。

③灭菌室：

主要进行培养基和用具的消毒。

要有高压灭菌锅，具有水源和电源。

④接种室：

是花卉材料分离、消毒接种和转移的场所。

要求密闭、清洁、整齐、装有紫外灯，能随时灭菌。

有的也可用接种箱或超净工作台代替。

⑤培养室：

是花卉材料培养生长的地方。

要求清洁，保温好，室温均匀一致，并有绝热、防火性能。

设备方面

①天平：

供配制培养基时称量药品和激素用。

大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。

② 酸度计：

测定培养基的pH用。

③高压灭菌锅：

是供培养基和器械用具灭菌用。

④烘箱：

洗净的玻璃器皿干燥灭菌用。

⑤蒸馏水制造装置：

得到纯净水供培养用。

⑥冰箱：

供贮放母液和植物材料用。

⑦接种箱或超净工作台：

为植物材料接种或转移的操作场所。

⑧空调机：

控制室温用。

3、花卉组织培养对培养基的要求

   培养基主要成分是水，其他还有大量元素、微量元素、维生素、生长调节物质、蔗糖和琼脂等。

   目前花卉组织培养中应用最多的为MS培养基。

其他生长调节物质要根据花卉的种类和培养目的而确定。

MS培养基中大量元素浓度过高，为此常采用1/2、1/4大量元素浓度作培养用，这样生长效果列好。

    配制培养基前要准备好三角瓶、试管、烧杯、量筒、吸和等玻璃器皿，预先称好药品。

配制时先将琼脂溶化，再加入在水中深解的各种营养元素和蔗糖，然后用氢氧化钠或盐酸调整培养基的pH，一般掌握在5.7左右。

以后可分注到养瓶中，盖好瓶盖。

培养基配好要经高压灭菌。

冷却后放到培养室预培养3天，如没有杂菌污染，才可进行花卉材料的接种。

4、花卉组织培养的过程

   花卉植物组织培养即无菌培养，也就是要求培养的材料不带有杂菌。

从田间或温室等地切取花卉材料时，应选择健壮无病虫母株，取幼幼嫩、分生能力强的部位，以利生长。

   取来的材料虽经选择，外部还有不少杂菌。

为此，接种前应进行表面灭菌。

通常先用自来水冲洗十几分钟，有泥的应刷去。

冲洗干净后，用70%的酒精浸泡10-15秒钟消毒。

接着用无菌水（经高压灭菌的蒸馏水）冲洗两次，再用10%的漂白粉澄清液浸泡20分钟消毒，最后用无菌水冲洗3-4次。

带有茸毛不易湿润消毒的材料可加些洗衣粉。

上述操作皆应在接种箱或超净工作台等无菌环境条件进行。

经过表面灭菌的材料，用无菌滤纸将水吸掉。

再用解剖刀切取所需部位，通常几毫米大小，培育无病毒苗则应在1毫米以下，然后用解剖针或枪式镊子将材料接种到培养瓶上培养。

工具用完即应在95%酒精中蘸一下，或用火焰消毒法消毒，避免工具带菌造成交叉污染。

操作时应穿工作服、戴工作帽，事先洗净手，后再用酒精棉擦试一遍。

5、花卉组织培养材料的培养和移植

   花卉材料接种后放到培养室培养。

培养室是花卉材料培养生长的场所，一般几到十几平方米皆可。

高度约2米左右，空间小，可节省控温能源。

培养材料放在培养架上培养。

培养架可有木材或金属制成，有4-5层，每层高40-50厘米，日光灯装在上方。

架长1.2米左右，与40瓦日光灯长一致，宽80-90厘米。

每一层可装两支日光灯，这样培养时的照度约为3000勒克斯。

培养室的温度大多采取昼夜恒温培养，保持在25℃±2℃，也有采取昼夜变温培养的，夜晚温度可低些，这应根据花卉生长需要而定。

每天日光灯照明12-16小时。

    花卉试管苗由于人工提供各方面优越条件，一般生长发育好，根系也多，可往往由于没掌握其特性，造成移栽时成活率不高。

这是因为试管苗在瓶中湿度很高的条件下培养，人为提供蔗糖等碳源，花卉材料是处一起异养生活状态，可以说比温室生长的花卉还要娇嫩得多。

而突然从瓶中移到土壤让其过自养生活，往往由于变化太剧烈而造成损伤甚至死亡。

为此，花卉试管苗开始移出时，仍应罩上玻璃瓶，或盖上薄膜袋（上开几个小孔），1周后去掉。

有喷雾条件则更理想。

开始7-10天要遮荫，以后逐渐见阳光。

移植基质以沙与蛭石各半为好，要排水、通风好，隔一天浇一次营养液。

这样逐步锻炼，让其适应环境。

2-3周后经驯化锻炼苗即可移至培养土中栽植。

玫瑰组织培养

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2009-5-1316:

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1 玫瑰组织培养的意义

1.1 快速繁殖

    玫瑰有性生殖能力差，大多观赏价值高的品种不形成种子，种子繁殖不现实。

而玫瑰实生苗观赏价值较差，因此生产上必须通过野蔷薇扦插再嫁接进行繁殖。

利用组织培养技术可以实现玫瑰优良品种的快速繁殖，并且能保持原有的优良性状不变。

玫瑰组培增殖系数为４～５，半年至一年内能获得上百万种苗。

1.2 获得无病毒植株

    玫瑰在生长过程中，能感染一种或数种病毒或类病毒。

长期营养繁殖，如扦插、嫁接、分株，不仅不能脱毒，反而使病毒积累，严重影响玫瑰的品质，导致玫瑰观赏价值下降，比如花径变小、色泽变淡、产花减少、斑点较多、花形不规则、易感染病虫等。

通过组织培养技术，利用玫瑰茎尖脱毒后，使玫瑰的种性得到复壮，生长势增强，花径增大，色泽鲜艳，抗病能力提高，产花量上升。

1.3 培育新品种

    在组织培养过程中往往会发生芽变，芽变的结果导致花色变异、花的大小变异、花期变异、叶色变异、染色体数量变异等。

在组织培养过程中，一旦发生芽变，准确切取变异芽，并将其繁殖成完整植株，可产生有特殊观赏价值的新品种。

1.4 种质资源的保存

    玫瑰种质资源丰富，按传统方法保存种质资源占地面积大，且资源易受人为因素和环境因素的破坏而丢失。

用组培方法，用极小的空间就可长期有效地保存玫瑰的种质资源。

2 玫瑰组织培养的方法

2.1 外植体选取

    从生长在田间或盆栽的优良品种植株上，选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎。

取材最好在晴天正午，并且取用植株上部的幼茎。

阴雨天或靠近地面的幼茎，表面污染较为严重，难于消毒。

玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外，也可以用叶片、叶柄、根、茎、原生质体、胚、花药、子房、花萼和花托做外植体。

2.2 消毒灭菌及无菌苗的建立

    取玫瑰外植体，用5%～10%的次氯酸钠浸泡10～30min或用01%～02%的HgCl浸泡5～15min。

用无菌水清洗7～10次后接种。

也可先用75%的酒精浸泡20～30s再采用上述方法消毒。

消毒灭菌完毕后，将幼茎切割成05～10cm长的至少带有一个节的切段，接种于培养基中。

2.3 愈伤组织的诱导

    最早报道从杂交茶香月季的茎上诱导了愈伤组织，该实验证明在培养基中添加2，4-D或添加NAA和激动素KT均能很快诱导出愈伤组织。

随后不同实验以不同品种为试验材料，从叶、叶柄、根、茎、原生质体、合子胚、花药、子房、花瓣、花萼、和花托成功地诱导了愈伤组织。

2.3.1 愈伤组织的成功诱导与品种的基因型有关

2.3.2 外植体类型：

不同外植体愈伤产生的能力不同，叶为90%，根为70%，节间为55%，花药为19%。

2.3.3 激素

      Rout等（1991）以Landora为材料，在添加BA和NAA，2，4-D的MS的培养基上，外植体在接种的7～12d后，在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤，愈伤组织诱导频率高达92%。

在接种后15～20d，外植体茎切端处产生愈伤，诱导率为76%。

生长素种类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大。

早期实验多采用NAA结合BAP或BA等，近年来多采用2，4—D，并证明2，4—D是诱导愈伤的必要因素（Kintzios等，1999；Rout等，1996；van der Salm等，1996；Vises—suwan等，1997）。

进一步研究发现2，4-D对愈伤的诱导效果依赖于月季的基因型，如2，4—D浓度从113umol/L增加到181umol/L降低了Rose hybrida栽培种“Care-freeBeauty”的愈伤诱导频率，但该浓度则对另一个品种“Grand Gala”无影响。

对于“Red Sunblaze”而言，当浓度从113umol/L增加到452umol/L，则表现出愈伤的诱导率提高了，随后当2，4—D再增加，则显著地降低愈伤的诱导频率。

愈伤组织在诱导愈伤组织的培养基上能得到很好继代培养（subculture、Li等，2002）。

Van der Salm等（1996）证明2，4—D对诱导Rose persica与xanthina和Moneyway产生愈伤是非常必要的，进一步添加低浓度的BA有正效应，但如BA浓度过高，则产生抑制作用。

与以上实验结果不同，Kintzios等（1999）则发现2，4—D对愈伤诱导有负影响作用，可能因为采用的外植体是成熟的叶片。

2.3.4 合子胚的发育时期对愈伤的形成能力也有影响

      处于心形胚的合子胚，其愈伤诱导率只有2%，子叶胚时的合子胚愈伤诱导率达到85%。

2.4 不定芽的诱导

    月季的常规繁殖方式主要靠扦插、嫁接和压条等，繁殖系数低，远远满足不了生产的需要。

80年代初，采取组织培养方法快速繁殖月季苗，用侧芽、顶芽、并诱导生根。

2.5 增殖培养

    玫瑰的增殖培养，一靠无菌苗切段繁殖，二靠诱导不定芽，形成从生苗；三靠愈伤组织形成体细胞胚或原球胚。

将已长大的月季嫩茎切成带1～2个节的茎段，投入新鲜的增殖培养基上，5～6周进行一次继代增殖，增殖系数平均达4～6。

在外植到培养10～15d内第一叶的叶原基伸长，第二叶片叶原基可见；15～20d侧芽伸长；25～30d长度达6～10mm，继代增殖会按几何级数增长起来。

增殖培养基可用不定芽诱导培养基，如MS+BA03～05+NAA0004～03mg/L。

2.6 壮苗与生根

    壮苗培养的培养基为：

MS+BA03～05+NAA001～01或MS+BA03～05+IBA03。

 也可以壮苗为主，增殖为辅，使增殖与壮苗合二为一。

玫瑰组培苗增殖与壮苗需光照10～12h，光照强度2000lx，温度24～26℃。

    一般情况下，玫瑰茎段组织培养8～10d内则可生根。

加入适量的活性炭有利于玫瑰生根。

2.7 炼苗与大田移栽

    炼苗和大田移植是玫瑰微繁殖获得成功的最后阶段。

组培幼苗由人为培养环境转移到天然生长环境中，环境条件发生巨大变化，湿度大幅度降低，温度不恒定，光照强烈，微生物多，故需炼苗过渡。

一般玫瑰微繁殖炼苗需经过室内三天的取盖炼苗，然后将苗从瓶中取出，洗去根部培养基，定植在珍珠岩、泥炭、蛭石或沙土中，用3～5%的多菌灵喷洗。

炼苗时要注意基质中的水分含量，水分太少，不能满足苗生长发育；水分太多，导致烂苗。

炼苗中、后期要注意通气，给予足够的光照，其幼苗成活率可达80％以上。

3 玫瑰组织培养中应注的问题———褐化现象

  褐化现象是指外植体在培养过程中切口产生的多酚类物质被氧化成褐色的醌类物质毒害植物自身，导致培养材料褐变死亡的现象。

玫瑰在组织培养中褐化现象严重，可采取以下措施：

3.1 采用适宜的外植体 比如实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等，在取外植体之前对母树进行遮光处理20～40d。

3.2 适宜的无基盐分 适宜的无基盐分，降低蔗糖浓度，降低激素水平，加吸附剂05%～25%的活性炭可以减轻材料的褐变。

3.3 在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂 如有机酸、蛋白质水解产物，氨基酸，硫脲，二氨基二硫化甲酸钠，亚硫氢酸钠，氰化钾，二硫苏糖醇多氨等，可有效的抑制褐变。

3.4 反复转移，降低温度，进行暗培养，增大培养基硬度，是控制褐常用且有效的方法。

在进行植物组织培养中用到的术语

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2009-5-1316:

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1、植物组织培养（Plant Tissue Culture）：

 是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。

（主要有原生质体（Protoplast），悬浮细胞，组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织），器官（胚，花药，子房，根和茎）的培养。

其中最常见的是愈伤组织培养。

2、愈伤组织（Callus）：

 原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

3、植物细胞全能性（Cellular totipotency）：

 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力（Haberlandt, 1902）。

4、微（快）繁步骤（micropropagation）：

 母株（完整）→外植体（母株的一小部分，种子亦可）→接种到培养基上→长芽（继代增殖）→长根（试管外生根亦可）→练苗，驯化→完整植株

微生物鉴别方法：

传统方法

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2009-5-2116:

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1、形态学特征

（1）细胞形态

   在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。

（2）群体形态

    群体形态：

在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。

如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。

2、生理生化反应特征

（1）利用物质的能力

    对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。

（2）代谢产物的特殊性

    如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。

（3）与温度和氧气的关系

    测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。

对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。

3、生态学特征

   主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。

在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。

4、血清学反应

   很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。

虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下（如电子显微镜或生化反应），仍无法分辨它们。

然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，就可用来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型。

    用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的对象是否发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。

    该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。

利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎链球菌等菌分成数十种菌型。

5、生活史

   生物的个体在一生的生长繁殖过程中，经过不同的发育阶段。

这种过程对特定的生物来讲是重复循环的，常称为该种生物的生活周期或生活史。

6、对噬菌体的敏感性

   与血清学反应相似，各种噬菌体有其严格的宿主范围。

部分植物组培培养基配方（六）

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2009-5-1315:

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青岛海博生物

1、尿囊素无机盐培养基 （DSM 6） 

K2HPO4      0.8g     KH2PO4      0.2g 

MgSO4.7H2O  0.5g     CaCl2.2H2O  0.05g 

FeSO4.7H2O  0.01g    MnSO4.H2O   1.0mg 

尿囊素      20.0g    琼脂        15.0g 

蒸馏水 1000ml 

2、碱性营养琼脂培养基 （DSM 31） 

蛋白胨 5.0g       牛肉膏 3.0g 

琼脂   20.0g      蒸馏水 1000ml 

灭菌后,加入无菌的1M Na - Sesquicar - bonate溶液：

（1:

10v/v），至pH9.7。

Na - Sesquicarborbonate 溶液：

NaHCO3  4.2g     Na2CO3   5.3g    蒸馏水 100.0ml 

3、Trypticase Soy 琼脂培养基

酪蛋白胨     5.0g      豆粉蛋白胨     5.0g 

NaCl         5.0       琼脂           15.0g 

蒸馏水       1000ml    pH 7.3 

4、（IFO 203） 

蛋白胨   10.0g     酵母膏 5.0g 

肝浸出液 25.0g     葡萄糖 3.0g 

甘油     15.0g     NaCl   3.0g 

琼脂     20.0g    蒸馏水定容至 1000ml 

pH 7.2 

5、（IFO 231） 

酵母膏 1.0g     牛肉膏 1.0g 

NZ胺   2.0g     麦芽糖 10.0g 

琼脂   20.0g    蒸馏水 1000ml 

pH 7.3 

6、（SEM） 

蔗糖           10.0g     K2HPO4   0.5g 

MgSO4.7H2O     0.2g      MgCl2    0.2g 

CaCO3          1.0g      酵母膏   0.4g 

琼脂           20.0g     蒸馏水   1000ml 

pH 7.0-7.2 

注：

用无水MgSO4量减半 

7、（无氮M） 

酵母膏 1.0g     土壤浸汁液 200g 

琼脂   20.0g    蒸馏水     800g 

甘露醇 10.0g     pH 7.2 

土壤浸汁液制法：

取沃土50g加水200ml，15磅灭菌1小时，过滤取滤液，加水到200ml。

 8、（BPY） 

牛肉膏 5.0g    酵母膏 5.0g 

葡萄糖 5.0g    蛋白胨 10.0g 

NaCl   5.0g    琼脂   20.0g 

蒸馏水 1000ml  pH 7.2 

部分植物组培培养基配方（五）

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30来源：

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1、固氮螺菌培养基 （ATCC 838） 

K2HPO4          0.1g     KH2PO4        0.4g 

MgSO4.7H2O      0.2g     NaCl          0.1g 

CaCl2           0.02g    FeCl3         0.01g 

NaMoO4.2H2O     0.002g   苹果酸钠      5.0g 

酵母膏          0.05g    蒸馏水        1000ml 

pH 7.2-7.4 

2、BG-11 

NaNO3               1.5g         K2HPO4           0.04g 

MgSO4.7H2O          0.075g       CaCl2.7H2O       0.036g 

Na2CO3              0.02g        柠檬酸           0.006g 

柠檬酸铁            0.006g       微量元素溶液 A5  1ml 

氨苄青霉素 （终浓度） 50μg/ml      蒸馏水           1000ml 

琼脂 20.0g 

* 微量元素溶液 A5：

H3BO4        2.86g    MnCl2.4H2O     1.81g 

ZnSO4        0.222g   Na2MoO4        0.39g 

CuSO4.5H2O   0.079g   Co（NO3）2.6H2O  49.4g 

3、（Marine Agar） 

蛋白胨       5.0g      酵母膏    1.0g 

柠檬酸铁     0.1g      NaCl      19.45g 

MgSO4.7H2O   5.9g      KCl       0.55g 

Na2SO4       3.24g     CaCl2     1.8g 

NaHCO3       0.16g     KI        0.08g 

微量元素     10ml      pH 7.0-7.6 

*微量元素溶液：

氯化锶   0.034g        硅酸钠  0.004g 

蒸馏水   1000ml        H3BO4   0.022g 

NaCl     0.0024g       NaNO3   0.0016g 

NaHPO4   0.008g        蒸馏水  1000ml 

4、（Yeast Starch Agar）

酵母膏 2.0g      可溶性淀粉 10.0g 

琼脂   20.0g     蒸馏水     1000ml 

pH 7.2-7.4 

5、GYMC 

葡萄糖 4.0g  酵母膏 2.0g 

麦芽汁 20.0g 琼脂   20.0g 

CaCO3  1.5g  蒸馏水 1000ml 

pH 6.8-7.0 

6、 LCSB 

乳糖          15.0g    玉米浆       5.0g 

蛋白胨        5.0g     NaCl         4.0g 

MgSO4.7H2O    0.5g     KH2PO4       0.6g 

FeCl3.6H2O    0.005g   CuSO4.5H2O   0.002g 

琼脂          20.0g     蒸馏水      1000ml 

相对湿度 65%           pH 4.8 

7、Tep尿液（Uric Acid）琼脂（ATCC 894） 

Na2HPO4.12H2O    9.