省卫生厅申请书F剖析.docx
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省卫生厅申请书F剖析
课题合同号
课题申请号
湖南省卫生厅科研基金课题申请书（合同书）
上册
课题名称:
VEGF反义寡核苷酸抗骨肉瘤
血管生成治疗的实验研究
申请单位:
课题负责人:
联系电话:
申请日期:
计划周期:
2004年4月至2006年12月
省卫生厅制
一、数据库信息
课题名称
（25字内）
VEGF
反
义
寡
核
苷
酸
抗
骨
肉
瘤
血
管
生
成
治
疗
的
实
验
研
究
所属学科
医学
课题性质
1-基础研究2-应用研究3-试验发展4-软科学研究
1
课题类别
1-重点2-一般3-指导4-青年基金
1
申请单位
邮政编码
421001
课题负责人
1-男性2-女性
1
性别
出生年月
年
月
民族
技术专长
骨外
学位
2
1-博士2-硕士
3-学士4-其它
职称
1-正高2-副高
3-中级4-初级
2
政治面貌
06-民建会员07-民进会员08-农工党党员
09-致公党党员10-九三学社社员11-台盟盟员
12-无党派民主人士13-群众
01-中共党员02-中共预备党员
03-共青团员04-民革会员05-民盟盟员
01
文化程度
30-中专31-中专毕业32-中技毕业
40-技工学校41技校毕业49-技校肄业
50-高中51-高中毕业59-职业高中毕业
60-初中61-初中毕业69-职业初中毕业
70-小学71-小学毕业79-小学肄业
00
00-研究生02-研究生毕业09-研究生肄业
10-大学本科11-大学毕业12-大学肄业
20-大专21-专科毕业29-专科肄业
人员分类
1-中医人员2-西医人员3-西学中人员
4-中药人员5-西药人员6-医技人员
7-护理人员8-其他人员
计划周期
2004年4月至2006年12月
申请经费
5
万元
拨款类型
1-A2-B3-C
本研究设计并合成VEGF反义、无义寡核苷酸，拟通过VEGF反义寡核苷酸
对内皮细胞的生长抑制实验、骨肉瘤细胞VEGFmRNA及蛋白质表达的抑制实验
及对骨肉瘤的治疗实验，明确不同浓度的反义VEGF对内皮细胞生长的抑制情
况，对骨肉瘤VEGF的抑制作用及与其对骨肉瘤的治疗作用，明确①反义VEGF
抗骨肉瘤血管生成治疗的疗效，和其与传统化疗药物的关系（协同、拮抗），
为临床骨肉瘤的治疗提供可靠的实验依据②反义VEGF抗血管生成作用与
细胞增殖、凋亡的关系，从而探讨反义VEGF抗血管生成的机制。
预期具有较
高的临床应用价值。
课题申请号
合同号
评审结果
1-批准列入计划
2-批准列入计划，但科研方案需做修改
3-不批准列入计划
批准资助经费
万元
偿还经费
万元
二、课题申请单位、合作单位及分工
三、课题主要研究人员情况（请从课题负责人开始依次填写）
序号
姓名
性别
年龄
学位
职称
技术专长
单位
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
四、申请单位意见：
对申请书的真实性及能否提供基本工作条件等签署意见
该课题运用反义基因技术来探寻骨肉瘤治疗的新途径，具有科学创新性，项目负责人同志长期从事骨外科及肿瘤等领域的临床、科研工作，科研水平较高，工作作风严谨，具有良好的科研创新能力，课题组承担过多项研究课题，为本课题打下了良好的科研基础。
该课题如能获得资助，将能按时保质完成。
该项目已列入本部门重点发展项目。
单位负责人（签字）：
申请单位（盖章）
年月日
五、主管部门审核意见：
所在市、州卫生局或省直单位审核意见
主管部门负责人（签名）：
主管部门（盖章）
年月日
（申请青年基金课题必填）
六、专家推荐意见：
（两名专家推荐意见）
推荐专家（签名）：
年月日
推荐专家（签名）：
年月日
七、专家评审意见：
专家组负责人（签名）：
年月日
八、省卫生厅审批意见：
主管领导（签章）（公章）
年月日
九、合同条款
订立合同单位：
湖南省卫生厅（甲方）
课题承担单位（乙方）
课题保证单位（丙方）
为了保证医学科学研究工作的顺利实施，根据《中华人民共和国技术合同法》及《湖南省医药卫生科学技术研究项目管理办法》的有关规定，商定如下共同条款：
第一条本合同一经签定，即具有法律效力。
签约各方应履行本合同规定的义务，不得擅自变更或解除合同。
任何一方提出变更合同原定内容、指标或解除合同，需与签定合同各方共同协商，就变更或解除达成书面协议后，方可执行。
第二条甲方按合同下拨资助经费，检查课题计划执行情况，监督资助经费的使用。
丙方按合同督促乙方按计划实施，并保证乙方按规定使用资助经费，按合同规定偿还经费。
第三条乙方按合同实施课题计划，并于每年十一月底前填报《执行情况报告表》一式二份，向甲、丙方汇报课题执行情况和经费使用情况。
第四条确因客观原因需要调整研究计划或课题负责人者，乙方必须书面报请丙方审查并呈甲方批准后方可调整。
第五条乙方在撰写本课题研究报告、发表论文、申报奖励时，需注明“湖南省卫生厅科研基金资助”字样，重要文件抄报甲方、丙方，课题研究成果的转让须经签约各方协商进行。
第六条本课题属偿资助课题，其偿还经费万元，乙方必须按资助经费偿还计划按期偿还给甲方，逾期不还者，甲方有权追回全部资助经费，并拒绝受理乙方申报的其他课题和成果，扣除或停拨乙方承担课题的资助经费
第七条本合同一式四份，甲方、丙方各一份，乙方二份。
本合同自甲、乙、丙三方签字、盖章之日起生效。
合同签署各方：
湖南省卫生厅（甲方）
部门科技主管：
（签章）（公章）
年月日
课题承担单位（乙方）
单位科技主管：
课题负责人：
财务负责人：
开户银行及帐号：
（公章）
年月日
保证单位（丙方）：
（系指各附属医院及地市所属单位的主管部门）
主管部门负责人（签章）（公章）
年月日
课题申报号
课题合同号
湖南省卫生厅科研基金
课题申请书（合同书）
●下册●
课题名称：
VEGF反义寡核苷酸抗骨肉瘤血管生成治疗的实验研究
申请日期：
2004-3-2
湖南省卫生厅制
一．课题研究的科学依据：
包括国内研究现状、水平、发展趋势、存在问题、本课题特色、创新之处及立题依据等。
国内外研究现状、水平、发展趋势：
反义寡核苷酸能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递，与传统的化疗药物相比更具有选择性和高效低毒性，是目前抗肿瘤治疗研究的方向。
VEGF反义寡核苷酸（VEGFASODN）的靶基因VEGF是目前发现的刺激肿瘤血管形成的最关键因子，并与肿瘤的形成和发展密切相关。
研究以VEGF配体系统为靶向的血管生成抑制剂的抗癌新策略已成为热点。
抗血管生成的基因治疗目前还处于实验阶段，主要有以下4条途径：
①反义VEGF②VEGF单克隆抗体③诱导可溶性VEGF受体的产生④阻断VEGF信号传导途径。
骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，约占骨原发性肿瘤的20%，传统的截肢和关节离断术，5年生存率仅15%左右，虽然新辅助化疗的运用使骨肉瘤患者的生存率大大提高了，但仍有一定比例的患者对化疗有原发性或继发性耐药，骨肉瘤仍是一种死亡率和致残率高的疾病，因此，寻找更加积极有效的治疗方法十分必要。
Chen等研究了将骨钙素自杀基因治疗与小剂量MTX（40mg/kg）合用的“化疗-基因治疗”方法，为骨肉瘤的治疗提供了新的思路。
近年实验证实，利用特异性抗VEGF单抗或转染VEGF的反义基因能抑制多种肿瘤如脑胶瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性黑色素瘤等的体内生长。
亦有实验表明肿瘤血管生成与骨肉瘤的演进、转移关系密切，抗肿瘤血管生成治疗已成为肿瘤治疗的新模式，为骨肉瘤的治疗提供了新的方向。
迄今为止，国内外关于用反义VEGF抗骨肉瘤血管生成治疗方面的报道甚少。
本研究拟通过反义VEGF对内皮细胞的生长抑制实验、骨肉瘤细胞VEGF的抑制实验，明确不同浓度的反义VEGF对内皮细胞生长的抑制情况及对骨肉瘤VEGF的抑制作用，通过制备人骨肉瘤动物模型，观察VEGFASODN对骨肉瘤的治疗作用，并与传统化疗药物顺铂（CDDP）进行对照研究，观察裸鼠的一般情况与生存期，肿瘤的转移情况、大小与瘤重、微血管记数、细胞增殖指数、细胞凋亡指数。
明确①反义VEGF抗骨肉瘤血管生成治疗的疗效，和其与传统化疗药物的关系（协同、拮抗），为治疗骨肉瘤寻找新的方法提供可靠的实验依据②反义VEGF抗血管生成作用与细胞增殖、凋亡的关系，从而探讨反义VEGF抗血管生成的机制。
预期具有较高的临床应用价值。
本课题特色、创新之处：
（1）设计并合成VEGF的反义、无义寡核苷酸
（2）首次采用反义VEGF抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的生长，并探讨了反义VEGF的抑制作用及其与浓度的关系，以寻找最佳的治疗浓度。
（3）应用RT-PCR、Western印迹法检测了不同浓度的反义VEGF对骨肉瘤细胞VEGF表达的抑制情况。
（4）率先采用反义VEGF治疗骨肉瘤，并探讨了其与传统化疗药物合用的疗效（协同、拮抗），可为临床骨肉瘤的抗血管生成治疗提供可靠的实验依据。
（5）首次检测了反义VEGF对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响，从大体形态、细胞水平、超微结构到分子水平，探讨反义VEGF抗血管生成的机制。
立题依据：
骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，约占骨原发性肿瘤的20%，其治疗是骨科学的一个难题，传统的截肢和关节离断术，5年生存率仅15%左右，虽然新辅助化疗的运用使骨肉瘤患者的5年生存率大大提高了，但仍有一定比例的患者对化疗有原发性或继发性耐药，骨肉瘤仍是一种死亡率和致残率高的疾病。
由于80%的患者在初诊时即已发生转移，20%-30%的患者无论采取何种治疗，预后均极差，故近30年来，骨肉瘤的总体疗效并无很大的提高。
如何进一步提高骨肉瘤患者的疗效和生存率，仍是临床亟待解决的重要课题。
实体肿瘤的增殖和转移依赖于新生血管的产生，如果能够抑制和阻断血管的形成，就可阻止肿瘤的生长和转移，使原发的甚至转移的肿瘤控制在浸润前期。
骨肉瘤是一种富含血管的高度恶性肿瘤，而VEGF是肿瘤血管生成重要的影响因素，VEGF是肿瘤抗血管治疗的一个有效靶点，抗血管生成是一种有潜力的治疗措施。
本课题通过设计与合成VEGF的反义寡核苷酸，探讨不同浓度的反义VEGF对内皮细胞生长的抑制作用及对骨肉瘤细胞VEGF表达的抑制实验，以寻找最佳的抑制浓度；研究了反义VEGF治疗骨肉瘤的疗效及其与传统化疗药物合用的作用（协同、拮抗），并从形态学到分子水平研究反义VEGF抗血管生成的机制，可为临床骨肉瘤采用反义基因技术抗血管生成治疗提供可靠的实验依据。
二、研究内容：
包括研究的具体内容，研究实验方法步骤、主要技术路线（包括工艺流程）、主要技术关键。
1、研究的具体内容：
（1）设计并合成VEGF的反义、无义寡核苷酸
（2）反义VEGF对内皮细胞的生长抑制实验
（3）反义VEGF对骨肉瘤细胞VEGF的抑制实验
（4）反义VEGF对骨肉瘤的治疗实验
（5）反义VEGF对骨肉瘤微血管密度（MVD）、VEGF表达、细胞增殖指数（PHI）及凋亡指数（AI%）的影响；
（6）在光镜下观察不同治疗组骨肉瘤细胞结构的改变，在透射电镜下观察其细胞超微结构的改变。
2、研究实验方法步骤
1、根据计算机程序软件设计出互补于VEGFmRNA的反义寡核苷酸序列（AS-ODN），用DNA合成仪合成，电泳纯化，并同时设计与其碱基组成相同，但碱基顺序随机排列的无义寡核苷酸序列（NS-ODN）作为对照。
以上寡核苷酸序列均行硫代磷酸化修饰。
2、内皮细胞生长抑制实验
（1）人骨肉瘤细胞株（OS-723）培养
（2）OS-723条件培养液的制备OS-723细胞常规培养、消化、离心收集后接种至培养板内，待细胞完全贴壁生长后用PBS冲洗，更换无血清培养液，在此无血清培养液中分别加入5、10、15、20μmol/l的反义或无义寡核苷酸；对照组用不含寡核苷酸的无血清培养液。
培养72h后收集各组培养液离心，收集其上清液即为条件培养基，置于-200C低温冰箱中保存。
（3）人脐静脉内皮细胞原代培养，实验组分反义、无义寡核苷酸组，另设对照组。
实验组分别加入5、10、15、20μmol/l的反义或无义寡核苷酸，并加入各寡核苷酸浓度组相应的条件培养基培养，加照组加入对照培养基与PBS，用MTT法检测各组内皮细胞的生长情况，计算内皮细胞的生长抑制率（内皮细胞的生长抑制率=[（对照组D值-实验组D值）/对照组D值]×100%）。
3、反义VEGF对人骨肉瘤细胞VEGF的抑制实验
（1）人骨肉瘤细胞株（OS-723）培养
（2）寡核苷酸的转染采用阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染OS-723细胞。
（3）实验分正常对照组（不进行转染）、脂质体对照组（转染时只加脂质体）、NS-ODN组（以脂质体转染NS-ODN）、AS-ODN组（以脂质体转染AS-ODN）四组。
取转染后继续培养48h的OS-723细胞，提取总RNA，以紫外分光光度计检验纯度并定量，电泳验证RNA完整性，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测VEGFmRNA表达。
用Western印迹法检测VEGF蛋白的表达。
4、反义VEGF对骨肉瘤的治疗实验
（1）建立人骨肉瘤动物模型，实验动物随机分成A、B、C、D、E、F六组，分别用反义VEGF、顺铂（CDDP）、反义VEGF+CDDP、无义VEGF、无义VEGF+CDDP、NS进行治疗，观察实验动物的一般情况及生存期、肿瘤的大小、重量及转移情况。
（2）取肿瘤标本固定、石蜡包埋后行HE染色，光学显微镜下观察；行免疫组织化学染色，检测肿瘤的微血管密度（MVD）、VEGF表达情况、细胞增殖指数和凋亡指数。
（3）取肿瘤标本行铀-铅双重染色，在透射电镜下观察四组骨肉瘤细胞的超微结构的改变。
3、技术线路图
内皮细胞生长抑制实验
反义VEGF对人骨肉瘤细胞VEGF的抑制实验
反义VEGF对骨肉瘤的治疗实验
透射电镜
免疫组化染色
观察、称重
肿瘤细胞的超微结构改变
肿瘤细胞凋亡指数
肿瘤细胞增殖指数
动物的一般情况与生存期
肿瘤的微血管密度
肿瘤的大小、瘤重
肿瘤转移情况
肿
瘤VEGF的
表
达
4、主要技术关键
（1）VEGF反义寡核苷酸的设计与合成
（2）OS-732细胞条件培养基的制备
（3）人脐静脉内皮细胞原代培养、OS-732细胞培养
（4）OS-732细胞的寡核苷酸转染
（5）人骨肉瘤动物模型的制备
三、研究目的与意义：
包括研究目标、预期成果形式及成果水平，现实需要性及科学意义，社会、经济效益及其推广应用前景。
1、预期目标
（1）设计并合成VEGF反义、无义寡核苷酸
（1）检测不同剂量的反义VEGF与人脐静脉内皮细胞生长的关系，探讨反义VEGF抑制内皮细胞生长与浓度的关系。
（2）探讨反义VEGF对骨肉瘤细胞VEGF的抑制情况
（3）观察反义VEGF治疗骨肉瘤的疗效，及其与传统化疗药物的关系（协调、拮抗），为临床骨肉瘤治疗寻找新的方法
（4）通过从形态学到分子水平的研究，探讨反义VEGF抗血管生成的机制
2、预期成果形式及成果水平：
本研究通过探讨反义VEGF抑制内皮细胞生长、骨肉瘤细胞VEGF表达，反义VEGF治疗骨肉瘤的疗效，及其与传统化疗药物的关系（协调、拮抗），可进一步明确反义VEGF抗血管生成的机制，为临床骨肉瘤的治疗寻找新的途径。
如本研究顺利达到目标，可形成自有知识产权或成果，并在国外期刊和国家核心期刊上发表论文6-8篇。
3、现实需要性及科学意义，社会、经济效益及其推广应用前景：
骨肉瘤是一种最常见的骨恶性肿瘤，约占骨原发性肿瘤的20%，其治疗是骨科学的一个难题，传统的截肢和关节离断术，5年生存率仅15%左右，虽然新辅助化疗的运用使骨肉瘤患者的5年生存率大大提高了，但仍有一定比例的患者对化疗有原发性或继发性耐药，骨肉瘤仍是一种死亡率和致残率高的疾病。
近30年来，骨肉瘤的的化疗并没有取得突破性的进展，疗效并无新的突破。
由于80%的患者在初诊时即已发生转移，20%-30%的患者无论采取何种治疗，预后均极差，因此，如何进一步提高骨肉瘤患者的疗效和生存率，仍是临床亟待解决的重要课题。
寻找反义VEGF最佳的治疗浓度并对其疗效进行判断，从形态学到分子水平探讨反义VEGF抗血管生成的机制，将为骨肉瘤的治疗开辟新的途径，并为临床
骨肉瘤的反义VEGF治疗奠定基础，如推广应用前景广阔，可改写骨肉瘤患者截肢的命运，并大大提高其5年生存率，可产生良好的经济效益和巨大的社会效益。
四、计划进度安排：
（一年内完成的按季度、跨年度的按半年安排）
2004.4.～2004.6.实验前期准备工作
2004.7.～2004.12.人骨肉瘤细胞株（OS-723）培养，制备OS-723条件培养液
2005.1.～2005.6.人脐静脉内皮细胞原代培养，用MTT法检测实验组和对照组的内皮细胞生长情况，计算内皮细胞的生长抑制率。
2005.7.～2005.12.反义VEGF对人骨肉瘤细胞VEGF的抑制实验
2006.1.～2006.7.建立人骨肉瘤动物模型，分组治疗后，观察实验动物的一般情况及生存期、肿瘤的大小、重量及转移情况。
取肿瘤标本固定、石蜡包埋后行HE染色、免疫组织化学染色，检测肿瘤的微血管密度、VEGF的表达情况、细胞增殖指数和凋亡指数。
在透射电镜下观察骨肉瘤细胞的超微结构的改变。
2006.8～2006.12.课题总结、资料整理；撰写及发表论文。
五、课题负责人研究成绩简介：
包括研究工作简历、主要论文、著作和科研成果名称，注明其排名顺序及获得专利情况（文中不能出现课题负责人的姓名及单位）。
八、研究工作条件：
与课题相关的主要仪器设备、实验动物及其他条件。
（一）、仪器设备的名称、规格、备置情况
本院已具备有promega公司的DNA热循环仪、美国冷冻干燥机、美国产CO2培养箱、紫外分光光度计、电镜、冷冻真空干燥机、光测定仪、全自动酶标捡测仪、荧光显微镜、超低温冰箱、凝胶图像分析仪系统、自动蒸汽消毒器、全自动细菌分析仪、梯度PCR仪、电泳仪、核酸蛋白分析仪、干胶器、电转移融合仪、倒置式生物显微镜定量PCR仪、高效液相色谱仪、超速冷冻离心机、紫外/可见光分光光度计、荧光分光光度计、全自动计数仪、扫描电镜、透射电镜、旋转薄膜蒸发仪、自动组织处理机、流式细胞仪、全自动DNA测序仪等仪器。
（二）、实验动物名称、品种、品系、来源、等级、合格证明及动物实验条件
（三）、其他条件（研究场所、设备、临床基础等）
九、经费核算
预算支出科目
金额（万元）
计算依据
科研业务费
0.6
文献查新、复印资料,论文发表、学术交流
实验材料费
4.0
购买试剂
3.3
购买各种试剂盒、抗体
购买细胞株
0.1
购买MCF7细胞株
实验耗材
0.4
CTX及其它实验药品与耗材的购买
实验动物
0.2
裸鼠的购买及饲养
科研协作费
0.4
FCM及透射电镜检测
合计
5.0
十、资助经费拨款及偿还计划
经费来源及资助经费拨款计划单位：
万元
年度
金额
经费
来源
年
年
年
年
年
年
卫生厅
科研基金资助
申请单位自筹
其他
总经费
资助经费偿还计划单位：
万元
偿还经费
年
年
年
十一、课题检索证明：
由有关信息检索部门提供。
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