反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度.docx

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反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度

反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度

张宏文Ξ

　钱立新　王蔚青　钱　靖　欧　宁　邵志高

南京医科大学第一附属医院（南京　210029

摘　要:

目的　建立测定血浆及膀胱组织中阿霉素含量的反相高效液相色谱法。

初步应用于膀胱癌患者膀胱内灌注阿霉素预防膀胱肿瘤术后复发的疗效观察。

方法　血浆中样品用二氯甲烷2异丙醇混合液提取,膀胱组织制成匀浆后经二氯甲烷2异丙醇混合液提取,HypersilODS柱（416mm×200mm,10μm为分析柱,甲醇20101mol・L-1磷酸二氢钾2冰醋酸（85∶

15∶015为流动相,检测波长为E475nmX

、E545nm

M,以柔红霉素为内标。

结果　血浆及膀胱组织中阿霉素的线性范围分别为10~300ng・ml-1和011~110μg・g-1,日内、

日间误差RSD均小于10%,平均回收率分别为104139%和94152%。

结论　本法测定血浆及膀胱组织中阿霉素含量准确、简便,适用于阿霉素药代动力学的研究。

关键词:

高效液相色谱法;阿霉素;血药浓度;膀胱组织

inHumanPlasmaandBladder

HPLCwithFluorescenceDetector

ZHANGHong2wen,QIANLi2xin,WANGWei2qing,QIANJing,OuNing,SHAOZhi2gao

TheFirstAffiliatedHospitalwithNanjingMedicalUniversity（Nanjing　210029,China

ABSTRACT:

AIM　ToestablishananalyticalmethodforthedeterminationofadriamycininhumanplasmaandbladderbyHPLCwithfluorescencedetector.METHOD　Adriamycininplasmawasextractedwithmixtureofdichloromethaneandisopropylalcohol.Theho2mogenatetissuessampleswereplungedintodichloromethaneisopropylalcoholandadriamycinwasextracted.AHypersilODScolumnwasused

withamobilephaseofmethanol20101mol・L-1phosphatebuffersolution2aceticacid（85∶15∶015,thedetectivewavelengthwasE475nmX

E545nm

Manddaunorubicinwasusedastheinternalstandard.RESULTS　Thecalibrationcurvewaslinearwithintherangeof10~300ng・ml-1,and011~110μg・g-1inplasmaandbladder,respectively.Theinter2dayandintra2dayRSDwaslessthan10%,therecoverywas104139%and94152%respectively.CONCLUSION　Themethodissimplewithhighsensitivityandgoodprecisionandhasprovedtobesuitableforphar2macokineticstudiesofinadriamycin.

KEYWORDS:

HPLC;Adriamycin;Plasmaconcentration;Bladder

　　阿霉素（Adriamycin,ADM是一种抗肿瘤谱广、活性强、临床上广泛使用的蒽环类细胞毒抗生素,但它具有明显的毒副作用,最显著的是心脏毒性和骨髓抑制[1]。

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的肿瘤,且复发率高,局部化疗成为重要的治疗和防止复发的方法;而异博定作为增效剂可使化疗达到更为理想的效果[2]。

本研究建立的反相高效液相色谱法测定血浆及膀胱组织中阿霉素含量的方法将用于研究异博定对阿霉素的增效作用。

1　仪器与试药

Waters液相色谱仪（包括474荧光检测器,515泵,Rheodyne7725i进样阀;上海分析仪器厂;N2000

色谱工作站（浙江大学仪器厂;匀浆器;8022离心机。

阿霉素对照品（中国药品生物制品检定所,标示量9613%;内标:

柔红霉素（西安制药厂。

乙腈、甲醇均为色谱纯（上海化学试剂厂;冰醋

・

4・江苏药学与临床研究　　2006年第14卷第1期

Ξ[通讯作者]　:

025*********

酸、磷酸二氢钾、异丙醇均为分析纯。

2　方　法211　色谱条件

色谱柱:

HypersilODS柱（415nm×200nm,10μm;流动相:

甲醇20101mol・ml-1磷酸氢二钾2冰醋

酸（85∶15∶015pH415;流速:

1ml・min-1;检测波长:

E475nmX

、E545nmM;进样量:

20μl。

212　对照品溶液及内标溶液的配制

精密称取阿霉素0100501g于10ml量瓶中,用

甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取012ml于10ml量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,配制10102μg・ml-1阿霉素对照品溶液。

甲醇作为溶剂进一步稀释,制得不同浓度系列对照品溶液。

精密称取内标柔红霉素约10mg,置于100ml量瓶中,解并稀释至刻度,,取110ml中,,-溶液。

4。

213　样品处理

血浆样品预处理　离心试管加入肝素抗凝血浆

110ml,精密加入10μg・ml-1内标溶液20μl,混匀,

加二氯甲烷2异丙醇（9∶15ml,涡旋混匀2min,4000r・min-1离心15min,取4ml有机层于40℃水浴挥

干,残渣用甲醇50μl溶解,取20μl,作HPLC测定。

膀胱组织样品预处理　取膀胱组织015g,加磷酸盐缓冲溶液（pH718110ml,匀浆器匀浆,加内标溶液（10μg・ml-120μl,加二氯甲烷2异丙醇（9∶15ml,在快速混合器上旋振2min、以4000r・min-1离

心15min,取4ml有机层于40℃水浴挥干,残渣用

甲醇50μl溶解,进样20μl,作HPLC测定。

3　结　果3.1　按项和内标的组织,作HPLC分析,所得色谱见图1。

在上述色谱条件下,阿霉素与内标分离,空白血浆和膀胱组织对样品测定无干扰,故本法具有良好的专属性

。

图1　血浆及膀胱组织中阿霉素HPLC色谱图

A:

空白血浆;B:

标准含药血浆;C:

空白膀胱组织;D:

标准含药膀胱组织（阿霉素tR=8142min;内标tR=10134min

3.2　标准曲线

于离心试管中加入空白血浆1ml,加入不同量

的阿霉素标准溶液,使阿霉素浓度分别为10、20、50、100、200、300ng・ml-1,按“血浆样品处理”项下操作,记录内标及样品峰面积Ai和As。

以阿霉素及内标峰面积之比As/Ai为纵坐标（Y,血药浓度为横坐标（X作回归分析。

回归方程为:

Y=010042+010038X（r=019994,n=5,阿霉素最低定量浓度为5ng・ml-1。

取膀胱组织015g加入一系列浓度的盐酸阿霉

素标准液,使组织中阿霉素浓度分别为011、012、

014、016、110μg・g-1,按“膀胱组织预处理”项下操作,记录内标及样品峰面积Ai和As。

以阿霉素及内标峰面积之比As/Ai为纵坐标（Y,血药浓度为横坐标（X作回归分析。

回归方程为:

Y=010038+010854X（r=019982,n=5。

313　精密度试验

按“312”项方法配制300、100、20ng・ml-1高、中、低3种浓度的含药血浆,按“血浆样品预处理”项下步骤作1天内和连续5天的测定,记录峰面积。

结

・

5・江苏药学与临床研究　　2006年第14卷第1期

果见表1。

表1　血浆中阿霉素的日内和日间变异（n=5

浓度/ng・ml-1

日内

A/A（x±sRSD（%

日间

125710877

698

　　取膀胱组织015g制成阿霉素浓度分别为011、

014、110μg・g-1的样品,按

“膀胱组织预处理”项下操作,1日内和连续5天测定,结果见表2。

表2　膀胱组织中阿霉素的日内和日间变异（n=5

浓度/ng・ml-1

日内

AA（xs

RSD（%

日间

119384±01009

4140

119645±01105127

314　回收率测定

、300ml-1,11410g・g-1的样品,按“和“膀胱组织预处理”项下操作,结果见表3和表4。

表3　血浆样品中阿霉素的回收率（n=5

加入量/ng・ml

-1

回收率

RSD（%

99107±6196

7103

表4　膀胱组织中阿霉素回收率（n=5

加入量/ng・ml-1

回收率

x±s

RSD（%

9752449

460

315　最低检测限和最低检测浓度

按信噪比3倍计算,本法血浆及膀胱组织中最

低检测浓度分别为5ng・ml-1和0105μg・g-1。

4　讨　论

参考文献[3],在流动相配比中,增加了甲醇的含

量,使ADM的保留时间前移,吸收增加,提高了方法的灵敏度。

用二氯甲烷2异丙醇（9∶1的混合液提取血浆和膀胱组织中阿霉素较文献报道的氯仿2甲醇（4∶1的混合液提取,干扰峰少,混合时间短,提取效率高。

采用内标法,克服了在阿霉素提取过程中可能引起的操作误差和测定时存在的不稳定因素。

用,因而为了测出微,,,并减少ADM的破坏,加入磷酸盐缓冲液的量要适宜（过多过少均不利于ADM的提取。

本方法对文献的方法进行了改进,改进后的方法具有灵敏度高、快速简便的优点,为研究膀胱灌注术后阿霉素在体内的药物浓度及异博定对ADM的增效作用,提供了方法学基础。

有关该方法的临床应用将另文发表。

参考文献

1　陈新谦,金有豫,汤　光主编.新编药物学[M].第15版,北京:

人民卫生出版社,2003:

678~6791

2　王洪亮,赵忠文,姜凤鸣.异博定对塞替哌及阿霉素在人膀胱癌

细胞株体外化疗的增效作用[J].白求恩医科大学学报,1997,23

（5:

517~5191

3　何素梅,魏树礼,吴传斌,等.反相高效液相色谱荧光检测法测定

血浆或肝组织中阿霉素含量[J].药物分析杂志,1994,14（4:

8~

111

・信　息・

《国家食品药品监督管理局听证规则（试行》

（局令23号发布为规范国家食品药品监督管理局行政许可、行政处罚、行政立法、行政决策等行政行为,保护公民、法人

和其他组织的合法权益,2005年12月30日国家食品药品监督管理局局长邵明立签发了第23号局长令,

《国家食品药品监督管理局听证规则（试行》（以下简称《规则》

正式公布,并于2006年2月1日起施行。

《国家食品药品监督管理局听证规则（试行》共分五章三十六条,确立了“公开、公正、职能相对分离、案卷排他、便民、效率”的听证原则,并对听证的范围、程序、时限等方面都作了富有操作性的具体规定。

注:

详细《规则》请查阅《中国医药报》2006年1月21日第3版。

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6・江苏药学与临床研究　　2006年第14卷第1期