生物技术专业大实验实验指导.docx
《生物技术专业大实验实验指导.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术专业大实验实验指导.docx（47页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
生物技术专业大实验实验指导
《生物技术专业大实验》课程
课程编号：
0741524966
实验指导书
主撰人韩军丽王雪青金玉莲赵培
审核人王素英
天津商业大学生物技术与食品科学学院
二零零九年十一月
前言
1．实验总体目标使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。
⒉适用专业年级生物技术专业第6学期
⒊先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程
⒋实验课时分配
实验项目
实验要求
实验类型
每组人数
实验
学时
实验一目的基因的PCR扩增
必做
综合
2
4
实验二DNA片段的回收
必做
综合
2
4
实验三DNA的连接
必做
综合
2
2
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备
必做
综合
2
3
实验五重组DNA的转化
必做
综合
2
3
实验六快速分离大肠杆菌中的重组质粒
必做
综合
2
3
实验七重组质粒的酶切鉴定
必做
综合
2
4
实验八外源基因诱导表达及蛋白质检测
必做
综合
2
12
实验九细胞凝集反应
必做
综合
2
2
实验十细胞膜的渗透性
必做
综合
2
2
实验十一细胞工程基础实验技术
必做
综合
2
4
实验十二无菌操作及愈伤组织诱导技术
必做
综合
2
4
实验十三微藻规模化培养
必做
综合
2
4
⒌实验环境生物技术专业实验室
⒍实验总体要求
进入实验室，必须穿实验服。
保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。
⒎本实验的重点、难点及教学方法建议
本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。
目录
实验一目的基因的PCR扩增
……………………………
实验二DNA片段的回收
…………………………
实验三DNA的连接
……………………………
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备
……………………………
实验五重组DNA的转化
……………………………
实验六快速分离大肠杆菌中的重组质粒
……………………………
实验七重组质粒的酶切鉴定
……………………………
实验八外源基因诱导表达及蛋白质检测
……………………………
实验九细胞凝集反应
……………………………
实验十细胞膜的渗透性
……………………………
实验十一细胞工程基础实验技术
……………………………
实验十二无菌操作及愈伤组织诱导技术
……………………………
实验十三微藻规模化培养
……………………………
实验一目的基因的PCR扩增
一、实验目的
目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术之一。
应用PCR技术分离目的基因是常用的方法之一。
通过本实验的学习，要求学生掌握PCR技术的基本原理；掌握用PCR技术扩增目的基因的方法。
二、实验内容
设计特异引物，以含有目的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增目的基因。
三、实验要求
集中授课
四、实验准备
在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。
五、实验原理、方法和手段
PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR反应体系包括五种成分：
（1）模板DNA；
（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液（提供Mg2+、pH、离子强度）。
PCR反应的基本步骤包括：
（1）变性：
高温使双链DNA解离形成单链（94℃）；
（2）退火：
低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃）；（3）延伸：
DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃）。
PCR反应体系的总体积一般为25μl～100μl。
为了提高PCR的扩增效率，PCR反应体系中各成分的浓度按如下原则调控：
（一）反应缓冲液：
由纯水、KCl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
KCl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。
Mg2+终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。
Mg2+能影响反应的特异性和产率。
（二）BSA：
一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。
（三）dNTPs：
dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。
高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。
（五）Taq酶：
能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。
能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。
无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。
用量一般为0.5～5个单位/100μl。
（六）模板：
PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。
模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。
（七）引物：
引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。
引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。
其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。
引物GC约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。
为了提高PCR的扩增效率，PCR反应温度以及温度持续时间按如下原则确定：
（一）变性：
模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）预变性3～10min，然后再进入循环程序94℃变性30～60s。
（二）退火：
退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。
引物长度在15～25bp可通过公Tm=（GC）×4℃（AT）×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。
如果（GC）低于50%，退火温度应低于55℃。
较高的退火温度可提高反应的特异性。
（三）延伸：
延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。
延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min即可。
PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预实验确定。
六、实验条件
1.生物材料和试剂
质粒DNA，引物，TaqDNA聚合酶，10×TaqDNA聚合酶反应缓冲液，dNTPs，ddH2O
2.仪器设备
PCR仪，台式低速离心机，微量移液器，PCR管
七、实验步骤
1.在PCR管中依次加入反应体系各成分，混匀，然后低速短暂离心，使液体均位于PCR管底部。
（参考备注）
2.在PCR仪控制面板上，设定PCR反应的程序，然后将PCR管置于仪器中进行扩增反应。
（参考备注）
3.反应结束后，取少许PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物的量和特异性。
备注：
20μlPCR反应体系的组成：
10×DNA聚合酶反应缓冲液2.0μl
正义引物2.0μl
反义引物2.0μl
10×dNTPs2.0μl
模板DNA50ng
DNA聚合酶1U
ddH2O加至总体积20μl
PCR反应参数：
根据引物和模板DNA的特点以及扩增片段的长度而定，一般参数为：
94˚C5min；94˚C50s，56˚C1min，72˚C1min/2min，30个循环；72˚C10min。
八、思考题
本实验中10×TaqDNA聚合酶反应缓冲液的成分及各成分的浓度是什么？
为什么这样配制？
九、实验报告
要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。
实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。
实验报告的内容包括：
（1）实验目的；
（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出扩增产物电泳结果示意图）；（6）思考题。
要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。
十、注意事项及其它说明
规范使用微量移液器、台式离心机等。
注意电源安全。
PCR仪的使用必须在老师的指导下进行。
实验二DNA片段的回收
一、实验目的
DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术。
通过本实验的学习，要求学生掌握常用的从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原理和方法。
二、实验内容
用离液序列高的盐溶解琼脂糖凝胶，结合硅质吸附柱回收琼脂糖凝胶中的DNA。
三、实验要求
集中授课
四、实验准备
在进行实验之前，要求学生认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。
五、实验原理、方法和手段
DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于克隆或是制备探针、回收PCR产物用于再次鉴定等。
迫于基因工程操作的需要，自70年代初期就已开始DNA片段分离与回收的研究，到70年代中期己探索出了2至3种较为有效的方法。
理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求。
首先，回收片段应有非常高的纯度，如从普通琼脂糖中分离出的片段不可带有即使是微量的凝胶——因为它会抑制绝大部分的酶活力；回收过程中加入的各种物质最后也要彻底除干净，因为酶是极其敏感的生物催化剂，杂质可能导致酶的异常反应或是抑制酶的全部活力。
其次，回收过程必须是严格的无DNA酶污染的操作过程，不然会发生回收片段降解的现象，有时其至当降解仅仅发生在粘性末端时也会导致连接反应的失败。
再者，要求回收技术能用于不同大小的DNA片段，如回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用。
第四，要求回收方法有较高的效率，能进行微量DNA操作。
最后，要求操作方便、快速，不需要昂贵的试剂与特殊的器材。
DNA片段回收方法包括电泳回收法、收集孔电泳回收法、机械破碎凝胶回收法、溶（熔）胶回收法、琼脂糖酶降解凝胶回收法等五大类方法。
溶（熔）胶回收法是常用的方法之一，包括低融点胶法、碘化钠法、碘化钾密度梯度离心法和NaClO4——玻璃纤维纸吸附法。
碘化钠法的原理是琼脂糖能溶解于离液序列高的盐（也称促溶剂）中，常用的盐有NaI、KI与NaClO4，所以称化学法溶胶。
NaI溶胶后可与玻璃粉吸附法或是丙酮（乙醇）沉淀法配合使用，前者用得更广泛些。
另有文献报道，TBE制的胶不易被NaI溶解，所以最好选用TAE缓冲液进行回收电泳。
六、实验条件
1.实验材料
PCR扩增产物
2.试剂
（1）50×TAE电泳缓冲液：
242.0gTris
57.1mL冰醋酸（后加）
100mL0.5mol/LEDTA（pH＝8.0）
加水至1000mL，0.103MPa湿热灭菌15min，冷却后加入冰醋酸混匀，置于4℃冰箱长期保存，用时稀释50倍。
（2）EB溶液
称取EB溶于无菌水中，母液质量浓度为10mg/mL。
配后4℃冰箱保存，如经常使用可于室温避光放置。
使用浓度为0.5μg/mL。
注意：
EB是强诱变剂，配制与使用都应极为小心并要防止污染环境。
（3）琼脂糖
（4）DNA分子量标记
（5）10×上样缓冲液
（6）DNA回收试剂盒（离心柱型）（TIANGEN）
3.器材
PCR仪、电泳仪（一套）、微波炉、微量移液器、台式离心机、紫外分析仪、刀片
七、实验步骤
1.将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳
2.在紫外分析仪中，用刀片将凝胶中的目的DNA片段切下
4.用DNA回收试剂盒（离心柱型）回收凝胶中的目的DNA（操作步骤见试剂盒使用说明书）
5.用电泳检测方法对回收产物的纯度和回收率进行分析
八、思考题
DNA片段的分离与回收在DNA重组技术中的作用是什么？
九、实验报告
要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。
实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。
实验报告的内容包括：
（1）实验目的；
（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出回收片段电泳结果示意图）；（6）思考题。
要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。
十、注意事项及其它说明
规范使用实验仪器，并注意电源安全。
涉及挥发性有毒试剂的操作，需在通风蹰进行。
其他有毒试剂需戴手套进行操作。
本实验电泳、切胶步骤需戴手套进行操作。
溶胶液含有诱变剂溴化乙锭，避免接触。
废液集中处理。
实验三DNA的连接
一、实验目的
DNA重组技术是基因工程的三大核心技术之一。
DNA连接反应是重组过程的关键步骤，通过本实验的学习，要求学生掌握DNA的连接方法，了解连接反应中各因素对连接效率的影响；掌握T-A克隆的原理与方法。
二、实验内容
用DNA连接酶将回收的DNA片段和T载体连接形成重组DNA。
三、实验要求
集中授课
四、实验准备
在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。
五、实验原理、方法和手段
连接反应在DNA重组技术中是非常关键的一步，切割并纯化后的目的基因片段只有经过与带有自主复制起点的载体连接后，进行转化，才能得到真正的克隆，所以说连接酶的发现也是对基因工程发展的一个巨大贡献。
早在1967年世界上就有5个实验室同时发现了大肠杆菌中有DNA连接酶；1970年美国威斯康新大学的Khoro发现，经T4噬菌体感染的大肠杆菌中有T4基因所编码的DNA连接酶；到1972年底人们已经掌握了多种连接DNA的方法，在这些工作的基础上，于1972年首次实现了DNA的体外重组。
当时的实验是用T4DNA连接酶将EcoRⅠ切割的λ噬菌体与同样切割的猴病毒SV40连接，结果在电子显微镜的观察下，证实出现了重组DNA。
DNA连接酶能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键。
DNA连接酶的作用条件是：
（1）需要在一条DNA链的3’—末端具有一个游离的羟基（—OH），和在另一条DNA链的5’－末端具有一个磷酸基团（—P）。
（2）在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD+（氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP（三磷酸腺苷）作能源。
（3）只能封闭缺口（nick），不能封闭裂口（gap）。
影响DNA连接酶连接效率的主要因素有：
（1）温度，一般采用4至15℃；
（2）插入片断与载体分子的摩尔比≥3；（3）连接反应的时间12小时以上。
TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。
其原理是利用TaqDNA酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体（图1），在连接酶作用下，可以快速地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。
六、实验条件
1.试剂
回收的目的基因、T-A克隆试剂盒（TIANGEN）
2.器材
保温瓶、台式离心机、微量移液器、温度计
图1T-载体图谱
七、实验步骤
1.在微量离心管中依次加入下列试剂
（1）目的DNA片段
（2）T-载体
（3）10×连接反应buffer
（4）T4DNA连接酶
（5）ddH2O加至终体积10μl
2.稍加离心，14-16℃水浴连接过夜。
注意事项：
1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。
2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。
八、思考题
DNA连接反应中如何确定供体DNA与载体DNA的加入量？
九、实验报告
要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。
实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。
实验报告的内容包括：
（1）实验目的；
（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。
要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。
十、注意事项及其它说明
规范使用实验仪器，并注意电源安全。
实验四大肠杆菌感受态细胞的制备
一、实验目的
通过本实验的学习，要求学生掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
二、实验内容
用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
三、实验要求
集中授课
四、实验准备
在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。
五、实验原理、方法和手段
感受态，即指受体细胞容易接受外源DNA片段的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
大肠杆菌是分子生物学常用的实验材料，但是在自然条件下，大肠杆菌很难吸收外源DNA。
后来的研究发现，用CaCl2处理大肠杆菌细胞，能够诱导细胞进入感受态。
将正在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低浓度CaCl2溶液中，便会使细胞膨胀成球形，外源DNA和钙离子作用形成抗DNase的复合物并粘附在细胞表面。
42℃短暂热激处理，粘附在细胞表面的DNA进入到细胞内。
六、实验条件
1.材料大肠杆菌DH5α
2.试剂
（1）无菌100mmol/lCaCl2
（2）LB培养基
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl10g
加入蒸馏水至终体积1000mL，调节pH值至7.0，高温高压灭菌后备用。
（3）50mg/mL卡那霉素
（4）20mg/mLX-gal
（5）200mg/mLIPTG（异丙基硫代－β-D-半乳糖苷）
3.器材
恒温摇床、分光光度计、冷冻离心机、恒温水浴、37℃恒温培养箱、涂布棒、微量移液器
七、实验步骤
1）将0.5ml第一次活化的菌液加入至20mlLB培养基中，37˚C振荡培养至OD600≈0.4；
2）取1.5ml菌液，冰浴30分钟，4˚C，4000rpm，离心10分钟收集菌体；
3）用400μl冰预冷的100mmol/lCaCl2重悬沉淀，冰浴10分钟后，4˚C，4000rpm，离心10分钟收集菌体；
4）用100μl冰预冷的100mmol/lCaCl2重悬沉淀
八、思考题
大肠杆菌感受态细胞的制备的第一步，为什么要严格监控细菌的生长情况？
九、实验报告
要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。
实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。
实验报告的内容包括：
（1）实验目的；
（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。
要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。
十、注意事项及其它说明
规范使用实验仪器，并注意电源安全。
实验五重组DNA的转化
一、实验目的
转基因技术是基因工程的三大技术之一。
通过本实验的学习，要求学生掌握大肠杆菌的转基因方法。
二、实验内容
将重组DNA转入大肠杆菌，通过微生物培养，得到含有重组DNA的大肠杆菌菌株。
三、实验要求
集中授课
四、实验准备
在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。
五、实验原理、方法和手段
转化一词最初是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状发生遗传性改变的生命过程。
后来这个术语的范围扩大，可以指任何细胞吸收外源DNA而发生的可遗传的性状改变的过程。
外源DNA进入大肠杆菌的方式有四种：
转化、转导、电穿孔法、接合转移。
转化是常用的一种方式，通常受体细胞要经过一定的处理进入感受态，然后进行转化。
本实验对CaCl2法制备的大肠杆菌细胞进行转化。
将连接产物加入到处于感受态的大肠杆菌中，42℃短暂热激处理，粘附在细胞表面的DNA进入到细胞内。
转基因大肠杆菌细胞的筛选方法是蓝白筛选。
T载体带有一个大肠杆菌DNA的短区段。
其中含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。
这个编码区中插入了一个多克隆位点。
它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。
这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。
此宿主细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落（X-gal在β－半乳糖苷酶的作用下分解生成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯靛蓝
）。
然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致β一半乳糖苷酶无活性。
因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。
这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。
仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落，识别可能带有重组质粒的菌落。
然后通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，就可以确证这些质粒的结构。
六、实验条件
1.材料感受态大肠杆菌
2.试剂
（1）LB培养基
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl10g
加入蒸馏水至终体积1000mL，调节pH值至7.0，高温高压灭菌后备用。
（2）50mg/mL卡那霉素
（3）20mg/mLX-gal
（4）200mg/mLIPTG（异丙基硫代－β-D-半乳糖苷）
3.器材
恒温摇床、恒温水浴、37℃恒温培养箱、涂布棒、微量移液器
七、实验步骤
1）向冰浴保存的感受态大肠杆菌细胞中加入3-5μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟；
2）42˚C热激90秒，冰上迅速冷却1-2分钟，加入600μlLB培养基，37˚C振荡培养至少2小时；
3）在含抗生素的平板上加入一定体积的X-gal和IPTG溶液，用无菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面，于37˚C培养至所有液体消失;
4）取200μl菌液涂布于筛选培养
升级会员 