荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育.docx
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荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育
荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育
王晓楠袁齐宏袁张金凤袁光杨其袁唐灿明*
渊南京农业大学农学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室袁江苏南京210095冤
摘要院为了研究黄萎病菌的侵染机制袁通过农杆菌介导的转化方法袁将绿色荧光蛋白基因导入落叶型黄
萎病菌VD07038袁将红色荧光蛋白基因导入非落叶型黄萎病菌Bp2中,分别获得了具有绿色尧红
色荧光信号的阳性转化子遥经过分子验证和连续继代培养袁证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗
性遥通过对转化子的菌落形态尧生长速度和致病力进行检测袁发现大部分转化子与野生型基本一致袁少量转化
子发生变异袁其中转化子Bp2R-30不能产生微菌核袁致病力显著下降遥利用荧光显微镜观察了转化子
VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况遥结果表明袁在接菌12h后VD07038G-10的孢子
可吸附在根表面曰接种7～9d后袁菌丝入侵到棉花根部的维管组织遥本研究获得的荧光蛋白标记的棉花黄萎
病菌VD07038G-10可用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的过程袁并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系
的抗性袁为棉花黄萎病菌抗性鉴定提供一种新方法遥
关键词院棉花曰大丽轮枝菌曰绿色荧光蛋白曰红色荧光蛋白曰转化
中图分类号院S435.621文献标志码院A
文章编号院1002-7807渊2014冤03-0221-07
WangXiaonan,QiHong,ZhangJinfeng,GuangYangqi,TangCanming*
（
210095,）
Inordertoanalysetheinfectionmechanismof,encodinggreenfluorescentproteinwastransferredin-
todefoliatingisolateVD07038andencodingredfluorescentproteinwastransferredintonon-defoliating
Bp2via-mediatedtransformation.Finally,positivetransformantstaggedbygreenfluores-
centproteinorredfluorescentproteinwereobtained.ThehygromycinBgeneticstabilityoftransgenicprogenieswastestedby
seriescultureandmolecularverification.Accordingtocolonymorphology,growthrateandpathogenicity,wefoundthattraitsof
mostoftransformantsweresimilartothoseofwild-type,fewtransformantstendedtoformmutants.TansformantsBp2R-30did
notproducemicrosclerotiaanditspathogenicitydecreasedsignificantly.UsingtheGFP-taggedVD07038G-10iso-
late,colonizationofthefungusinrootsofthesusceptiblecottonSumian22wasinvestigated.Astheresultsshowedthat,12
hoursafterinoculationviatherootdippingmethods,rootssurfaceofSumian22werecoveredwithconidia,7-9daysafterinocu-
lation,hyphaefromtheleadingedgeofthecolonyprogressedacropetallyupthexylemvesselsofinfectedroots.
VD07038G-10taggedbyfluorescentproteincanbeusedforobservationitsinfectionprocessinrealtimeoncottonrootsandi-
dentificationofresistanceofdifferentcottonvarietiestothisstrain.Thisstudyprovideanewmethodforresistanceevaluationof
.
cotton;Kleb.;greenfluorescentprotein;redfluorescentprotein;transformation
收稿日期院2013-11-22作者简介院王晓楠渊1988-冤袁女袁硕士袁2011101118@曰*通讯作者袁tangcm@
基金项目院高等学校博士学科点专项科研基金渊20120097110024冤曰国家自然科学基金（31071459）
黄萎病对棉花的危害十分严重袁是影响棉花
高产稳产的首要障碍遥我国棉花黄萎病是由土壤
传播的病原真菌大丽轮枝菌（
Kleb.）引起的[1]遥大丽轮枝菌的寄主范围非常广
泛袁可侵染600多种植物袁这些植物大部分属于
经济作物[2-5]遥番茄尧马铃薯尧黄瓜尧棉花尧烟草尧辣
椒和茄子等都对其敏感袁而一般禾本科作物如水
稻尧玉米和高粱等不受侵染袁且大丽轮枝菌的寄
棉花学报CottonScience2014袁26渊3冤院221~227
棉花学报26卷
主范围还在逐渐扩大[6]遥在没有合适寄主的情况
下袁黄萎病菌可以形成黑化的休眠结构微菌核在
土壤中长期存在袁防治难度很大[7]遥
荧光蛋白具有稳定尧直观尧操作方便的荧光
性质和不需添加外源底物就可以在活细胞中直
接检测等优点袁作为报告基因已经广泛地应用于
丝状真菌的研究中遥绿色荧光蛋白（Greenfluo-
rescentprotein,GFP）于1962年由Shimomura等[8]
首先从发光水母（）中纯化得
到袁在真菌蛋白的亚细胞定位尧转化子致病力检
测和与寄主植物互作方面表现出了较大的优势遥
在真菌研究中常用的绿色荧光蛋白大多都经过
了修饰袁如sGFP和EGFP袁修饰后的蛋白赋予真
菌菌丝更强的荧光水平袁并且对真菌的生长和致
病力影响较小[9-10]遥Pliego等将转入白纹羽
菌获得稳定遗传表达绿色荧光的转化子袁Andrie
等利用基因在从马铃薯中分离的大丽轮枝
菌菌株中成功标记了绿色荧光[11-12]遥1999年袁第一
个红色荧光蛋白drFP583渊DsRed冤被报道袁而后被
应用于植物和病原菌互作的研究[13-14]遥mCher-
ryRFP是由Shaner在红色荧光蛋白DsRed的单
体mRFP1的基础上袁通过多轮随机和定点突变
得到[15]遥优化后的mCherry比mRFP1荧光更亮袁
成熟时间更短袁激发和发射波长更长袁分别为587
nm和610nm遥因其诸多优良性能袁mCherry备受
研究人员的青睐遥
本研究通过农杆菌介导的转化方法将绿色
荧光蛋白基因导入落叶型黄萎病菌
VD07038袁将红色荧光蛋白基因导
入非落叶型黄萎病菌Bp2袁分别获得了能够表达
绿色荧光信号尧红色荧光信号的阳性转化子袁筛
选到遗传稳定尧致病力与野生型一致的转化子袁
可用于研究黄萎病菌以及黄萎病菌和棉花之间
的互作关系遥
材料和方法
本实验于2011－2012年在南京农业大学农
学院作物遗传与种质创新国家重点实验室完成遥
试验材料
遥本试验所用棉花品种为感黄萎
病的陆地棉品种苏棉22袁用于转化子致病力检测遥
遥落叶型黄萎病菌菌系
VD07038由中国农业科学院棉花研究所朱荷琴
提供袁非落叶型菌系Bp2由江苏省农业科学院植
物保护研究所林玲提供遥遗传转化所用农杆菌
渊冤菌株为EHA105遥携
带有和基因的质粒
PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP由本实验室构
建遥和基因以及抗性选择标记
基因潮霉素B基因都受构巢曲霉3-磷酸甘
油醛脱氢酶基因的启动子gpd调控遥
试验方法
遥分别将2种黄萎
病菌接种在含0尧25尧50尧75和100滋g窑mL-1潮霉
素B的PDA平板上检测其生长情况袁确定了野
生型黄萎病菌VD07038和Bp2对潮霉素B的耐
受浓度都为50滋g窑mL-1遥
参照Maruthachalam等[16]提出的方案进行农
杆菌介导的大丽轮枝菌的转化袁所得到的阳性转
化子按照梯度稀释的方法袁进行连续2次的单孢
分离袁获得单孢纯化菌株遥
遥采用
CTAB法提取菌株DNA袁对潮霉素B抗性基因
（Hyg-4F:
TCGTTATGTTTATCGGCACTTT;
Hyg-5R:
GATGTTGGCGACCTCGTATT）进行
PCR扩增袁产物用1%的凝胶电泳进行鉴定遥将转
化子接种到不加抗生素的PDA培养基上传代5
次袁再转接到含50滋g窑mL-1潮霉素B的PDA培
养基上生长袁用荧光显微镜渊Nikon袁日本冤观察其
荧光表达情况遥
遥用直径0.7
cm的打孔器在平板上黄萎病菌的菌丝生长最边
缘的地方取大小相同的菌饼袁接种到PDA平板
中央袁置于25℃恒温培养箱培养袁每隔1d用直
尺测量菌落的直径袁观察菌落生长速度及菌落形
态袁连续观察18d遥将0.7cm的菌饼一块接种于
100mL液体培养基中袁25℃尧150r窑min-1震荡培
养袁每天测定其产孢量袁连续测定7d遥以野生型
菌株VD07038和Bp2为对照袁实验重复3次遥
遥将直径0.7cm菌饼接种
于含0.5%渊质量浓度冤羧甲基纤维素和果胶的
Czapek培养基平板上袁25℃恒温培养箱培养5~7
222
3期
d遥在平板上加入约20mL0.1%的刚果红染色30
min袁水洗2次袁再用20mL浓度为1mol窑L-1的
NaCl脱色2次袁每次约20min遥以野生型菌株为
对照袁通过比较菌落周围透明圈的有无或大小判
断突变体菌株间胞外酶产生的差异遥
遥在苏棉22植株的1~2
片真叶期袁将各转化子的孢子浓度调整到1.0伊106
mL-1袁取10mL孢子悬浮液接种于棉花根部遥分
别以野生型菌株VD07038尧Bp2和无菌水作为阳
性对照和阴性对照袁在接菌后的第2尧3尧4和5
周袁调查病情并计算病情指数袁参照Huang等的
方法[17]进行遥实验重复5次遥
遥将
VD07038G-10转化子接种于PDA液体中袁25℃尧
150r窑min-1震荡培养4～5d袁双层灭菌纱布过滤
菌液袁用无菌水稀释到4伊106mL-1遥待棉花子叶展
平时袁在无菌的条件下将棉株连根拔起遥将根在
无菌水中冲洗干净袁然后置于VD07038G-10的
孢子悬浮液中浸泡5min遥将接菌后的幼苗转移
到新灭菌的蛭石中袁置于25℃光照培养箱中袁并
与接种后12h尧3d尧5d尧7d尧9d和14d取样袁观
察VD07038G-10在苏棉22根部的侵染情况遥
结果与分析
黄萎病菌的遗传转化及转化子遗传稳定性
分析
通过农杆菌介导的转化方法袁分别将
PCL-sGFP和PCL-mCherryRFP这两个载体的
T-DNA区导入野生型黄萎病菌菌株VD07038和
Bp2袁获得带绿色荧光蛋白渊sGFP冤标记的
VD07038转化子及红色荧光蛋白渊mCherryRFP冤
标记的Bp2转化子遥
挑取少量菌丝制片袁利用荧光显微镜分别在
蓝光尧绿光和可见光模式下对所有阳性转化子的
荧光表达情况进行观察袁发现所有阳性转化子袁
无论其处于孢子阶段还是菌丝阶段袁均能产生绿
色荧光或红色荧光渊图1c袁d冤袁但不同转化子间荧
光信号强弱不一袁而野生型菌株不能产生荧光遥
这表明2种荧光蛋白被成功导入野生型黄萎病
菌袁并且在黄萎病菌的各个细胞结构中均能表
达遥其中VD07038G-10尧VD07038G-9尧Bp2R-17
和Bp2R-30等转化子能够呈现较强的荧光信号遥
将4个转化子接种到不加抗生素的PDA培养基
上分别传代5次袁再转接到含50滋g窑mL-1潮霉素
B的PDA培养基上袁发现4个转化子都能生长并
且均能产生荧光袁表明和基
因分别稳定地插入了野生型VD07038和Bp2菌
株的基因组中遥
转化子的分子检测
以野生型黄萎病菌VD07038和Bp2及4个
转化子的基因组DNA为模板袁利用基因的
特异性引物进行PCR扩增袁携带有和
基因的质粒PCL-sGFP和PCL-
mCherryRFP作为阳性对照袁无菌水作为阴性对
照遥电泳检测结果显示所有的转化子中均可以扩
增出约500bp的目的片段袁而野生型菌株未能扩
出渊图2冤袁从而进一步证明PCL-sGFP和
PCL-mCherryRFP这两个载体的T-DNA区已被
成功导入野生型黄萎病菌遥
转化子致病力相关性状分析
遥野生型菌株
VD07038和Bp2在PDA培养基上袁25℃恒温培
养时表现菌落中部菌丝质地致密袁菌丝白色袁生
长旺盛袁正面和背面都有黑色素和微菌核遥对得
到的转化子的菌落形态进行观察袁发现大部分转
化子的菌落形态与野生型菌株基本一致袁而有些
转化子的形态发生了较大变化袁表现为微菌核产
生量下降袁只在菌落中间极小的部位产生黑色素
或者不产生微菌核袁如院Bp2R-30遥
遥以野生型
菌株为对照袁对转化子的生长速度尧产孢量进行
考察遥发现在PDA培养基上袁所有转化子的生长
速度都略低于野生型菌株袁其中Bp2R-30的生长
速度显著低于野生型菌株Bp2渊图3冤遥产孢量测
定结果表明袁大部分转化子与野生型相差不大袁
含基因的转化子VD07038G-10尧
VD07038G-9与野生型一致袁都是在接种后4d
出现产孢高峰期遥含基因的转化子
Bp2R-17与野生型Bp2一致袁在接种后6d出现
产孢高峰期曰而转化子Bp2R-30产孢量显著低于
野生型Bp2袁且产孢高峰出现在接种后4d袁比野
生型提前2d渊表1冤遥
王晓楠等院荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育223
棉花学报26卷
a院白光下转化子VD07038G-10的菌丝和孢子囊曰b院蓝光下转化子VD07038G-10菌丝和孢子囊绿色荧光的表达曰
c院白光下转化子Bp2R-17的菌丝和孢子囊曰d院绿光下转化子Bp2R-17菌丝和孢子囊红色荧光表达曰e院接种12h后袁转化
子VD07038G-10孢子在苏棉22根部的吸附情况曰f院接种5d后袁转化子VD07038G-10的孢子在皮层中的扩展情况遥
a院HyphaandsporangiumofVD07038G-10underbrightfield曰b院Expressionofinhyphaandsporangiumof
VD07038G-10underbluelight曰c院HyphaandsporangiumofBp2R-17underbrightfield曰d院Expressionofinhy-
phaandsporangiumofBp2R-17undergreenlight曰e院12hoursafterinoculation袁conidiaofVD07038G-10lyingontherootsur-
faceofSumian22曰f院5daysafterinoculation袁conidiaofVD07038G-10extendedinthecortex.
图1转化子VD07038G-10和Bp2R-17菌株的荧光表达
Fig.1ExpressionoffluorescentproteinintransformantsVD07038G-10andBp2R-17
遥通过对转化子
胞外分泌纤维素酶和果胶酶的能力进行检测袁发
现4个转化子胞外分泌酶的产生和利用情况与
野生型基本一致遥
转化子致病力检测
通过灌根的方法检测4个转化子
VD07038G-10尧VD07038G-9尧Bp2R-17尧Bp2R-30
对感黄萎病菌的棉花品种苏棉22的致病情况袁
1院PCL-sGFP质粒曰2院转化子VD07038G-10曰3院VD07038G-9曰4院VD07038-WT曰5院Bp2R-17曰6院Bp2R-30曰7院Bp2-WT曰
8院PCL-mCherryRFP质粒曰H院无菌水曰M院2000bpMarker遥
1:
PlasmidPCL-sGFP;2:
TransformantVD07038G-10;3:
TransformantVD07038G-9;4:
WildtypeVD07038;5:
Trans-
formantBp2R-17;6:
TransformantBp2R-30;7:
WildtypeBp2;8:
PlasmidPCL-mCherryRFP;H:
Sterilewater;M:
2000bpMarker.
图2转化子中潮霉素基因的PCR检测
Fig.2DNAamplificationwiththeprimersspecificforgenesfromtransformants
224
3期
表1转化子的产孢量考察
Table1Sporulationquantityoftransformants
图3转化子的生长速率检测
Fig.3Thegrowthrateoftransformants
发现落叶型黄萎病菌VD07038及其转化子的致
病能力要显著高于非落叶型黄萎病菌Bp2及其
转化子遥含基因的转化子VD07038G-10尧
VD07038G-9及含基因的转化子
Bp2R-17致病力与野生型菌株基本一致袁都可以
使棉花产生严重的坏死袁叶片萎蔫袁根部变褐袁而
转化子Bp2R-30的致病力明显下降渊表2冤遥
GFP标记的黄萎病菌的侵染
使用浓度为4伊106mL-1的VD07038G-10的
孢子悬浮液对苏棉22进行蘸根处理袁接种12h
后观察到VD07038G-10的孢子可以吸附在根部
的任何位置袁且孢子随机分布袁但不同部位的孢
子量有多有少渊图1e冤遥接种3d后袁棉花根部表
面出现复杂的菌丝网络袁覆盖在主根上袁接着孢
子萌发进入根内部遥接种5d后袁可以观察到棉花
黄萎病菌的孢子在根的皮层内进行扩展（图1f）袁
此时60%的苏棉22的根部都出现褐色的病症遥
接种7～9d后袁菌丝开始入侵到棉花主根部的维
管组织遥接菌14d后袁75%的苏棉22的根部出现
黑色的病斑袁叶片出现萎蔫尧枯黄的症状遥
注院同一列中a,b,c表示处理间在0.05水平上的差异显著遥
Note:
Lettera,b,cshowsignificanceat0.05level.
菌株Strains
产孢量Sporulationquantity／（伊106）
1d2d3d4d5d6d7d
VD07038-WT2.73依0.45b160.33依1.49a304.33依5.67a366.33依28.92a336.67依10.14a332.66依18.22a357.66依4.33a
VD07038G-102.61依0.51b192.00依2.64a289.60依14.24a354.66依21.31a328.67依14.85a320.33依18.94ab356.00依2.08a
VD07038G-92.67依0.41b175.86依1.25a306.70依9.42a359.16依4.41a332.80依12.5a326.30依5.2ab356.70依1.12a
Bp2-WT4.00依0.29a62.00依0.29b198.66依0.67b252.00依3.06b287.66依10.27b303.66依2.33ab261.33依9.27b
Bp2R-173.60依0.33ab57.33依0.33b206.66依3.31b246.00依4.93b271.66依1.67b293.66依6.98b254.33依2.96b
Bp2R-301.17依0.17c8.50依0.29c76.67依1.67c83.33依1.67c76.67依1.67c75.83依2.20c55.00依1.44c
表2野生型及转化子的致病力调查
Table2Pathogenicitytestofwildtypeandtransformants
注院同一列中a,b,c表示处理间在0.05水平上的差异显著遥
Note:
Lettera,b,cshowsignificanceat0.05level.
菌株Strains病情指数Diseaseindex2周Twoweeks3周Threeweeks4周Fourweeks5周Fiveweeks
VD07038-WT11.25a22.50a43.75a51.25a
VD07038G-1010.00a20.00a45.00a51.25a
VD07038G-98.75ab18.75ab43.75a50.00a
Bp2-WT5.00b15.00b35.00b40.00b
Bp2R-175.00b15.00b33.75b42.50b
Bp2R-300.00c3.75c21.25c26.67c
王晓楠等院荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育225
棉花学报26卷
讨论
农杆菌介导的遗传转化由于具有受体材料
范围广尧转化效率高尧转化子能够稳定遗传等优
点而被广泛应用于丝状真菌的研究遥2004年
Dobinson等利用农杆菌介导的定点突变的方法
得到了大丽轮枝菌1（胰蛋白酶）基因的突变
体袁证明了农杆菌介导的转化方法可以用于大丽
轮枝菌的遗传转化和基因定点突变[18]遥Eynck等
采用农杆菌介导法将pGV04载体成功地转入大
丽轮枝菌袁获得了稳定表达GFP的大量转化子[19]遥
本研究通过农杆菌介导的孢子转化系统将绿色
荧光蛋白基因导入落叶型黄萎病菌
VD07038袁将红色荧光蛋白基因非
落叶型黄萎病菌导入Bp2袁成功获得了携带有相
应荧光蛋白基因的转化子遥本研究进一步说明这
种转化方法是有效的遥
研究表明T-DNA整合到黄萎病菌基因组上
时袁其插入位点是随机的袁而插入位点的不同可
能会影响转化子的生长速度尧菌落形态和菌落颜
色尧微菌核产生等性状[16,20]遥对所有转化子的菌落
形态进行观察袁发现部分转化子菌落形态异常袁
产微菌核能力下降甚至不能产生微菌核遥黄萎病
菌的微菌核是由单根或数根菌丝经分隔膨大尧胞
壁增厚并多向芽殖而形成的多细胞结构袁可以在
没有寄主存在的条件下在土壤中存活20年以
上遥已经证明稻瘟病微菌核与致病力存在一定关
系[21-22]遥本研究中的转化子Bp2R-30产微菌核能
力消失袁与野生型菌株相比致病力显著下降袁从
而说明棉花黄萎病菌的致病力与微菌核的产生
可能存在一定程度正相关性袁这与田秀明[23]尧徐荣
旗等[24]的研究是一致的遥
通过对转化子的生长速度和产孢量进行考
察袁发现大部分转化子生长速度和产孢量与野生
型基本一致袁少量转化子发生变异袁生长速度下
降袁产孢量高于或低于初始菌株袁并且与野生型
相比产孢高峰提早或推迟遥这些表型的变异很可
能是由T-DNA的插入破坏基因表达所导致的遥
因此袁这些突变体是后期研究黄萎病菌基因功能
的宝贵材料遥
本研究表明通过农杆菌介导法可以将荧光
蛋白基因转入棉花黄萎病菌袁并且筛选出了带有
荧光标记而致病力与野生型菌株无差异的转基
因菌株遥这些菌株可以用于棉花对黄萎病的抗性
鉴
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