引物纯化方式选择指南设计.docx

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引物纯化方式选择指南设计

引物纯化方式选择指南

2012-2-1610:

24:

14

容导读

一、DNA合成的方法和原理

二、引物纯化的方法原理及其效果

三、纯化方法与应用指南

四、常见问题的原因分析及相应的对策

一、DNA合成的方法和原理

目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。

基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。

各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。

生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。

具体的反应步骤如图一。

1、脱保护基（Deblocking）

用三氯乙酸（TrichloroaceticAcid，TCA）脱去连结在CPG（ControlledPoreGlass）上的核苷酸的保护基团DMT（二甲氧基三苯甲基），获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。

2、活化（Activation）

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体（其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护），此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接（Coupling）

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4、封闭（Capping）

缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

图1:

DNA合成原理示意图（固相亚磷酰胺三酯法）

5、氧化（Oxidation）

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。

最后对其进行切割、脱保护基，合成的Oligo在脱去保护基后，目的Oligo纯度是比较低的，其中含有大量的杂质。

主要杂质有：

所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基，以及合成时产生的短链等。

以至于粗产品中全长OligoDNA含量仅为25%左右。

尽管合成时每一步的效率都在98%～99%，但累积的效率并不高。

这些杂质成分，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，还会影响下一步的反应。

因此必须对OligoDNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

二、引物纯化的方法原理及其效果

基于以上合成的原理和步骤，目前，常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、HPLC。

生工公司采用HAP、ULTRAPAGE、HPLC三种纯化方法，其纯化的原理及其效果分别如下，我们建议客户应根据不同的实验需求，选择合适、经济并有效的纯化方法。

1.HAP纯化方法

HAP（HighAffinityPurification）是生工生物自主开发的新型oligoDNA纯化方法。

该方法已取得国家专利（专利号：

200310208040.X）。

其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附，而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。

HAP纯化柱中装有对DMT具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱，被洗脱。

然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。

这种方法具有多快好省的特点。

制品纯度可达到80~90%，可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途了。

但是因为其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。

特别是对长于39碱基以上的片段纯化效果不好。

此级别只提供长度在10-39mer以下的合成oligoDNA制品。

序列更长时，制品的纯度得不到保证。

若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用HAP纯化即可。

2.ULTRAPAGE纯化方法

PAGE（PolyacrylamideGelElectrophoresis），该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物（120碱基以），从而提供高纯度的引物。

纯化后的DNA纯度大于90%，相比与其他两种方法，PAGE纯化对长链OligoDNA（大于50mer）的纯化特别有效，制品纯度保证90~95%。

如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等，请选用PAGE纯化制品。

ULTRAPAGE：

理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。

经过PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，上样量都是非常大，电泳时的条带往往比较宽，带与带之间有重叠，分辨率有所下降，电泳后割带回收目的引物时，导致割的条带有时可能比较宽，很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。

因此生工生物为了给客户更好解决以上问题，将原有的PAGE纯化方式升级优化为现在的ULTRAPAGE纯化方式，即在PAGE纯化的同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

3.HPLC纯化方法

HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography）是使用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。

合成粗产物中不同长度的DNA片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。

先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。

该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。

同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

由于HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。

主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化等。

它的优点是自动化程度高、省人力；弱点是纯化量通量小、成本较高。

三、纯化方法与应用指南

表1:

HAP、ULTRAPAGE和HPLC三种纯化方法的特点比较

纯化方式

纯化原理

优缺点

应用

HAP

采用纯化柱上特异性树脂对DNA片段上保留5'端最后一个碱基上的DMT有亲和吸附作用从而达到分离纯化。

多快好省的特点。

纯度可达到80~90%，

但是对长于40碱基以上的片段纯化效果不好。

可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途。

ULTRAPAGE

采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，基于凝胶的尺寸和DNA的构象原理，可以分离相差一个碱基的引物，从而达到对全长产物和失败序列进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA，同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

纯度好，准确性高，对于较长序列（40-120），制品纯度保证90~95%，相比与其他两种方法，ULTRAPAGE纯化对长链引物（大于50mer）的纯化特别有效，缺点需要跑电泳并切胶回收，费时费力。

可适于多重PCR、亚克隆、点突变、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等。

HPLC

采用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。

合成粗产物中不同长度的DNA片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

该法自动化程度高、省人力；对于较长片段（大于89mer），纯化效果不如ULTRAPAGE方法好。

尽管对于较长序列，但如果实验对制品的纯度要求非常高，HPLC与ULTRAPAGE双重精制会使效果更佳，其弱点是纯化通量小、成本较高。

因其HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。

主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化。

对40mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是ULTRAPAGE；而对40mer以上的DNA制品ULTRAPAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。

所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择ULTRAPAGE纯化或HPLC纯化的引物。

根据不同的实验要求，您可以选用以下适合的纯化方法，具体见表2。

表2:

HAP、ULTRAPAGE和HPLC三种纯化方法的应用

应用

引物长度要求

纯化方法要求

普通PCR/RT-PCR

<40base

HAP

普通PCR/RT-PCR

>40base

ULTRAPAGE

多重PCR/定量PCR

根据实验要求定

ULTRAPAGE,HPLC

测序

根据实验要求定

HAP

诊断PCR扩增

根据实验要求定

HAP,ULTRAPAGE

亚克隆，点突变

根据实验要求定

ULTRAPAGE,HPLC

基因构建

根据实验要求定

ULTRAPAGE,HPLC

全基因合成

根据实验要求定

HAP

反义核酸

根据实验要求定

HPLC

修饰/标记引物

根据实验要求定

HPLC

PCR产物用于克隆表达研究或基因重组等

根据实验要求定

ULTRAPAGE,HPLC

四、常见问题的原因分析及相应的对策

Q-1.拿到引物后，想在实验室检测纯度，如何实现？

A-1:

实验室可通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物纯度的检测：

使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，碱基数≤12个的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，＞60个碱基的引物用12%的胶。

取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃，2min）。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

（有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，是引物二级结构条带）

Q-2.测序发现引物有突变或缺失是什么原因？

A-2:

测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：

测序，PCR/克隆过程，引物本身。

A、测序引入的错误

对于PCR产物进行的克隆而言，无论是TA克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端，如果用载体引物进行测序，此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近，处于测序起始阶段或正好处于测序染料峰所在的区域（90-120bp），这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。

因此，首先要看原始的测序峰图在引物区是否清晰，碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚而导致的计算机误读。

B、PCR/克隆过程

尽管使用高保真聚合酶进行PCR出错的可能性比较少，但不排除PCR错配或者克隆过程中突变的可能。

有的人会问，PCR的突变怎么会出现在引物区呢？

这是因为，引物是单链，PCR产物引物区的互补链同样是以引物为模板进行扩增得到的，因此，有可能存在引物正确但其产物出错的情况。

针对这种情况的解决方法是进行测序时，请送2-3个独立的克隆子进行测序，这样可以排除PCR过程出错或克隆产生突变的情况。

C、引物本身错误

如前面所述，引物合成是一种多步骤的化学反应，即使每一步合成效率达到99%，仍有1%的序列不能连接或错误地连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；

对于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽（capping）反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。

被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。

对于实验中测序发现的较常见碱基缺失的可能原因如下：

1.由于DNA合成是沿着3'→5'端方向将碱基逐个连接上去的，每连上一个碱基，都需要经过（Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation）一个循环。

Coupling是上一个碱基的5'-OH与下一个碱基的3'活性部分发生反应，该反应的效率最高可达99%，即便如此，仍有1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；

2.Capping是将没有连接上下一个碱基的5'-OH乙酰化，Capping的效率不可能达到100%，没有被乙酰化的5'OH会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列；

3.Detritylation是脱掉上一个碱基5'-OH上的保护基，准备连接下一个新碱基，Detritylation的效率也不可能达到100%，没有脱保护的5'-OH会跳过该循环而直接进入下一个循环，造成中间缺碱基的失败序列；

至于插入突变，引物序列中往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分碱基发生丢失DMT，处于活性状态的新碱基在没有与上一个碱基反应前发生自连，将会造成碱基重复，故会发生插入同一碱基的突变的失败序列。

对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，通常发生在G转换成其它碱基。

碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体2,6-diaminopurine（脱嘌呤），DNA复制和PCR过程中DNA聚合酶将2,6-diaminopurine看作碱基A，发生G到A的转换，测序就会发现碱基G-A置换。

脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。

引物合成过程中，造成碱基缺失，插入，置换突变的因素客观存在，上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。

但是基于目前大规模生产的纯化方法，还不能达到100%的纯度，对40mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是ULTRAPAGE；而对40mer以上的DNA制品ULTRAPAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。

所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择ULTRAPAGE纯化或HPLC纯化的引物。

测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物,发生的概率不大，但是偶尔也会发生。

客户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列复制到合成仪的，人为造成的序列出错可能微乎其微。

在目前的技术水平下，各家公司还没有办法彻底解决引物合成出错的这个问题。

引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所以每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有哪家公司可以完全避免。

Q-3.长链引物为什么出错的几率非常高？

A-3:

引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。

引物链越长，出错的频率累加起来就越高。

客户总希望合成的引物完全正确，这种心情可以理解。

但是正像PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。

通常引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。

做引物合成，特别是长链引物合成，出了建议选择ULTRAPAGE和HPLC联合使用的纯化方法，同时您也要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

Q-4.如何能保证引物的正确性?

A-4:

1.订购引物时，选用高纯度级纯化方法。

2.最好选用小于40个碱基的引物。

3.克隆实验时，一定要选择ULTRAPAGE纯化或HPLC纯化的引物。

并且每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。

进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。

Q-5.PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?

A-5:

1.遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。

2.如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。

因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。

根据我们经验，请重新挑选2-3个克隆测序，会得到正确的结果。

一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。

3.如果挑选2~3个克隆测序情况还没改观，您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。

Q-6.进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办?

A-6:

1.进行克隆实验时，一定要选择ULTRAPAGE纯化或HPLC纯化的引物。

2.并且每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。

3.我们可以免费重新合成引物。

4.如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔围限于制品价格围之。

5.引物合成超过三个月时间的投诉我们不再受理。

Q-7.引物是经过ULTRA-PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

A-7:

理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。

但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难完全避免差别仅一两个碱基的引物。

但经过PAGE纯化的引物的纯度已经有了极大的提高，尤其是我们的ULTRAPAGE引物，出错的概率非常非常低了。

Q-8.为什么我的引物经过了质谱检测，结果还是出错了？

A-8:

我们在合成引物时，出现大量的错误和缺失概率是很小的，同时采用三种纯化方法加质谱检测，已经将错误降低到极小的概率围。

但质谱检测也只能检测主要产物的分子量，经过质谱检测的引物可以确定序列没有错误，但不管采用何种纯化方式，纯度都不能是100%，因此仍然有可能存在少量有错误的引物分子。