利用Red同源重组技术构建产L苏氨酸的基因工程菌解读.docx
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利用Red同源重组技术构建产L苏氨酸的基因工程菌解读
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30（3）:
79284
利用Red同源重组技术构建产
3
L2苏氨酸的基因工程菌
闫继爱
1,2
张 雪
1,2
张 芸 宁221（1天津科技大学生物工程学院天津2 100101）
摘要L2苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除
metA、ilvetA、ilvA基因后对L2苏氨酸积累的影响。
应用质粒pKD46介导的Red同源
重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。
将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。
经5L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065L2苏氨酸的产量为5.55±0.51g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065L2苏氨酸产量为9.77±1.83g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065L2苏氨酸产量为8.65±1.42g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065L2苏氨酸的产量增加到13.6±1.14g/L。
通过敲除L2苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,
可以增强L2苏氨酸积累的效果,为L2苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。
关键词 大肠杆菌 Red同源重组 基因敲除 L2苏氨酸 发酵
中图分类号 Q784
L2苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之一,在食品、医药等方面有极其重要的用途
[123]
苏氨酸生产菌株,由于随机突变造成菌体遗传背景改变、生产能力减弱、发酵周期长,不利于进一步提高产量。
而利用分子生物学的研究方法和技术,通过对基因的表达和调控进行有目的性的改造而构建的工程菌株,不产生次级突变,代谢副产物少,产量容易提高。
随着分子生物学技术以及系统代谢工程理论的发展,更多的分子生物学手段运用于菌种的构建和改造,以提高生产菌L2苏氨酸的产量。
本研究通过分析L2苏氨酸的代谢途径,应用Red同源重组技术敲除大肠杆菌ITHR中L2苏氨酸合成的支路代谢途径中编码高丝氨酸转酰基酶的metA基因和编码苏氨酸脱氢酶的ilvA基因,分别构建了单敲除突变菌和双敲除突变菌。
将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065转入突变株中,进行5L发酵罐连续发酵培养,结果表明阻断L2苏氨酸的代谢旁路途径可以增强L2苏氨酸的积累。
。
L2苏氨酸是除谷氨
[4]
酸和赖氨酸外世界范围内年产量最高的氨基酸,在
2005年L2苏氨酸的年产量约为7万吨
。
L2苏氨酸生
[5]
产方法主要有化学合成法、酶解法和微生物发酵法。
由于成本低廉且废弃物排放比较少,微生物发酵法是目前工业生产L2苏氨酸的最常用方法。
目前,L2苏氨酸的主要生产菌株有黄色短杆菌（Brevibacterium
flavum）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）和
大肠杆菌（Escherichiacoli）,而E.coli由于繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究比较深入等特征成为L2苏氨酸生产的最常用菌株
[6]
。
为提高L2苏氨酸的产
量,各种不同的育种方法被广泛应用于L2苏氨酸生产菌的选育。
通过传统的化学和物理诱变技术选育的L2
收稿日期:
2009209223 修回日期:
2009211204
3国家“863”计划（2006AA02Z216）资助项目33通讯作者,电子信箱:
wenty@
80
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.30No.32010
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichercoli）ITHR
终浓度为100mmol/L的阿拉伯糖继续培养至OD600为
0.5～0.6。
将50ml过夜培养液冰浴至0℃,4℃离心后
用去离子水重悬,12000r/min离心收集菌体;用预冷到
0℃的10%甘油洗3次,最后将菌体重悬于600μl冷的10%的甘油中,取50μl菌液与约200ng的打靶分子DNA片段进行电转化（电转化条件V,5ms）。
电
为天津科技大学代谢工程研究室保藏菌种。
含有thr
r
操纵子的质粒pWYE065（Cm）为中国科学院工业微生
物与生物技术研究室保藏。
质粒pKD46（温度敏感型,含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet和gam基因,
r
Amp）、pKD3（含有两端带有FRT1ml37℃振荡培养2
（1Table1 Primersinthisstudy
引物名
WY041
）引物序列（5′23′
因,Cm）,pCP20（FRT的FLP1.1.2 培养基 培养基见参考文献[7]。
1.1.3 主要试剂与仪器 限制性内切核酸酶、Ex2TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000核酸Marker等购自大连宝
r
r
5AGCGATTGTGTAGGCTGGAG23′5WY042
AACGGCTGACATGGGAATTAGC23′
WY0195′2AGCGGCGAATACTAATAAC23′WY0205′2GGTTGTTGTTGCCTGTTC23′
5WY039
AGCGATTGTGTAGGCTGGAG23′5WY040
AACGGCTGACATGGGAATTAGC23′
WY0275′2GAGGTGACAAAGCCTGGAC23′WY0285′2GGAAGTGGTGCTGGAAAACA23′
生物工程有限公司;酵母粉、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司;琼脂粉、DGL4000核酸Marker购自北京鼎国生物技术有限责任公司;染色体DNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司;L2阿拉伯糖、氨苄青霉素、氯霉素均购自美国Sigma公司;其它葡萄糖、无机盐、有机试剂等均为国产分析纯试剂。
UVP凝胶成像仪（JY04S23B,北京君意东方电泳设备有
1.4 利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌ITHR的
metA和ilvA基因
限公司）;PCR仪[5332,德国艾本德股份公司
（EppendorfAG）];电泳仪（JY300C,北京君意东方电泳
Red同源重组系统如图1所示,在第一轮体内重组过程中,以pKD462Red为介导,在大肠杆菌ITHR菌株体内以带56bp同源臂的cat基因线性打靶序列替换其染色体上的metA（ilvA）目的基因,通过氯霉素抗性筛选获得重组子ITHR△metA∷cat（ITHR△ilvA∷cat）。
在第二轮体内重组过程中,将编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20转入突变菌株ITHR△metA∷cat
（ITHR△metA∷cat）中,在含氨苄青霉素抗性的50mg/L平板上培养,菌落PCR筛选ITHR△metA（ITHR
设备有限公司）;紫外分光光度计（UV21800,上海美普达仪器有限公司）;5L四联离位灭菌发酵罐（BIOTECH系列,上海保兴生物设备工程有限公司）;高效液相色谱（Agilent1200系列,安捷伦科技有限公司）。
1.2 引物设计与合成
采用Primer5.0软件根据GenBank中metA、ilvA和质粒pKD3中的cat基因序列信息,设计引物并由上海英骏生物技术公司合成,引物序列见表1,其中下划线部分为同源臂序列。
引物WY041和WY042用于扩增
cat基因以替换metA基因编码区;引物WY019和
△ilvA）阳性重组子。
并在已敲除菌株ITHR△metA基础上转入pKD46再敲除ilvA基因,构建双敲除菌ITHR△metA△ilvA。
1.5 质粒转化
WY020为metA基因敲除后重组菌鉴定引物,两条引物
各位于打靶序列区的左右两侧;引物WY039和WY040用于扩增cat基因以替换ilvA基因编码区;引物WY027和WY028为ilvA基因敲除后重组菌鉴定引物,两条引物各位于打靶序列区的左右两侧。
1.3 感受态的制备与电击转化
[8]
通过电转化的方法将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065分别转入构建的突变菌株ITHR△metA、
ITHR△ilvA和ITHR△metA△ilvA中,通过氯霉素抗性
筛选阳性克隆,得到基因工程菌。
1.6 5L罐流加补料发酵
r 种子培养:
接种单菌落于LB活化平板（Cm34）
将过夜培养12h的含有pKD46的大肠杆菌ITHR按100∶1的量接种,振荡培养至OD600值约为0.2,加入
37℃培养24h。
接种一环菌体于200ml种子培养基
2010,30（3）
闫继爱等:
利用Red同源重组技术构建产L2苏
氨酸的基因工程菌
81
pWYE065与ITHR/pWYE065L2苏氨酸产量差异的统计
学意义检验采用Cochran检验方法分析比较;菌株
ITHR△metA△ilvA/pWYE065与ITHR/pWYE065L2苏
氨酸产量差异的统计学意义检验采用Wilcoxon秩和检验方法分析比较。
p<0.05时结果具有统计学意义。
2 图1 Red同源重组系统策略
Fig.1 ThestrategyofRedrecombination
1I,用含有metA基因同源臂的
（Cm34）中,37℃,r
Y041和WY042扩增氯霉素抗性基因,将PCR产物转入含有pKD46质粒的大肠杆菌ITHR感受态细胞中,在氯霉素平板上进行转化子的初步筛选。
为排除假阳性菌或整合到错误位置的重组菌,用鉴定引物
WY019和WY020进行PCR扩增,根据重组前后序列
5L:
5
L发酵罐中,2L,℃发酵39h（根据我们的
前期实验,大肠杆菌发酵L2苏氨酸39h时,L2苏氨酸有最大的积累量,所以本实验发酵时长均为39h）。
本实验使用5L四联离位灭菌发酵罐,每次发酵做三组平行实验（n=3）。
发酵初期溶氧控制在25%～30%,对数生长期溶氧控制在50%左右,稳定期溶氧控制在25%～30%
[9]
长度的变化进行鉴定。
metA基因敲除前,PCR扩增得到1400bp片段（图2泳道2）,第一次重组后PCR扩增得到1542bp片段（图2泳道3）,该片段序列测定正确,获得大肠杆菌ITHR△metA∷cat。
将pCP20质粒转入大肠杆菌ITHR△metA∷cat的感受态细胞中,消除氯霉素抗性基因,用鉴定引物WY019和WY020进行PCR扩增,获得596bp片段（图2泳道4）,序列测定正确,获得大肠杆菌ITHR△metA突变株
。
;培养温度37℃;流加50%的氨水将pH控制
在7.0;以泡敌消泡;流加80%葡萄糖维持葡萄糖浓度在10～15g/L。
发酵过程中每隔一定时间取样进行菌体浓度测定。
其中,对于基因敲除菌株,种子培养基和发酵培养基中要加入0.0025%的相应氨基酸以提供菌体生长所必需的营养物质
[10]
。
菌体浓度测定:
将菌液稀释适当倍数后测定在600
nm下的吸光度值,即OD600。
1.7 L2苏氨酸产量检测
[11]
采用高效液相分析系统（HPLC）柱前衍生测定。
衍生方法:
取发酵液1ml,12000r/min离心20min,取上μl加入1.5ml离心管清液过膜。
取过膜后的发酵液10
中,加入已经配制好的衍生缓冲溶液（4.2%碳酸氢钠溶μl,摇匀后再加入衍生试剂溶液（1%2,42液）200二硝基μl,摇匀,将离心管置于60℃氟苯乙腈溶液,DNFB）100水浴中暗处恒温加热60min后取出,放置待溶液冷却至室温后,加入定容缓冲液（磷酸二氢钾、氢氧化钠水溶液）稀释至1ml并摇匀,放置15min后可以开始进行色谱分离。
色谱分离条件:
柱长为150mm,柱温为33℃,检测波长为360nm,流动相总流量为1ml/min。
1.8 L2苏氨酸产量数据的统计学分析
2.2 构建大肠杆菌ITHR△ilvA突变株
图2 metA基因敲除鉴定
Fig.2 TheidentificationaftermetAgeneknockouted
1:
DL4000;2:
引物WY019和WY020对菌株ITHR的扩增;3:
引
物WY019和WY020对重组菌ITHR△metA∷cat的扩增;4:
引物
WY019和WY020对重组菌ITHR△metA的扩增;5:
DL2000
用含有同源臂的引物WY039/WY040和鉴定引物
WY027和WY028进行ilvA基因的敲除和鉴定。
ilvA基
本文中L2苏氨酸产量数据的统计学分析采用SAS
9.0软件,其中,菌株ITHR△metA/pWYE065与ITHR/pWYE065L2苏氨酸产量差异的统计学意义检验采用Cochran检验方法分析比较;菌株
ITHR△ilvA/
因敲除前,用鉴定引物PCR扩增得到1731bp片段（图
3泳道2）,第一次重组后PCR扩增得到1240bp片段（图3泳道3）,该片段序列测定正确,获得大肠杆菌
82
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.30No.32010
ITHR△ilvA∷cat。
氯霉素抗性基因消除后,用鉴定引物PCR扩增获得311bp片段（图3泳道4）,序列测定正
thrC3个基因,分别编码大肠杆菌L2苏氨酸代谢途径中
3个关键酶
[12]
。
为增加thrABC的拷贝数,加强L2苏氨
确,获得大肠杆菌ITHR△ilvA突变株
。
酸的积累,我们将质粒pWYE065分别转入大肠杆菌
ITHR、ITHR△metA、ITHR△ilvA和ITHR△ilvA△metA
中,构建L2苏氨酸基因工程菌ITHR/pWYE065、ITHR△metA/pWYE065、ITHR△ilvAYE065和△A△m/pW2.5ITHR
5L发酵罐中进行发酵产酸,metA基因单敲除菌株大肠杆菌ITHR△metA/pWYE065L2苏氨酸产量由未敲除任何基因的大肠杆菌ITHR/pWYE065的5.55±0.51g/L增加到
图3 ilvA基因敲除鉴定
Fig.3 TheidentificationafterilvAgeneknockouted
1:
DL2000;2:
引物WY027和WY028对菌株ITHR的扩增;3:
引
9.77±1.83g/L,最高值为11.34g/L,增加了约76.0%。
ilvA基因单敲除菌株大肠杆菌ITHR△ilvA/pWYE065L2苏氨酸产量为8.65±1.42g/L,最高值为10.78g/L,相比未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065L2苏氨酸产量增加了55.9%。
同时敲除ilvA
物WY027和WY028对重组菌ITHR△ilvA∷cat的扩增;4:
引物
WY027和WY028对重组菌ITHR△ilvA的扩增;5:
DL2000
2.3 构建大肠杆菌ITHR△metA△ilvA突变株和metA基因的大肠杆菌ITHR△metA△ilvA/pWYE065
L2苏氨酸的产量为13.6±1.14g/L,最高值为14.9g/L,
以构建的单突变株大肠杆菌ITHR△metA为受体菌,运用Red重组技术对ilvA基因进行基因敲除。
用鉴定引物WY027和WY028进行PCR扩增,获得311
bp的片段（图4泳道1）,表明ilvA基因被敲除;用鉴定
比ilvA基因单敲除菌株增加了57.2%,比未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065增加了1.45倍。
图5中显示了不同的基因工程菌在发酵培养过程中L2苏氨酸的积累情况:
菌株ITHR△metA/pWYE065、ITHR△ilvA/
pWYE065和ITHR△metA△ilvA/pWYE065在发酵前期L2苏氨酸的积累量相近,但15h后双敲除菌株ITHR
引物WY019和WY020进行PCR扩增,得到596bp的片段（图4泳道2）,表明metA基因被敲除,成功获得大肠杆菌ITHR△metA△ilvA突变株
。
△metA△ilvA/pWYE065L2苏氨酸的积累速率明显增大,而单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065和ITHR△ilvA/pWYE065产酸速率和产酸水平基本相同。
通过SAS统计学分析软件对不同基因工程菌的L2苏氨酸产量进行分析（图6）,结果表明大肠杆菌ITHR敲除metA基因后L2苏氨酸产量与敲除前比较p=
0.0035<0.01有极显著性差异,表明敲除metA基因阻
断了天冬氨酸向蛋氨酸的合成途径,可以进一步积累
L2苏氨酸。
敲除ilvA基因后L2苏氨酸产量与敲除前比
图4 metA和ilvA基因双敲除鉴定
Fig.4 TheidentificationafterilvAandmetA
geneknockouted
1:
引物WY027和WY028对重组菌ITHR△metA△ilvA的扩增;2:
引物WY019和WY020对重组菌ITHR△metA△ilvA的扩增;
3:
DL2000
较p<0.0179有显著性差异,表明敲除ilvA基因可以阻断L2苏氨酸向异亮氨酸分解代谢,可以使L2苏氨酸得到进一步积累。
敲除ilvA和metA后L2苏氨酸产量与敲除前有显著性差异,与敲除ilvA基因的单敲除菌株比较,p<0.02有显著性差异。
结果表明,敲除大肠杆菌中L2苏氨酸支路代谢的关键酶基因metA和ilvA,可以阻断代谢流分流,减少L2苏氨酸的降解,可以增加L2苏氨酸的积累,从而达到高产L2苏氨酸的目的。
2.4 转化质粒pWYE065构建L2苏氨酸基因工程菌
质粒pWYE065带有thr操纵子,包括thrA、thrB、
2010,30（3）闫继爱等:
利用Red同源重组技术构建产L2苏
氨酸的基因工程菌83
成途径,使代谢流更多的向苏氨酸合成方向进行;同时构建工程质粒,加强表达苏氨酸操纵子,构建多株产苏氨酸的基因工程菌。
以大肠杆菌ITHR为出发菌株,本研究在引物同源臂的长短、L2阿拉伯糖的诱导浓度和诱导时间及转化后Red同源重组菌,例如,RecQ和,导致重组]。
Red重组进行基因修
[14217]36～60bp。
研究
初期,我们将同源臂长度设计为36bp,同源重组的重组正确率不到5%。
当将同源臂长度增加到56bp时,同源重组的正确率提高到70%。
同时参考国内外文献报道[15217],我们分别用10mmol/L、30mmol/L和100mmol/L的L2阿拉伯糖诱导Red重组酶表达,结果表明,感受态细胞在100mmol/L的L2阿拉伯糖浓度下,诱导表达90min,转化后在37℃复苏培养2h,重组的正确率得到很大的提高。
利用Red同源重组技术,我们成功构建了大肠杆菌ITHR△metA、ITHR△ilvA和ITHR△metA△ilvA3个突变株。
同时将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065分别转入这些突变株中,构建了L2苏氨酸基因工程菌。
将不同的基因工程菌进行连续发酵培养,结果表明,单敲除metA和ilvA基因,苏氨酸的产量分别提高了76%和55.9%,而当metA和ilvA基因同时敲除,苏氨酸的产量达到13.6±1.14g/L,增加了约1.45倍。
结果表明同时阻断蛋氨酸和异亮氨酸合成途径,更能够增加L2苏氨酸的积累。
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3 讨 论
国内报道的L2苏氨酸生产菌多为传统诱变得来,次级突变比较多,对外界环境的耐受性不强。
国外已有报道通过分子生物学技术对大肠杆菌W3110进行遗传改造构建高产L2苏氨酸工程菌,但国内至今相关报道很少。
在大肠杆菌体内,L2苏氨酸经天冬氨酸途径合成,该途径还能够合成L2蛋氨酸、L2异亮氨酸和L2赖氨酸。
根据代谢工程原理,本研究通过敲除大肠杆菌ITHR的metA和ilvA基因,阻断蛋氨酸和异亮氨酸的合1996:
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