资源植物扶芳藤叶中总黄酮提取物的抗氧化性研究.docx
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资源植物扶芳藤叶中总黄酮提取物的抗氧化性研究
本科毕业论文（设计）
（2013届）
题目
：
资源植物扶芳藤叶中总黄酮提取物的抗氧化
性研究
、
学院
：
生命与环境科学学院
专业
：
生物技术
学生姓名
：
学号
：
20909051042
指导教师
：
职称（学位）
：
副教授
合作导师
：
职称（学位）
：
完成时间
：
2013年5月25日
成绩
：
综合成绩：
等级：
黄山学院教务处制
学位论文原创性声明
兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。
本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。
本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。
声明人（签名）：
年月日
摘要……………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
Ⅳ
英文摘要………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
Ⅳ
1
引言………………………………………………………………………
1
2
材料与方法………………………………………………………………
3
2.1
材料与设备…………………………………………………………
3
2.1.1
实验材料………………………………………………
3
2.1.2
实验试剂………………………………………………
4
2.13
实验仪器…………………………………………………
4
2.2
实验方法……………………………………………………………
4
2.2.1
扶芳藤叶中总黄酮化合物的提取工艺…………………
4
2.2.2
扶芳藤叶中总黄酮提取物含量的测定……………………
4
2.2.3
扶芳藤叶中总黄酮提取物的总抗氧化能力的测定………
2.2.4
扶芳藤叶中总黄酮提取物超氧阴离子自由基清除能力的测定
测定…………………………………………………………
2.2.5
扶芳藤中总黄酮提取物羟基清除能力的测定……………
2.2.6
扶芳藤中总黄酮提取物清除DPPH·自由基清除能力的
测定…………………………………………………………
3
结果与分析………………………………………………………………
5
3.1
扶芳藤叶中总黄酮提取物的含量…………………………………
5
3.2
扶芳藤叶中总黄酮提取物的总抗氧化能力………………………
5
3.3
扶芳藤叶中总黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除能力……
5
3.4
扶芳藤叶中总黄酮提取物羟基清除能力…………………………
3.5
扶芳藤叶中总黄酮提取物对DPPH·自由基的清除能力…………
4
结论与讨论………………………………………………………………
7
参考文献………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
7
致谢……………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
8
资源植物扶芳藤叶中总黄酮提取物的抗氧化性研究
摘要：
扶芳藤叶片洗净烘干至恒重，粉碎后分别采用石油醚、75%乙醇在索式提取器里回流浸提，然后减压浓缩提取液，得到扶芳藤叶中总黄酮提取物，并分别对其抗氧化总还原能力、对羟自由基，超氧阴离子自由基，脂过氧自由基清除能力进行了实验研究。
结果表明：
扶芳藤叶总黄酮提取物具有较强的体外抗氧化活性，能有效地清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·自由基，且在实验浓度范围内，清除能力随扶芳藤叶中总黄酮提取物浓度的增加而呈上升趋势。
扶芳藤叶可加强作为天然抗氧化剂来源的应用。
关键词：
扶芳藤；总黄酮；自由基；抗氧化性
StudyonantioxidantofthetotalflavonoidsfromEuonymusfortuneileaves
（CollegeofLifeandEnvironmentsciences,HuangshanUniversity,Huangshan,,245041,China）
Abstract:
TheextractionofflavonoidsinEuonymusfortuneiwasstudiedandtheantioxidanteffectsoftheextractwereevaluatedaswell.Method:
EuonymusfortuneileaveswereextractedinSoxhletextractorwithpetroleumetherand75%ethanol,andthentheextractwasconcentratedbyvacuum,thetotalflavonoidsweregottenfromEuonymusfortuneileaves.Thereductioncapacityandthescavengingcapacitytohydroxylradicals,superoxideanionradicals,DPPH·radicalsoftotalflavonoidsextractedfromtheleavesofEuonymusfortuneiwerestudied.Result:
TheresultsshowedthattotalflavonoidsextractedfromtheleavesofEuonymusfortuneihadagoodanti-oxidantproperties,andcouldeffectivelyscavenghydroxylradicals,superoxideanionradicalsandDPPHradicals.Intheexperimentalconcentrationrange,itsscavengingcapacityrisedwiththeincreaseoftheconcentrationofthetotalflavonoids.TheleavesofEuonymusfortuneiwouldbeenhanceddevelopmentasnaturalantioxidantstoimproveeconomicvalueofdeepprocessing.Conclusion:
TheflavonoidsfromleavesofEuonymusfortuneiwasfoundhavestrongantioxidativeactivity.
Keywords:
Euonymusfortunei;Totalflavonoids;Freeradical;Antioxidantion
1引言
扶芳藤（Euonymusfortunei（Turcz．）Hand-Mazz）属卫矛科（Celastraceae）卫矛属（EuonymusL.）。
扶芳藤四季常绿，耐荫性强且具良好的抗寒能力，在园林绿化方面具有广泛的应用；扶芳藤是民间药材，全株均可入药，性味辛，具有行气活血、舒筋散瘀、止血、补肝肾等功效；摘其茎叶制成茶饮，不仅可以生津止渴，还具保健和药用价值（江苏新医学院，2006）；动物药理实验研究表明：
扶芳藤的粗提物具有明显的降压作用（陈一，1993）。
因此，扶芳藤是一种集观赏、绿化、饮用、保健和药用价值的资源植物。
目前，扶芳藤的开发利用尚处于起步阶段，近年来，对于扶芳藤叶中化学成分及其各种制剂在临床上的应用，已有了一些报道（黄莹娟，1997）（袁晓等，1994），但目前对扶芳藤中总黄酮的提取及其抗氧化性能的研究，却还未见报道。
本实验重点研究了从扶芳藤叶中提取的总黄酮的总还原能力、对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·自由基的清除能力，为扶芳藤作为资源植物的保健药用价值的深入开发提供参考数据。
2材料与方法
2.1材料与设备
2.1.1实验材料
扶芳藤（Euonymusfortunei）植株采自安徽省黄山市黄山学院南区an，由黄山学院生命与环境科学学院张慧冲副教授鉴定。
2.1.2实验试剂
芦丁（纯度99.99%，中国药品及生物制品检定所），乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，PBS（磷酸缓冲盐溶液），硫酸亚铁，DPPH（二苯代苦味酰基自由基）等均为国产分析纯。
实验用水为二次蒸馏水。
2.1.3实验仪器
RE-52D旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂）、HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器有限公司）、PL203电子天平（0.001g）（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）、WFZUV-2100型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）、SXT-02索式提取器（上海洪纪仪器设备有限公司）及各种实验用玻璃仪器等。
2.2实验方法
2.2.1扶芳藤叶中总黄酮化合物的提取工艺（叶文峰等，2002）（杨新建等，2012）
新鲜扶芳藤叶洗净，置于60℃烘箱中烘干至恒重→粉碎成粉末，称取2.500g扶芳藤叶干粉，用滤纸包装捆扎好置于索氏提取器中→加入125ml石油醚回流浸提脱脂大约4h至无色→取滤纸里滤渣→用75%乙醇回流浸提约7h至无色→收集提取液→用旋转蒸发器减压浓缩→浓缩液→加水煮沸，过滤→得总黄酮化合物提取液（加水定容至250.0ml）→待用。
2.2.2扶芳藤叶中总黄酮提取物含量的测定
（1）标准曲线的制备（陈飞彪等，2005）（杨俊等，2002）：
称取10.000mg芦丁（芸香叶苷•三水，烘干至恒重无水），用75%的乙醇定容至100.0ml，制成0.1mg/ml的标准溶液，转移至试剂瓶中保存备用。
取上述标准溶液1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml、11.0ml分别于6支25.0ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠1.0ml摇匀，放置6min；再加10%硝酸铝1.0ml摇匀，放置6min；最后加4%氢氧化钠10.0ml，用75%乙醇定容至25.0ml充分摇匀，放置10min（郭亚健，2006）。
6支容量瓶所对应的芦丁溶液浓度分别为0.001mg/ml、0.003mg/ml、0.005mg/ml、0.007mg/ml、0.009mg/ml、0.011mg/ml。
以试剂空白做对照，于分光光度计502nm波长下测定吸光值。
每组平行测定三次，取平均值。
以吸光值A（X）为横坐标，浓度C（Y）为纵坐标绘制A-C标准曲线。
得标准曲线的线性回归方程方程为：
Y（C）=0.1251X（A）+0.0013（公式2-1），相关系数R2=0.9995，线性范围0.001～0.011mg/ml，线性关系良好（图1）。
图1芦丁标准及线性回归曲线
（2）扶芳藤叶中总黄酮提取物含量的计算：
分别精密移取3.0ml、4.0ml、5.0ml提取液，按照“标准曲线制备”下的操作，测定吸光度，由芦丁标准曲线回归方程换算成浓度。
总黄酮含量C（mg/ml）=Y*稀释倍数（公式2-2）
总黄酮提取率（%）=[Y*稀释倍数*V*100%]/1000W（公式2-3）
式中，Y:
所测定溶液吸光度带入标准曲线方程算出黄酮类物质的浓度（mg/ml）；
V:
原浸提液体积（ml）；
W:
所称量的样品的质量（g）。
2.2.3扶芳藤叶中总黄酮提取物的总抗氧化能力的测定（普鲁士蓝法）
分别取未稀释的总黄酮提取液、按照体积比稀释成5%、10%、20%、30%的总黄酮提取液，对照芦丁溶液及VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释总黄酮提取液浓度相同）各1.0ml，加pH6.6磷酸钠缓冲液2.5ml，加1%铁氰化钾2.5ml，50℃水浴20min，加10%三氯乙酸2.5ml，取上述混合液2.5ml，分别加蒸馏水2.5ml和0.1%三氯化铁2.5ml，静置10min，在700nm处测吸光值。
每组平行测定三次，取平均值。
吸光值越大，说明还原性越强，抗氧化性越强。
（赵艳红等，2008）（BaskeA等，1999）
2.2.4扶芳藤叶中总黄酮提取物超氧阴离子自由基清除能力的测定（邻苯三酚自氧化法）（赵艳红等，2008）。
取Tris-HCl缓冲液（pH8.2）6.0ml，分别加未稀释的总黄酮提取液、按照体积比稀释为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%总黄酮提取液、对照芦丁溶液及VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释总黄酮提取液浓度相同）0.5ml，再加37℃水浴过的50mmol/L邻苯三酚盐酸溶液0.5ml，混合反应4min，然后用1.0ml浓HCl终止反应，在322nm处测吸光值。
以等体积不含样品时邻苯三酚溶液为对照空白，吸光度为A0。
每组平行测定三次，取平均值。
超氧阴离子自由基清除率公式如下：
O2-•清除率（%）=[A0-A]/A0*100%（公式2-4）
式中，A0：
不含样品时邻苯三酚的自氧化吸光度；
A：
被测样品溶液吸光度。
2.2.5扶芳藤中总黄酮提取物羟基清除能力的测定（邻二氮菲-Fe氧化法）（赵艳红等，2008）
取5mmol/L邻二氮菲1.5ml，加4.0ml磷酸钠缓冲液（pH7.4）混和均匀，再加入7.5mmol/L硫酸亚铁1.0ml，分别加未稀释总黄酮提取液、按照体积比稀释成5%、10%、20%、30%的总黄酮提取液、对照芦丁溶液及VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释总黄酮提取液浓度相同）1.0ml，加1.5ml蒸馏水，加0.1%双氧水1.0ml，37℃水浴加热1h，于536nm处测定吸光值。
每组平行测定三次，取平均值。
羟基自由基清除率的公式如下：
•OH清除率（%）=A（加）-A（损）/A（未损）-A（损）*100%（公式2-5）
式中：
A（加）：
为加入样品（抗氧化剂）及双氧水；
A（损）：
不加入抗氧化剂只加双氧水；
A（未损）：
两者都不加，加蒸馏水作为参比。
2.2.6扶芳藤中总黄酮提取物清除DPPH·自由基清除能力的测定（DPPH法）（丰永红，2002）（BenzieIFF等，1996）
（1）原理：
DPPH（二苯代苦味酰基自由基）是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm处有最大吸收峰。
当向DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，吸光度变小，吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，故可用于检测自由基被清除的程度。
清除自由基的能力用抑制率表示，抑制率越大，表明该物质的抗氧化能力越强。
（2）清除DPPH·自由基的实验：
分别吸取未稀释的总黄酮提取液、按照体积比稀释为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%总黄酮提取液、对照芦丁溶液及VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释总黄酮提取液浓度相同）2.0ml，加DPPH溶液（用80%乙醇定容至8mg/L，存放于棕色试剂瓶中）2.0ml，以80%乙醇为空白参比溶液，测定溶液在517nm处的吸光值A1；同时测定总黄酮提取液、按照体积比稀释为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%总黄酮提取液、对照芦丁溶液及VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释总黄酮提取液浓度相同）2.0ml与80%乙醇2.0ml混合液在517nm处的吸光值A2；再测定DPPH溶液2.0ml与80%乙醇2.0ml混合液在517nm处的吸光值A0。
每组平行测定三次，取平均值并按以下公式计算样品的抑制率。
DPPH·自由基抑制率的公式如下：
抑制率（%）=[1-（A1-A2）/A0]*100%（公式2-6）
式中：
A1：
为样品溶液与DPPH溶液混合液的吸光值；
A2：
为样品溶液与80%乙醇溶液混合液的吸光值；
A0：
为DPPH溶液与80%乙醇溶液混合液的吸光值。
3 结果与分析
3.1扶芳藤叶中总黄酮提取物的含量
表1扶芳藤叶中总黄酮提取物的含量
C（mg/ml）
A（吸光值）
Y（由标准方程得）
提取率（%）
3ml/25ml
0.131
0.116
0.0158
1.31
4ml/25ml
0.135
0.163
0.0217
1.35
5ml/25ml
0.133
0.202
0.0266
1.33
均值
0.133
/
/
1.33
由表1中扶芳藤叶总黄酮提取液的A，根据标准曲线方程Y（C）=0.1251X（A）+0.0013和总黄酮含量计算公式C（mg/ml）=Y*稀释倍数，可得总黄酮类提取物含量为0.133mg/ml；根据公式：
总黄酮提取率（%）=[Y*稀释倍数*V*100%]/1000W，其提取率为1.33%。
iguamg
3.2扶芳藤叶中总黄酮提取物的总抗氧化能力
表2从扶芳藤叶中提取的总黄酮提取物的总抗氧化性
稀释浓度
5%
10%
20%
30%
未稀释
芦丁
VC
吸光值（A）
0.114
0.142
0.186
0.253
0.322
0.390
0.410
图2从扶芳藤叶中提取的总黄酮提取物的总抗氧化性
通过观察在扶芳藤提取液粗黄酮存在时，用Fe3+——Fe2+的转移来检测其还原能力，因为一种物质的总抗氧化能力与它潜在的抗氧化活性有十分密切的关系。
由表2和图2可知，扶芳藤叶黄酮类提取物的总抗氧化性与芦丁、VC的相当，并且在实验浓度范围内，抗氧化能力随着总黄酮提取物浓度增大而提高，说明扶芳藤叶中的总黄酮提取物具有良好的抗氧化能力，完全可以作为天然抗氧化剂使用。
3.3扶芳藤叶中总黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除能力
表3扶芳藤叶总黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除率
稀释浓度
1%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
芦丁
VC
吸光值（A）
1.217
1.212
1.186
1.168
1.142
1.120
0.990
1.439
1.178
吸光值（A0）
1.502
清除率（%）
18.97
19.31
21.04
22.24
23.97
25.43
34.09
4.19
21.57
图3扶芳藤叶总黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除率
由表3、图4可知：
扶芳藤叶黄酮类提取物对超氧自由基有很好的清除作用，在实验浓度范围内，随浓度的升高清除率呈上升趋势。
尽管在提取物浓度很低的情况下，也有很明显的清除效果，并且1%的低稀释浓度的黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除率比对照样品芦丁溶液（0.133mg/ml）还高。
4%的低稀释浓度的黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除率高于VC溶液（0.133mg/ml）的清除率。
由此可看出，扶芳藤叶总黄酮提取物对超氧阴离子的清除效果要优于VC和芦丁。
生物体内氧化还原反应中，大致有2%～5%的氧会产生超氧自由基，超氧自由基的毒性是机体发生氧中毒的主要原因，表现在使核酸链断裂，多糖解聚和不饱和脂肪酸过氧化作用，进而造成遗传突变，膜损伤，酶系失灵，线粒体氧化磷酸化作用改变等一系列变化。
此实验表明，扶芳藤叶中的总黄酮提取物可通过良好的清除超氧自由基能力来保持机体正常的生理机制。
3.4扶芳藤叶中总黄酮提取物羟基清除能力
表4扶芳藤叶总黄酮提取物对羟基自由基的清除
稀释浓度
5%
10%
20%
30%
未稀释
芦丁
VC
清除率（%）
8.40
21.00
27.73
31．09
46.22
41.18
64.71
A（样品）
0.074
0.089
0.097
0.101
0.119
0.113
0.141
A（未损伤）
0.183
A（损伤）
0.064
图4扶芳藤叶总黄酮提取物对羟基自由基的清除
由表4、图4可知，扶芳藤叶总黄酮提取物对羟基自由基有显著的清除作用，并且随总黄酮提取物浓度的增大，清除率随之增加。
并且未稀释的扶芳藤叶总黄酮提取物（0.133mg/ml）与相同浓度的芦丁相比，其清除率还高于芦丁，但略低于VC溶液。
因此，扶芳藤叶中总黄酮提取物对羟基自由基有较好的清除作用。
有研究表明，自由基与机体的许多功能障碍和疾病的发生有关，因此研究自由基的检测方法并探讨物质对自由基的清除作用具有重要意义[12]。
对于生物体而言，羟基自由基是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，且反应速度快。
羟基自由基的半衰期很短，一般存在时间不足，即它与其他分子反应而全部消失[13]。
然而，由它引起的自由基链反应却可在较大范围内造成生物体的损害。
此实验表明，扶芳藤叶中的总黄酮提取物可通过良好的清除羟基自由基能力来行使抗氧化功能。
3.5扶芳藤叶中总黄酮提取物对DPPH·自由基的清除能力
表5扶芳藤叶总黄酮提取物DPPH·自由基的清除
稀释浓度
1%
3%
5%
10%
20%
30%
未稀释
芦丁
VC
吸光值A1
0.553
0.519
0.430
0.395
0.217
0.123
0.143
0.110
0.044
吸光值A2
0.005
0.017
0.018
0.029
0.043
0.050
0.094
0.017
0.011
吸光值A0
0.670
清除率（%）
18.21
25.07
38.51
45.37
74.03
89.10
92.69
86.12
95.07
图5扶芳藤叶总黄酮提取物DPPH·自由基的清除
由表5、图5可知，扶芳藤叶总黄酮提取物对DPPH·自由基有显著的清除作用，并且随总黄酮提取物浓度的增大，清除率随之增加，未稀释的扶芳藤叶总黄酮提取物对DPPH·自由基清除率高达92.69%，其清除能力略高于相同浓度的芦丁溶液，与相同浓度的VC溶液相当。
因此，扶芳藤叶中总黄酮提取物对DPPH·自由基有良好的清除作用。
4结果讨论
实验采用索式提取法提取了扶芳藤叶中的总黄酮，此法操作简便，并在提取过程中采用石油醚脱脂，提高了提取液中总黄酮类化合物的纯度。
以芦丁和Vc作为对照，扶芳藤叶中总黄酮提取物的体外抗氧化性研究表明，扶芳藤叶总黄酮提取物有良好的抗氧化性，能有效地清除羟自由基，超氧阴离子自由基，DPPH·自由基，且在实验浓度范围内，随着扶芳藤叶总黄酮提取物浓度的升高其清除能力呈上升趋势。
因此，从扶芳藤叶中提取的总黄酮可以作为天然的抗氧化剂摄入到机体内，抑制或解除自由基对机体产生的伤害，从而保护机体的健康。
因此，扶芳藤叶可以加强作为天然抗氧化剂方面的开发，提高扶芳藤叶的深加工的经济价值。
我国的扶芳藤种质资源非常丰富，育种潜力大，通过引种、育种和适当的栽培措施可培育出适应多种条件具有多种用途的新品种。
扶芳藤的药用价值高
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