学士学位论文orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定.docx
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学士学位论文orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定
NANCHANGUNIVERSITY
学士学位论文
THESISOFBACHELOR
题目:
orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定
学院：
生命科学院系生物技术系
专业班级：
生物工程
南昌大学
学士学位论文原创性申明
本人郑重申明：
所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果。
对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。
本人完全意识到本申明的法律后果由本人承担。
作者签名：
日期：
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保密□，在年解密后适用本授权书。
本学位论文属于
不保密□。
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作者签名：
日期：
导师签名：
日期：
orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定
专业：
生物工程学号：
XXX
学生姓名：
XX指导教师：
XXX
摘要
细胞质雄性不育（CMS）现象在植物中普遍存在，表现为雄性败育，但雌配子和营养生长正常。
用于三系杂交水稻避免人工去雄，具有很高的实用价值。
然而细胞质雄性不育是细胞核质互作的结果，可以为研究核质互作的分子机理提供一个很好的材料。
线粒体基因组分子内形成异常嵌合基因是CMS产生的基础，由于水稻花药线粒体体外培养及植物线粒体直接转化技术的限制，水稻CMS分子机理研究进展缓慢。
然而细菌基因的转录和翻译及能量合成方式与线粒体具有较大的相似性。
线粒体基因orfH79是水稻红莲型细胞质雄性不育基因。
所以本实验将不育基因导入大肠杆菌中来研究。
线粒体中央是基质，基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。
线粒体对呼吸作用的能量代谢起重要作用，而丙酮酸激酶是能量代谢的关键酶。
本实验就是研究orfH79基因对丙酮酸激酶的影响，即通过测酶活来表明，就是看orfH79基因对丙酮酸激酶的酶活的影响。
本实验就是通过测定管和对照管的丙酮酸激酶酶活的大小，来推出orfH79基因对丙酮酸激酶的酶活影响，最终推出不育基因对丙酮酸激酶的影响。
关键词：
细胞质雄性不育；orfH79基因；大肠杆菌；丙酮酸激酶酶活
orfH79transformede.colienzyme
determinationofpyruvatekinase
Abstract
Thephenomenonofcytoplasmicmalesterility（CMS）iswidespreadinplants，performanceofabortivemale,butfemalegameteandvegetativegrowthnormal.Itisusedforthree-linehybridricetoavoidartificialemasculation,hastheveryhighpracticalvalue.Cytoplasmicmalesterility（CMS）isthenucleusinteractions,howeverasaresult,tostudyonmolecularmechanismofkaryoplasminteractionprovidesagoodmaterial.MitochondrialgenomewithinmoleculesformabnormalchimericgeneisthebasisofCMStoproduce,becausethericeanthermitochondrialmitochondriainvitrocultureandplantthelimitationofdirectconversiontechnology,riceCMSmolecularmechanismresearchprogresshasbeenslow.However,bacterialgenetranscriptionandtranslationandenergysynthesismethodandmitochondriahasgreatsimilarities.MitochondrialgenesorfH79typeisred-violetricecytoplasmicmalesterilegenes.Sothisstudywillresearchsterilitygeneintoe.coli.Mitochondria,thecentralisamatrix,matrixcontainsalltherequiredenzymesandtheKrebscycle,theliningofrespiratorychainenzymesandATPenzymecomplexes.ThisexperimentistostudytheeffectoforfH79geneofpyruvatekinase,namelybymeasuringtheenzymeactivityshowthatiswatchingorfH79genesaffectenzymeactivityofpyruvatekinase.Thisstudyisthroughthetubeandtotakecareofthesizeofthepyruvatekinaseenzymeactivity,tolaunchorfH79geneticinfluenceontheenzymeactivityofpyruvatekinase,finallyintroducedsterilitygeneeffectsonpyruvatekinase.
Keywords：
cytoplasmicmalesterility；OrfH79gene；E.coli；Pyruvatekinaseenzymeactivity
目录
摘要............................................................Ⅰ
Abstract........................................................Ⅱ
目录..........................................................Ⅲ
第一章引言.....................................................1
1.1植物细胞质雄性不育研究意义.................................1
1.2植物细胞质雄性不育可能的形成机理...........................1
1.3线粒体基因与植物细胞质雄性不育.............................2
1.4利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育.........................3
1.5丙酮酸激酶与线粒体的关系..................................5
1.6研究目的及意义.............................................5
第二章材料与方法................................................7
2.1实验材料与试剂..............................................7
2.2试验方法.....................................................8
第三章实验结果与分析.............................................10
第四章实验讨论...................................................13
4.1微量orfH79蛋白抑制丙酮酸激酶的酶活......................13
4.2orfH79基因抑制大肠杆菌生长机理............................14
参考文献..........................................................16
致谢..............................................................19
第一章引言
1.1植物细胞质雄性不育研究意义
植物细胞质雄性不育（cytoplasmicmalesterility,CMS）是一种因线粒体基因区域的改变（突变、重排、转座等）所导致的、不能产生有活力花粉的母状遗传性状，是高等植物中较为常见的生物学特征，广泛存在于大约150个物种中。
由于细胞质雄性不育系统在研究核质互作、细胞器遗传转化、杂交种商业化生产等方面所具有的优势，科学家们做出了长期的努力、希望弄清其形成机理。
以前的研究大多集中在对CMS的花粉败育时期和原因、不育的稳定性及可恢复性等进行了较多的经典研究。
随着分子生物学理论和技术的迅速发展更新，特别是细胞器分离技术和离体翻译体系的建立，极大地推进了在分子水平对植物细胞质雄性不育机理的研究，丰富了人们对CMS现象的认识。
本文则是利用水稻雄性不育来研究核质互作。
1.2植物细胞质雄性不育可能的形成机理
尽管在一些植物中已经鉴定出与CMS有关的线粒体DNA片段，但是对植物细胞质雄性不育的机理仍然知之甚少。
一般推测，植物CMS形成机理有两种：
第一种线粒体基因组中新的嵌合阅读框与其相邻近的保守基因共转录，造成保守基因的单顺反子转录本减少，从而减少了保守基因编码的蛋白量致使植物的某些功能异常或丧失而不育；第二种新的嵌合阅读框编码了一个毒性蛋白，该蛋白干扰保守基因的生物活性或干扰花药发育中的生理生化过程从而中断花粉发育形成雄性不育。
从恢复基因对CMS的影响来看,如果是第一种原因引起CMS,那么相应的恢复基因就应该是通过恢复保守基因的表达量来起作用。
对几种植物CMS的研究显示，在恢复基因有与无的两种遗传背景下，虽然嵌合基因的转录模式有明显不同，但都可以检测到线粒体保守基因转录本的存在，且在量上没有明显的区别。
这表明第一种解释并不理想。
对第二种解释目前有较多的实验支持。
He等将含特异启动子、线粒体转导序列、菜豆的不育相关基因orf239的序列导入烟草细胞核基因组，获得了几株含有orf239的不育和半不育的转基因植株。
免疫细胞学分析表明，在转基因植株中异常发育的小孢子细胞壁表达出不育相关蛋白orf239，认为orf239序列的表达可能与转基因烟草的花粉败育直接相关。
赵荣敏等学者将orf224部分编码序列及全长序列导入大肠杆菌，结果发现具有orf224特异表达产物特征的大肠杆菌生长减缓，推测orf224可能编码一个毒蛋白。
在此研究水稻的不育情况利用的是orfH79基因，来研究水稻不育情况的形成途径。
1.3线粒体基因与植物细胞质雄性不育
高等植物线粒体基因组尽管非常庞大，但所编码的功能基因有限。
拟南芥线粒体因组DNA是至今唯一全序列测定的高等植物线粒体基因组，全长366924bp的DNA序列只编码57个基因。
高等植物线粒体基因的编码序列保守性很强，而编码区以外的序列保守性很低，这个特点有利于利用已知基因研究其它各种植物线粒体基因的多态性变在植物线粒体中还DNA含有一些开放的阅读框架，它们能转录，但其功能和编码蛋白不清楚。
这些阅读框有的是通过线粒体基因组重排而形成的嵌合基因；在不同植物中发现的近20个不同嵌合基因中有的与植物雄性不育性有关。
1.3.1确定细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段的方法
确定与细胞质雄性不育相关基因或基因片段，可采用以下几种材料：
1）不育系和保持系；2）不育系和育系的自发回复突变体；3）组培或原生质体融合分化产生的不育和可育植株。
可以采用如下方法：
1）用已知线粒体基因作探针对上述材料线粒体DNA进行RFLP分析或Northern分析，寻找二者间存在差异的基因；2）用限制性内切酶消化不育和正常胞质线粒体DNA，直接从分离胶上回收并克隆不育或正常mtDNA特异片段；3）用AP-PCR、RAID或AFLP等方法比较正常和不育胞质线粒体DNA差异，克隆不育系特异的扩增片段；4）用差异展示的方法，寻找不育与正常胞质线粒体差异RNA。
以上4种方法获得的差异片段可直接作为探针从线粒体DNA文库或eDNA文库中筛选阳性克隆，进而确定与细胞质雄性不育有关的阅读框。
1.3.2与细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段
水稻BT-CMS不育系统的线粒体的DNA含两个atp6基因，而保持系只有一个。
系列分析表明，不育系两个atp6基因中的一个与保持系完全一致,只是在终止子下游49位产生歧化。
另一个atp6基因是一个嵌合基因，来源于线粒体DNA分子内重组，Kodoawki将它定名为urf-rmc。
水稻野败型不育系和保持系除前述发现线粒体DNA酶切带谱有着差异。
大多数小麦不育系来自于普通小麦和提莫菲维小麦的杂交后代，T-CMS小麦体细胞培养再生不育和可育株atp6基因附近有差异；而T-CMS小麦不育系和保持系coxl区域有差异，不育系coxl上游多一个orf256，估计不育系atp6基因区域以及orf256可能与T-CMS小麦不育性有关；另外，有人还发现T-CMS小麦不育系和保持系们rm5、rm8以及atpA也有差异。
对于K-CMS和V—CMS小麦李传友和王斌发现不育系和对应保持系atpA、atp9、cob基因附近有差异。
而黑麦不育和正常胞质的atp6和coxl位点有差异。
1.4利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育
1.4.1利用大肠杆菌研究过的CMS基因
已有的研究表明一些经过转基因鉴定的引起植物细胞质雄性不育的基因，在原核生物中表达对其生长具有抑制作用。
至今为止，在原核生物中CMS分子机理的研究较深入的只有T型玉米细胞质不育基因urf13。
Deway等将urf13基因导入大肠杆菌，发现urf13基因所编码蛋白能吸附在玉米线粒体内膜上，当大肠杆菌培养物中加入methomyl时，大肠杆菌的细胞膜通透性增加并膨胀，同时大肠杆菌的呼吸也受到抑制，最后导致细菌死亡；这种情况与T型玉米离体线粒体加入methomyl的表型类似。
接着Korth在研究T型玉米时，发现URF13蛋白一部分与大肠杆菌线粒体内膜形成低聚状态同时在线粒体内膜上会形成穿孔。
之后，在研究萝卜CMS基因orf138，芥菜CMS基因orf288，BT型水稻CMS基因orf79，向日葵CMS基因orf522时，CMS基因在原核生物中的表达均能对大肠杆菌生长产生抑制作用。
但CMS基因所编码蛋白在大肠杆菌中究竟如何抑制细菌生长的分子机理并没有进一步进行深入的研究。
1.4.2大肠杆菌与线粒体有类似的遗传体系
1.4.2.1细菌的内共生学说
由美国生物学家马古利斯（LynnMargulis）于1970年出版的《真核细胞的起源》一书中正式提出。
是关于真核生物细胞中的细胞器，线粒体和叶绿体起源的学说。
根据这个学说，它们起源于内共生于真核生物细胞中的原核生物。
这种理论认为线粒体起源于好氧性细菌（很可能是接近于立克次体的变形菌门细菌），而叶绿体源于内共生的光合自养原核生物蓝藻。
这个理论的证据非常完整，目前已经被广泛接受。
它的主要根据是：
（1）共生是生物界的普遍现象，例如根瘤菌与豆科植物的共生关系，蓝藻或绿藻与真菌共生形成地衣等。
有一种草履虫，其体内有小的藻类与之共生，并能进行光合作用；过去说澳洲白蚁消化道内生活着一种所谓混毛虫，实际由两种螺旋体、两种真细菌和一种纤毛虫组成，它们能分泌有关的酶，消化纤维素。
特别是近年发现的灰孢藻，它本身并无叶绿素，但有许多叶蓝小体生活在体内，进行光合作用制造食物。
这种共生关系看来建立不很久，因为叶蓝小体在细胞内还不大固定。
灰孢藻的发现是对“内共生假说”的有力支持。
（2）叶绿体和线粒体都有其独特的DNA，可以自行复制，不完全受核DNA的控制。
线粒体和叶绿体的DNA同细胞核的DNA有很大差别，但同细菌和蓝藻的DNA却很相似。
蓝藻的核糖体RNA（rRNA）不仅可以与蓝藻本身的DNA杂交，而且还可与眼虫叶绿体的DNA杂交，这些都说明它们之间的同源性。
（3）线粒体和叶绿体都有自己特殊的蛋白质合成系统，不受核的合成系统的控制。
原核生物的核糖体由30S和50S两个亚基组成，真核生物的核糖体由40S和60S两个亚基组成。
线粒体和叶绿体的核糖体分别与细菌和蓝藻的一致，也是由30S和50S两个亚基组成，这说明细菌和线粒体、蓝藻和叶绿体是同源的。
抗生素可以抑制细菌和蓝藻的生长，也可以抑制真核生物中的线粒体和叶绿体的作用，这也说明线粒体与细菌、叶绿体与蓝藻是同源的。
（4）线粒体、叶绿体的内、外膜有显著差异，内、外膜之间充满了液体。
研究发现，它们内、外膜的化学成分是不同的。
外膜与宿主膜比较一致，特别是和内质网膜很相似；内膜则分别同细菌和蓝藻的膜相似。
总之，“内共生假说”得到了多方面的实验支持，因而被越来越多的人所接受。
1.4.2.2大肠杆菌与线粒体相似性
线粒体在形态，染色反应、化学组成、物理性质、活动状态、遗传体系等方面，都很像大肠杆菌，线粒体具有独立的转录翻译体系，线粒体有其独立的rRNA，tRNA，核糖体等可以用来表达的基因。
这些成分与细胞质相应成分不同，而与细菌的比较相似，不受细胞核控制，且与大肠杆菌一样都具有多顺反子的转录线粒体遗传体系和大肠杆菌有很多相似的地方，如：
（1）DNA结构为环状，无内含子；
（2）核糖体为70S型；（3）RNA聚合酶不被放线菌素D所抑制，溴化乙锭可抑制；（4）氨酰基-tRNA合成酶、tRNA与细胞质中不相同；（5）N-甲酰甲硫氨酰tRNA是蛋白质合成的起始氨酰基tRNA，其对细菌蛋白质合成的抑制剂氯霉素敏感而对细胞质蛋白合成的抑制剂放线菌酮则不敏感。
近年来，科学家发现了原核生物的质膜上存在着与线粒体内膜上结构保守和功能相似的呼吸电子传递链复合体（I，II，III，IV和V）。
所以本文用大肠杆菌代替线粒体，现在没有技术研究线粒体，而线粒体和大肠杆菌有类似的地方，本实验就是将不育基因导入大肠杆菌中来研究。
1.5丙酮酸激酶与线粒体的关系
线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。
基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。
线粒体能为细胞的生命活动提供场所，是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”（powerplant）之称。
线粒体有自身的DNA和遗传体系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。
线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。
线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化，分别对应有氧呼吸的第二、三阶段。
丙酮酸激酶使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP变为ATP和丙酮酸，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，是有氧呼吸的关键酶，是能量呼吸过程中重要的酶，一般认为,丙酮酸激酶活性受参与糖酵解的物质,如磷酸烯醇式丙酮酸、1,6-二磷酸果糖和中间产物等几种物质调节,它们都能增加丙酮酸激酶的活性。
因此,糖酵解的速度正相关于以上几种物质的含量。
丙酮酸激酶是作为糖酵解的重要限制酶之一，影响糖酵解的速度，从而影响有氧呼吸作用。
线粒体又是细胞能量过程重要场所，丙酮酸激酶对于线粒体中反应过程中具有重要的作用。
1.6研究目的与意义
植物细胞质雄性不育在杂种优势利用上的重要价值一直是人们研究的热点，并且是研究核质互作的好材料，对了解植物生命活动机制有重要意义。
然而，植物细胞质雄性不育因其自身的表型特异性，活性线粒体体外操作与培养的技术瓶颈严重阻滞了CMS分子机理的研究。
至今为止，细胞质雄性不育的分子机理仍不清楚。
本课题以大肠杆菌这一与线粒体类似的遗传体系来系统的研究水稻红莲型雄性不育基因orfH79对大肠杆菌抑制机理，同时避开了线粒体体外培养的难题，为研究CMS分子机理提供了一个新的思路。
本课题研究的是雄性不育基因orfH79对大肠杆菌上丙酮酸激酶的影响，是通过测过orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶的酶活测定实现的。
第二章材料和方法
2.1实验材料与试剂
2.1.1菌株与培养基
1）菌株。
构建原核表达载体的工程菌株为pET-28a和BL21均在本实验室-80℃保存。
2）培养基。
LB培养基（1L）：
胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，加入去离子水至1000ml，用5mol/LnaOH调整PH至7.0。
121℃高压灭菌20min。
配置LB固体培养基时，调整PH后加入琼脂粉（15g/L）即可。
2.1.2试剂配制
1）9%的生理盐水：
1.8g的氯化钠定容至200ml的溶液
2）南京建成公司PK试剂盒：
试剂一：
液体60ml×1瓶，4℃保存。
试剂二：
粉剂×2支，-20℃保存，每支用时加蒸馏水1.4ml，用不完的放-20℃以下，可保存3-7天。
（如果样品量少，可以将1.4ml再分成2-3管放-20℃以下保存，每次取一管用，以免反复冻融）。
试剂三：
液体×4支，4℃保存，用不完的仍放4℃—8℃保存。
试剂四：
粉剂×4支，-20℃保存，用时每支加蒸馏水320ul，用不完的试剂放-20℃以下保存。
试剂五：
粉剂×4支，-20℃保存，用时每支加蒸馏水650ul，用不完的试剂放-20℃以下保存。
3）蛋白定量测试盒（100T/96样）：
试剂一：
考马斯亮蓝备液，60ml×1瓶，4℃保存6个月。
考马斯亮蓝显色液的配制：
按考马斯亮蓝贮备液：
双蒸水=1:
4的比例进行配制（即5倍稀释），用多少配多少，现用现配。
试剂二：
蛋白标准，0.563g/L蛋白标准液0.5ml×1支，4℃保存1个月（如要延长时间将标准液分装后-20℃冷冻保存6个月）
4）蛋白提取裂解液（10ml）：
8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%（w/v）CHAPS，l%（w/v）DTT，0.8%（w/v），35mmol/LTris，5mmol/LEDTA。
临用前加入0.1gDTT，100ul PMSF以及80ul两性电解质PH3-10。
5）蛋白提取缓冲液:
0.01mol/L Tris，0.25mol/L葡萄糖.
2.1.3主要仪器
仪器名称
生产厂家
冷冻高速离心机
Milli-Q超纯水系统
超低温冰箱
分光光度计
超声波细胞粉碎仪
摇床
生化培养箱
立式灭菌锅
分析天平
酸度计
超净工作台
快速混匀器
SIGMA公司
Millipore公司
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