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一氧化氮与白内障的研究进展

来源：

医学论文发表——创新医学网

　　作者：

郑茜作者单位：

辽宁医学院附属第一医院眼科

　　【关键词】一氧化氮白内障研究进展

　　1980年Furchgott等[1]发现血管内皮细胞能生成并释放内皮衍生舒张因子（EDRF）稍后又证明其中含有NO。

而后，又于1986年，根据EDRF作用性质与一氧化氮（NO）十分相似，提出并证实EDRF就是NO，具有生理学作用与病理生理学作用的独特生理学效应。

一氧化氮（nitricoxide，NO）是一种内源性血管扩张剂、炎症介质、细胞信使及神经递质。

NO在眼科中的应用越来越受到重视。

它的主要作用：

（1）作为内皮细胞依赖性的血管调节物质。

（2）充当神经递质。

（3）增强机体非特异性免疫防御功能。

（4）细胞保护作用（低浓度）和细胞毒作用（高浓度）。

NO主要是由L-精氨酸和分子氧在NO合成酶（nitricoxidesynthase，NOS）催化下转化为L-羟基一精氨酸，然后进一步氧化成稳定的NO和NO终产物而失去活性。

　　NOS在眼组织中分布甚广，在眼球的许多组织中都有NOS的分布。

NO在视觉系统的生理及病理作用己受到日益关注并开始从各个角度进行探讨，现就NO与白内障研究的进展情况作一综述。

　　1NO的分布、生物学特征与调节

　　1.1NO的分布

　　NO在体内的各种组织中广泛存在，NO与眼病的研究国外始于1993年，比其它学科起步晚。

Kurenni1995年报道用NADPH2硫辛酰胺脱氢酶及一氧化氮合酶（NOS）的组化和细胞免疫法，发现眼内组织存在NOS。

如视网膜外层、锥、杆细胞内节的椭圆体、外核层的光感受器附近、Müller细胞远突、双极细胞等处NADPH2硫辛酰胺脱氢酶活性较高;光感受器内节、少数内核层细胞、神经节细胞次之;而内外丛状层、色素上皮层和视神经等处活性较低。

又发现脊椎动物的小梁网、睫状体、脉络膜、视网膜都有NOS的分布，并证实人的视网膜、葡萄膜、睫状肌和房水通道中同样有NOS的分布[2]。

　　1.2NO及NOS的特性

　　NO是微溶于水的无色气体，其化学性质活泼，可提供一个未配对电子，极不稳定。

它在水溶液中半衰期短（<10s），在生物系统中半衰期小于5s，能很快被氧化成硝酸盐或亚硝酸盐。

当NO与超氧化离子、血红蛋白及其他含血红素的蛋白结合就会失去其生物活性。

NO是在NOS的催化下利用L-精氨酸、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸黄递（NADPH）和O2产生的。

NOS是NO生物合成的关键酶,现已克隆出了三种NOS基因，即NOSⅠ、Ⅱ、III其中两种亚型经常存在,称为结构型NOS（cNOS），第一种为NOSⅠ主要存在于神经元和某些上皮中,第二种为NOSIII多见于内皮细胞,这两种亚型依赖于Ca2+/CaM激活,激活后仅生成少量的NO。

NOSⅡ或诱导型NOS（iNOS）不依赖Ca2+/CaM,在炎症或免疫刺激的条件下能在多种细胞中表达，活化后长期保持活性，并生成大量的NO。

NO可由氧自由基、血红蛋白、氢醌等灭活，最终生成硝酸盐或亚硝酸盐。

它是一种兼具细胞间和细胞内的重要气体信息分子和神经递质，具有广泛的生理功能，其作用是通过鸟苷酸环化酶激活，激发CAMP水平升高来实现的。

而体内NO生成不足或过量均可产生毒性作用。

病理情况下，各类刺激因素可激活iNOS引起NO大量产生。

　　1.3一氧化氮合成的生物调节

（1）底物的调节：

多种细胞中都发现精氨酸—瓜氨酸—精氨酸循环的存在，因而L-Arg可不断得到补充，不是反应的主要限速物质。

但L-Arg类似物可与其竞争一氧化氮合酶，从而抑制NO的合成。

分子氧对不同组织中的NOS有不同作用，阴茎神经中NOS在血氧分压低时活性降低，生成NO减少[3]，而心肌细胞缺氧时却产生更多的NO[4]。

（2）产物的调节：

生成的NO可反馈抑制NO的产生，但是NO存在时间短暂，不可能大量生成，因此可以忽略此抑制。

然而，NO也能直接抑制NOS，从而影响NO的产生[5]。

（3）一氧化氮合酶的调节：

内源性NO的合成离不开NOS，因此NOS才是合成NO的主要限速物质。

固有型一氧化氮合酶（cNOS）主要由与钙离子升高有关的因素来调节其活性，而诱导型一氧化氮合酶（iNOS）则须经脂多糖（LPS）、细胞因子及肿瘤细胞等诱导数小时才产生，进而影响NO的产量。

　　2NO在白内障发病机制中的作用

　　白内障是当今世界主要致盲眼病之一，目前认为其形成机制是多种因素综合影响的结果。

自由基氧化损伤晶状体是白内障形成的重要因素之一。

其机制是自由基（NO）与晶状体内谷氨酸氧化还原调节部位的巯基结合，使之亚硝酰化形成二硫键[6]，大多数白内障晶状体核的不溶化部分都有明显的二硫键增多。

NO还可以引起细胞核酸亚硝酰化，破坏DNA的螺旋结构，导致细胞损害。

　　3NO与老年性白内障

　　老年性白内障是老年人视力下降的主要原因[7]。

白内障患者血中NO含量变化，提示老年性白内障发病与氧自由基水平有一定关系，符合氧化损伤学说。

Lee等在动物实验中注意到高浓度NO可导致白内障[8]。

王冬兰等的研究也揭示老年性白内障晶状体NO含量明显高于正常[9]。

韩瑶等则用美国Waters公司的高效液相色谱分析仪检测白内障组血浆、房水中NO量，发现其平均含量明显高于对照组[10]。

最新的动物研究发现氧化损伤先于晶状体混浊，表明氧化损伤是其形成的最初因素。

晶状体细胞膜最易受到外界的损害。

当晶状体受到自由基NO的攻击，NO与O2-结合产生毒性很强的ONOO-，氧化蛋白质的巯基,使多种酶失活,影响生物膜的功能[11]。

高浓度的NO对晶状体产生很强的氧化损害,晶状体上皮细胞DNA直接被损伤，而不能正常复制和转录，造成晶状体结构和成分改变，最终形成白内障。

白内障患者血中NO含量明显增高，证实了NO与老年性白内障发病机制有关。

老年性白内障形成机制是多种因素综合影响的结果，但NO对晶状体的损害不应忽视。

某些原因造成的体内NO含量增高，晶状体赖以维持的正常代谢内环境改变，都能造成晶状体混浊。

　　4NO与糖尿病性白内障

　　NO是一种结构简单的活性物质，也是一种自由基，作为重要的细胞信使和效应分子介导调节多种生理功能。

晶状体在产生维持其透明性和内外离子平衡所需的能量——糖代谢中，能产生大量的自由基。

生理条件下主要是还原型单糖D-葡萄糖、D-甘油酸自氧化产生大量的自由基活性氧、ROO-等。

代谢异常时，自由基生成剧增、堆积并损害周围组织。

晶状体上皮细胞质膜中含有很多不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化反应形成脂质过氧化物，并在反应过程中形成多种自由基中间产物，最终导致白内障形成。

　　5NO与辐射性白内障

　　长期紫外线（包括阳光、工作环境中的电焊光、水银蒸汽弧光、钨弧光等）的照射通过作用于对紫外线敏感的成分，产生活性氧自由基，引发对晶状体的氧化损伤而导致白内障的发生[12]。

紫外线，波长320～400nm（UV—A）则绝大部分被晶状体吸收。

UV—A的放射能量到达晶状体上皮细胞，使其产生光化学反应，光解晶状体细胞内的色氨酸，产生N—甲酰犬尿氨酸，后者作为内源性光敏剂，可多途径产生活性氧自由基。

现已发现老年人晶状体的可溶性蛋白中含有光敏剂，在紫外线照射下可产生活性氧。

除紫外线外，还有α、β、γ等射线和其他微波均可在组织内产生自由基，它们引发白内障的机制与紫外线相似可以通过产生的自由基对晶体造成氧化损伤或者直接对DNA造成损伤[13]。

　　6房水中NO与白内障

　　JurowskiP等[14]通过一系列研究发现超乳术后放或不放IOL，房水中NO水平均高于对照组，超乳+IOL植入术后第1天，及超乳不放IOL术后第3天NO水平最高。

但是明显低于以前囊外摘除术组。

从而得出结论:

晶体摘除后高水平NO会破坏血房水屏障。

　　同年，ErH等[15]通过估计Nd:

YAG激光后囊切开术后房水中NO，细胞因子如IL-1β，IL-2R,IL-6，TNF-α的出现，发现NO和细胞因子在Nd:

YAG后囊切开术后早期炎症的发生中是强大的炎症介质。

　　KaoCL[16]等通过确定NO在不同年龄、不同病因白内障临床表现中的作用，得到结果：

外伤障病人房水中NO水平最高，幼年白内障病人房水中NO平最低（47.59±12.18）micromol/L，（7.66±2.62）micromol/L;P<0.001。

房水NO水平与年龄相关，80岁以上及成熟白内障病人最高[分别为（38.78±6.29）mM/L,（40.15±6.15）mM/L,P<0.05]。

从而得出结论：

房水中NO水平随年龄及外伤而升高，NO可能是白内障形成的危险因素。

　　7NO临床应用前景

　　综上所述，NO作为一种功能复杂的内源性小分子反应气体，对组织既有保护作用，如扩张血管并充当神经递质等，也有损害作用，如作为自由基有很强的氧化作用，造成细胞的损伤。

目前人们正从各个方面将N0、NOS促进剂及抑制剂进行临床研究，并己取得了一些成绩，这些研究在将来可能为青光眼、白内障[17]、葡萄膜[18]炎等的药物治疗提供新的方法。

　　【参考文献】

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视网膜光损伤凋亡机制研究进展

来源：

医学论文发表——创新医学网

　　作者：

刘凯，刘丹作者单位：

辽宁医学院附属第一医院眼科，辽宁锦州121000

　　【关键词】视网膜光损伤凋亡机制研究进展

　　光对视网膜的损伤包括热灼伤、光化学损伤和机械损伤三种方式。

因为眼内组织色素分布的差异，蓝光主要在神经上皮层吸收，主要引起视网膜光化学损伤;绿光在神经上皮和色素上皮的吸收相近;黄光主要在色素上皮和脉络膜浅层被吸收;红光则作用得更深，主要引起热效应;而高能量的激光可以引起机械损伤。

凋亡是视网膜细胞光损伤的主要结果之一，氧化损伤、钙稳态失衡和线粒体损伤在凋亡过程中起着不同的作用。

　　1氧化损伤导致的视网膜细胞凋亡

　　视网膜光损伤的主要损伤部位通常是在光感受器[1]，但也有研究认为主要损伤在视网膜色素上皮细胞、Muller细胞及视网膜全层的线粒体[2]。

视网膜细胞尤其是光感受器细胞和色素上皮细胞代谢活跃，又处于富氧环境中，适当频率的光子和氧分子在视网膜外层可发生光化学反应，生成活性氧产物。

花生四烯酸是细胞膜中的一种不饱和脂肪酸，在活性氧作用下可不经环氧化酶作用而生成过氧化产物isoprostane，TzveteDentchev等[3]在对Balb/c小鼠视网膜提取物的检测结果显示，伴随光损伤程度加重相应的isoprostane异构体F2α-VI含量的明显升高，这与以往对其它氧化指标的研究结果相符。

细胞膜构成物质的破坏可导致其通透性的上升，使膜两侧各种物质如钙离子，钠钾离子的平衡状态发生改变，触发凋亡，严重的可以直接引起细胞死亡。

　　鹿庆等[4]利用次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应产生氧自由基来处理牛RPE细胞，证实氧化损伤后出现了细胞DNA的破坏。

一般认为，基因发生异常后由野生型P53基因编码的P53蛋白在细胞周期的G1期发挥检查点功能，一旦发现有缺陷的DNA，它就启动DNA修复机制，如果修复失败，则通过直接激活bax凋亡基因或下调bcl-2抗凋亡基因的表达而诱导凋亡。

但是，MartiA与HafeziF[5]等通过对P53基因缺失的c57小鼠的研究发现,P53缺失与P53不缺失小鼠的光感受器细胞在细胞凋亡,结构改变及功能损伤等方面都无显著性差异。

推测可能与光感受器细胞的细胞周期停滞特性有关，在凋亡过程中可能由其它基因起着作用。

　　NF-κB是一种广泛存在于真核细胞胞浆中的转录因子，它可被氧化剂和紫外线等多种细胞外刺激激活。

激活后的NF-κB与其抑制蛋白IκB解离，然后自胞浆进入胞核与靶序列结合，调节基因的表达。

将培养的鼠感光细胞暴露于4.5mw/mm的可见光后，细胞可出现凋亡及时间依赖的NF-κB水平降低。

光感受器细胞经显性负突变型IκBa转染后，伴随NF-κB水平的明显下调光感受器细胞凋亡也加速[6]。

提示NF-κBRel亚单位在核内的存在，对于保护光感受器细胞免受光诱导的凋亡具有重要的作用。

　　另外，氧化应激可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，Ballinger等[7]的研究表明，慢性的、低水平的ROI（reactiveoxygenintermediates）持续存在将通过线粒体DNA的损伤启动视网膜色素上皮细胞的功能障碍。

　　2钙稳态失衡与视网膜细胞凋亡

　　以往的研究发现，在大多数细胞凋亡过程中，胞内Ca2+浓度有所增加，而钙释放通道是细胞内钙增加的主要来源。

EdwardDP[8]和Li[9]等分别使用氟桂利嗪（flunarizine）和尼莫地平（Nimodipine）治疗实验性大鼠视网膜光损伤，结果证明前者损伤减轻而后者无效，提示内钙的释放才是胞内Ca2+浓度升高的主要原因。

1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R）主要分布于内质网（ER），外界的刺激作用于细胞，通过G蛋白偶联受体激活PLC，水解PIP2产生IP3和DG，IP3与受体结合触发内钙释放。

胞膜钙通道受刺激可引起Ca2+内流，Ca2+是IP3对IP3R的共同激动剂，又可通过钙调素（CaM）而抑制IP3R介导的Ca2+释放。

也有研究认为维拉帕米（Verapamil）能诱导人RPE细胞的凋亡，可能是通过caspase-3途径起作用[10]。

一般认为，细胞内Ca2+的释放是触发环节，而细胞内Ca2+浓度在高水平维持需要细胞膜钙通道的持续作用。

　　Ca2+浓度升高引起的其他改变：

AP-1因子如c-fos、jun两大类核磷酸蛋白，与感光细胞的许多生理周期的调节有关：

如感光细胞膜盘的脱落，感光细胞特异性基因的表达（如视紫质、转导蛋白）。

在Ca2+浓度升高能够刺激fos和jun蛋白形成复合体，这些复合体与特异性的DNA序列结合而发挥作用。

张跃红等[11]的实验显示在光照后6h,外核层可观察到大量c-fos阳性表达,且该时段阳性细胞数最多，光照后12h和36h,仍可见阳性表达,但呈现出逐渐递减的趋势。

Hafezi等[12]的研究表明c-fos缺乏能抑制光诱导的感光细胞凋亡。

Calpains是一类特异性依钙激活的中性半胱氨酸酶，在细胞骨架的重建、细胞分化、细胞凋亡和信号传导中起着重要作用。

当细胞内Ca2+浓度超过一定的值时,Calpain激活成活性形式,使底物发生降解，发生凋亡[13]。

刘凯,等：

视网膜光损伤凋亡机制研究进展辽宁医学院学报2008年4月，29

（2）

　　另外,Ca2+可激活一氧化氮合酶（NOS），使黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶,导致氧自由基的形成,氧自由基引起的脂质过氧化又可造成大量的Ca2+内流,进一步加重光损伤的程度。

　　3线粒体损伤与视网膜细胞凋亡

　　线粒体是细胞的能量工厂，在细胞凋亡期间尽管线粒体仍能维持其超微结构的基本正常，但事实上其功能已发生显著改变，如：

线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜的跨膜电位下降，能量合成水平显著降低等。

ATP的代谢异常会引发一系列的离子泵功能障碍，且线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能受抑制即可引起细胞凋亡。

线粒体膜的通透性一般认为与内外膜之间的线粒体通透性转换孔（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP）有关。

线粒体膜通透性转运（mitochondrialpermeabilitytransition,MPT）和MPTP的开放可能是引起细胞凋亡的原因[14]。

线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡的启动因子如：

细胞色素C，凋亡蛋白酶激活因子Apaf和凋亡诱导因子AIF等从线粒体内释放出来。

细胞色素C再进一步与Apaf-1结合后,经一系列凋亡蛋白酶参与的反应最终作用于底物导致细胞凋亡[15]。

已经在体外培养的人RPE细胞经蓝光损伤后观察到与线粒体膜电位降低、细胞色素C释放相关的凋亡现象[16]。

而在凋亡的细胞色素C途径上，可能存在着“分子制动器”类的核甘酸[17]，即线粒体受刺激释放的细胞色素C是微不足道的，必须持续释放大量的细胞色素C才能克服分子制动器的作用才能引起凋亡。

然而在视网膜细胞光损伤中，这类核甘酸的存在是否有意义仍然未知。

　　4目前光损伤理论在临床上的研究及应用

　　关于白内障手术和老年性黄斑变性（AMD）的相关性研究已有很多。

Taylor[18]的研究发现,蓝光与AMD发展到视觉缺失的过程有明显的相关性。

白内障摘除后蓝光对视网膜的损伤,可能是加速AMD发展的原因之一[19]。

白内障术后人工晶体眼将过多的暴露在蓝光下，可滤过蓝光的人工晶体能对视网膜起到更多的保护作用。

近年来也有采用视网膜移植的方法来治疗光性损伤导致的视网膜光感受器的退行性变性的研究，但其操作难度较大，而且长期效果也有待观察。

　　经瞳孔温热疗法（TTT）采用的红外激光将热能通过瞳孔输送到脉络膜和色素上皮,以达到温热治疗眼底病变的目的。

目前已逐渐应用于治疗老年黄斑变性（age-relatedmaculardegeneration,AMD）等眼底疾病，随着TTT激光能量增加,视网膜组织出现肿胀、变性甚至坏死。

细胞凋亡逐渐累及内颗粒层和神经节细胞层[20]。

过量的TTT治疗可以显著地诱导凋亡的产生,阈能级TTT照射不引起神经节细胞严重损伤，较安全，其作用机制以细胞凋亡为主[21]。

　　小结在视网膜光损伤的凋亡过程中，氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤三方面在凋亡的发生上即可单独启动，又表现出复杂的交互作用，这三种机制互相联系，互为因果。

借助于基础理论研究的深入，对控制光损伤视网膜细胞凋亡的研究取得了一定进展，但是临床上针对存在视网膜细胞凋亡疾病如