中国人类遗传资源DNA提取和纯化技术标准操作规程.docx
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中国人类遗传资源DNA提取和纯化技术标准操作规程
中国人类遗传资源DNA提取和纯化技术标准操作规程
作者：
张伟文章来源：
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2009-11-19
23:
25:
58扭
StandardOperationProcedureforExtractionandPurificationofDNA
（讨论稿）
中国人类遗传资源平台项目组
2006年1月I
近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的各个领域，运用DNA提取和纯化技术的人员数量与日俱增。
提取
DNA的方法分为很多，根据不同类型标本或不同实验目的，DNA提
取方法不尽相同。
商业化DNA提取和纯化试剂也名目繁多。
为了合理有效的利用我国人类遗传资源，结合实际工作需要，特制定一套行之有效、符合我国国情的DNA提取和纯化技术标准操作规程。
本规程包括实验室设置、工作区域功能和设备、样品的选择和保存、
DNA提取、DNA质量签定、DNA标本保存、记录管理和注意事项
及实验室安全。
本规程规定了人类遗传资源库DNA标本提取和纯化实验应遵守的操
作规程。
本规程适用于所有向人类遗传资源库提交人基因组DNA标本的DNA实验室。
本规程适用于从人体体液、细胞、组织等标本大批量提取和纯化DNA,并包括对DNA样本长期保存。
DNA提取和纯化技术标准操作规程
1范围本规程规定了从人类血液、组织、体液、培养细胞中提取和纯化基因组DNA的系列方法，同时详细阐述了DNA提取的软硬件设备要求。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。
GB/T1.1-2000标准的结构和编写规则
GB19489-2004生物安全通用要求
ISO15189医学实验室质量和能力的专用要求
ISO9001:
2000质量管理系统-要求
WS233-2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则《人类遗传资
源管理暂行办法》中华人民共和国卫生部
3术语和定义下列术语和定义适用于本规程
3.1DNADeoxyribonucleicAcid即脱氧核糖核昔酸，是遗传信息储存及传递者。
3.2体液Bodyfluid又称细胞外液，包括血液、淋巴以及器官、组织之间的组织液等。
3.3细胞Cell是一种物理性实体，生命的基本单位，也是构成人体基本的结构和功能单位。
3.4组织Tissue即由多种细胞组成的、完成某一生物学功能并由毛细血管来提供营养的，如骨骼、肌肉和胰腺等。
3.5Southern杂交分析SouthernBlotting
一种用转移技术进行基因组DNA特定序列的分析方法，由Southern提出，故称Southern杂交分析。
3.6聚合酶链反应PolymeraseChainReaction
或多聚酶链反应（PCR），是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法。
3.7基因文库GeneBank
即将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，包括其中每一种片段的汇总。
3.8脉冲凝胶电泳PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE是一种分离大分子DNA的方法。
在脉冲凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。
DNA分子带有负电荷，朝正极移动。
相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困難。
因此小分子向前移
动的速度比大分子快。
脉冲凝胶电泳可以分离从10kb到10Mb不同
大小的DNA分子。
4实验室设置
4.1实验室应分为至少4个隔开的工作区域，即试剂贮存和准备区、
DNA提取区、DNA质量分析区和DNA标本保存区。
24.2上述特定实验区有关的各个房间必须有明确的标记，严禁不同工作区内的设备物品如加样器、试剂等的移出移进造成不同的工作区间发生混淆。
4.3进入各个工作区的所有人员和物品必须遵循严格的顺序，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和准备区-DNA提取区-DNA质量分析区tDNA标本保存区。
4.4不同的工作区的所有人员和物品必须使用不同的工作服和标识，可以不同的颜色来区别。
此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
5工作区域功能和设备
5.1试剂贮存和准备区
该工作区用于贮存溶液的制备、溶液的分装。
本工作区仪器设备配置应包括如下：
5.1.14C冰箱和-20C冰柜、混匀器、微量加样器（覆盖P1000□各个容量的加样器）、可移动紫外灯（近工作台面）；
5.1.2专用办公用品、专用工作服和工作鞋；
5.1.3消耗品：
一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头等。
5.2DNA提取区
该工作区用于标本贮存、核酸提取。
本工作区仪器设备配置应包括如
下：
5214C冰箱、一20C冰柜、高速台式冷冻离心机、混匀器、水浴箱或加热模块、微量加样器（包括riooo卩各个容量的加样器）、可移动紫外灯（近工作台面）；超净工作台和超声波水浴（处理大分子DNA适用）
5.2.2专用办公用品、专用工作服和工作鞋；
5.2.3消耗品：
一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头等。
5.3DNA质量分析区
该工作区用于DNA浓度和纯度测定。
本工作区仪器设备配置应包括如下：
5.3.1紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、离心机、
混匀器、加热模块；微量加样器若干支（覆盖I〜1000Q1和可移动紫外灯（近工作台面）；
5.3.2专用办公用品、专用工作服和工作鞋；
5.3.3消耗品：
一次性手套、一次性吸水纸、离心管和加样器吸头等。
5.4DNA标本保存区
该工作区用于DNA标本贮存。
本区仪器设备配置应包括：
一70C冰
柜。
6样品的选择和保存
6.1适合DNA提取的样品包括细胞、体液和组织等。
6.2应登记样品编号、名称、来源、数量、采集时间、采样单位。
6.3样本用适宜方法保存至使用。
7DNA提取方法
7.1酚-氯仿法
7.1.1适用范围
酚-氯仿法提取DNA原理为在有EDTA及SDS等去污剂存在下用蛋白酶K消化细胞，通过酚一氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中的提取方法。
本方法所获DNA片段一般在lOOkb以下。
适用于用于Southern杂交分析、聚合酶链反应（PCR）模板和测序。
7.1.2缓冲液及试剂
1）STE：
10mmol/LTris?
CI（pH8.0）,1mmol/LEDTA（pH
8.0）,1mol/LNaCI；
2）20%SDS；
3）TBS缓冲液：
用800ml蒸馆水中溶解8gNaCK0.2gKCI和3gTris
碱，调pH至7.4,用蒸惚水定容至1L；
4）饱和NaCI；
5）饱和酚；
6）100%氯仿；
7）100%异戊醇；
8）100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、50%乙醇;
9）蛋白酶K；
10）红细胞裂解液：
10mmol/LTris?
CI（pH7.4）,5mmol/LMgCI2,
1mol/L蔗糖，1%Triton-100；
11）二甲苯；
12）20SSC：
3mol/LNacl,0.3mol/L柠檬酸三钠？
2H2O,用HCL调
pH值至7.0；
13）石蜡消化液：
150mmol/LNaCI,15mmol/L柠檬酸钠，1%SDS,pH7.0；
14）TE（pH8.0）：
10mmol/LTris?
Cl（pH8.0）,1mmol/LEDTA（pH
8.0）o
7.1.3细胞样品DNA提取步骤
7.1.3.1单层培养细胞
1）用事先预冷的冰TBS缓冲液将单层细胞洗涤2次，用细胞刮刀将细胞刮入约0.5mlTBS中，将细胞悬液移入置于冰浴的离心管中，并用ImITBS冲洗培养瓶，将冲洗液并入细胞悬液。
4C离心，1500%,10分钟。
倾泻上清液，用5〜10倍体积预冷的冰TBS重新悬浮细胞，再次离心。
倾泻上清液；
2）以细胞数量约为5X107为例：
加入3mlSTE,0.2ml20%SDS,再
加入蛋白酶K至终浓度为100卩g/m,混匀，置55C水浴过夜；
3）从水浴中取出离心管，冷
却至室温，加入1ml饱和NaCI,轻轻混
匀，可见白色沉淀析岀，6000%,离心10分钟；
4）将上清液移至另一干净离心管中，加入等体积酚：
氯仿：
异戊醇
=25:
24：
1混和物，轻轻混匀5分钟，6000冷，离心5分钟，将上层
水相移至新的离心管中；
5）重复步骤4）一次；
6）加入等体积的氯仿：
异戊醇=24:
1混和物轻轻混匀5分钟，
6000材，离心5分钟，转移上层水相移至新的离心管中；
7）加入3倍体积-20C预冷的乙醇，轻轻倒转晃动，可见白色絮状沉淀析出；
8）12000g,离心5分钟，倾出乙醇；
9）用70%乙醇洗涤沉淀，轻轻倒转晃动，12000,,离心5分钟，倾出70%乙醇；
10）将离心管敞开倒置，保持一定角度于滤纸上，直至可见的乙醇挥发；
11）加入适量TE（pH8.0）使DNA完全溶解，如不溶，可在37C摇动过夜；
12）所提DNA可于4C短期放置，或者-20C长期贮存。
7.1.3.2悬浮生长细胞
1）4C离心，1500,,10分钟，倾泻上清液。
用等体积预冷的冰TBS重新悬浮细胞，再次离心，倾泻上清液。
再次重复洗涤细胞沉淀。
2）按7.1.3.1A2）~12）操作。
7.1.4体液DNA提取步骤
7.1.4.1全血（柠檬酸钠抗凝）
1）向10ml全血中加入40ml红细胞裂解液，混匀，静置2分钟；
2）6000gx离心3分钟，弃上清液，加入10ml红细胞裂解液，混匀，静置2分钟；
3）6000X离心3分钟，弃上清液，重复至细胞发白，弃上清液；
4）按7.1.3.1A2）~12）操作。
7.1.4.2其它体液
可按7.1.3.1B悬浮生长细胞处理。
7.1.5组织DNA提取步骤
7.1.5.1新鲜或冰冻组织
1）取1mg组织约含107细胞；
2）将组织置于盛有液氮的组织研磨器内，研磨将组织粉碎，或用
Waring搅拌器粉碎；
3）待液氮挥发，按7.1.3.1.12）-12）操作。
7.1.5.2石蜡组织切片
1）取直径5mm石蜡组织切片15〜20张（85n厚）置于离心管中，加入1ml二甲苯，37C作用3小时，10000%离心3分钟，倾去二甲苯。
重复3~4次，观察管壁是否光滑。
若有蜡质残存，需继续脱蜡。
2）梯度乙醇洗涤：
加入100%乙醇1ml,室温30分钟，10000%离心3分钟，倾去上清液；再加入95%乙醇1ml洗涤；然后为75%乙醇洗涤；最后为50%乙醇洗涤。
3）消化：
加入1XSSC500洗涤沉淀，12000衬离心3分钟。
干燥
沉淀后加400卩石蜡消化液、20卩丨的蛋白酶K（20mg/ml）:
55C消化
120小时，至第四天，补加蛋白酶K10口。
1
4）消化后见液体清亮，肉眼见组织较少。
将其转入98C的水浴箱煮沸
10分钟，以灭活蛋白酶K,置冰上迅速冷却，10000Xg离心5分钟。
5）按7.1.3.1A4）~10）操作。
6）加20卩ITE使DNA溶解。
7.2甲酰胺法
7.2.1适用范围
本程序制备的基因组DNA片段约为7200kb,适于用高包装容量载体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段DNAo
7.2.2缓冲液及试剂
1）抽提缓冲液：
10mmol/LTris?
C（lpH8.0）,0.1mol/LEDTA（pH
8.0）,
20卩g/ml胰RNA酶，0.5%SDS;
2）TBS缓冲液：
用800ml去离子水中溶解8gNaCK0.2gKCI和3gTris
碱，调pH至7.4,用去离子水定容至1L;
3）透析缓冲液仁20mmol/LTris?
CI（pH8.0）,0.1mol/LNaCI,10mmol/LEDTA（pH8.0）;
4）透析缓冲液2：
10mmol/LTris?
CI（pH8.0）,10mmol/LNaCI,0.5mmol/LEDTA（pH8.0）;
5）甲酰胺变性缓冲液：
20mmol/LTris?
CI（pH8.0）,0.8mol/LNaCI,
80%
V/V）甲酰胺；
6）TE（pH8.0）：
10mmol/LTris?
CI（pH8.0）,1mmol/LEDTA（pH8.0）；
7）PBS:
用800ml去离子水中溶解8gNaCI、0.2gKCK1.44gNa2HPO4,0.24gKH2PO4调pH至7.4,用去离子水定容至1L。
7.2.3细胞样品DNA提取步骤
7.2.3.1单层培养细胞
1）用事先预冷的冰TBS缓冲液将单层细胞洗涤2次，用细胞刮刀将
细胞刮入约0.5mlTBS中；将细胞悬液移入置于冰浴的离心管中，并用1mlTBS冲洗培养瓶，将冲洗液并入细胞悬液。
4C离心，1500%,10分钟。
倾去上清液，用5~10倍体积预冷的冰TBS重新悬浮细胞，再次离心。
倾去上清液，用TE（pH8.0）将细胞重新悬浮至浓度为5X107细胞/ml,转移至一个三角烧瓶中，每毫升细胞悬液加入10ml抽提缓
冲液，混匀，37C孵育1小时；
2）将含有裂解细胞和抽提缓冲液的溶液冷却至15Co以细胞数量约为5X07为例，每1ml细胞裂解液加入1.25ml甲酰胺变性缓冲液，混匀，将溶液在15C放置12小时；
3）将溶液装入火棉透析袋中，在4C于透析缓冲液1透析3次，第一次透析45分钟，第二、三次再透析至少4小时；然后再对透析缓冲液2透析3次，每次至少4小时。
7.2.3.2悬浮生长细胞
1）4C离心，1500X,10分钟，倾泻上清。
用等体积预冷的冰TBS重新悬浮细胞，再次离心，倾泻上清。
再次重复洗涤细胞沉淀。
2）按7.2.3.1A2）~3）操作。
7.2.4体液DNA提取步骤
7.2.4.1全血（柠檬酸钠抗凝）
1）若为新鲜全血：
取10ml全血，于1300狗离心10分钟，弃上层血浆，用吸管将淡黄色白细胞沉淀吸至另一离心管中并再次离心，将第二次离心所得淡黄色白细胞沉淀悬浮于7.5ml抽提缓冲液，混匀，37C孵育1小时；若为冰冻全血：
室温融化，取10ml全血，用等体积PBS稀释，3500%,离心15分钟弃去上清液，加入15ml抽提缓冲液，混匀，37C孵育1小时；
2）按7.2.3.1A2）~3）操作。
7.2.4.2其它体液
可按7.2.3.1B悬浮生长细胞处理。
7.2.5组织DNA提取步骤
7.2.5.1新鲜或冰冻组织
1）1mg组织约含107细胞；
2）将组织置于盛有液氮的组织研磨器内，研磨将组织粉碎，或用
Waring搅拌器粉碎；
3）将组织粉末一点一点逐渐加入盛有10倍体积（m/V）裂解液的50ml
离心管中，混匀，37C孵育1小时；
4）待液氮挥发后，重复7.2.3.1A2）~3）。
本方案制备的DNA片段约为20~50kb,适合作为PCR反应模板。
7.3.2缓冲液及试剂
1）细胞裂解缓冲液：
10mmol/LTris?
CI（pH8.0）,1mmol/LEDTA
（pH8.0）,0.1%（m/V）SDS；
2）乙醇（100%）；
3）异丙醇（100%）；
4）醋酸钾溶液:
60ml5mol/L醋酸钾，11.5ml冰醋酸（100%）,28.5ml去离子水；
5）红细胞裂解缓冲液：
20mmol/LTris?
CI（pH7.6）；
6）TE（pH7.6）:
10mmol/LTris?
CI（pH7.6）,1mmol/LEDTA（pH8.0）；
9
7）蛋白酶K（20mg/ml）；
8）无DNase的RNase（4mg/ml）
7.3.3全血（柠檬酸钠抗凝）DNA提取步骤
1）在两个1.5ml离心管中分别转移300□全血样品。
每管中加入900口1红细胞裂解缓冲液，盖上盖子，颠倒混匀。
溶液于室温下放置10分钟，中间颠倒混匀几次；
2）在室温下用13000-16000郞离心20秒；
3）每管保留约20卩止清液，弃去其它部分；
4）用剩余的少量上清液重悬白细胞沉淀。
将两管白细胞悬浮液成一
管；
5）将该细胞悬浮液转移至加有600□冰冷的细胞裂解缓冲液的离心
管中。
用微量研棒迅速研磨30〜50下，混匀裂解液；
6）（此步骤可增加产量，可选作）向裂解物中加入3卩蛋白酶K,于
55C放置3小时以上，但不要超过16小时；
7）将裂解物降至室温，然后加入3□无DNase的RNase
（4mg/ml）。
37C放置15〜60分钟；
8）将样品降至室温。
加入200□醋酸钾溶液，剧烈振荡20秒使其充分混合；
9）用13000-16000呼转速4C离心3分钟，使蛋白/SDS复合物沉淀出来；
10）将上清液转移到加有600卩异丙醇的新离心管中。
充分混合，然后用13000-16000g转速室温下离心1分钟；
11）倾去上清液，加入600卩I70乙醇。
颠倒管子数次，用
13000-16000呼转速室温下离心1分钟；
12）小心吸去上清液，空气干燥DNA沉淀15分钟；
13）将DNA沉淀溶解于100卩ITE（pH7.6）
7.3.4新鲜或冰冻组织
1）7.3.2.1切下10~20mg组织，用7.1.3.3.12）所属方法研磨成粉状；
10
2）其余步骤同7.3.15）〜13）。
8.1紫外分光光度计法
8.1.1原理
8DNA质量鉴定
通过测定DNA对光的吸收，确定核酸的含量和纯度。
该方法不能区别
DNA和RNA的含量。
8.1.2方法
测定A280nm和A260nm光密度。
8.1.3纯度
A260/A280比值应该在1.75〜2.0之间。
8.1.4浓度
单链DNA:
1OD=40卩g/ml
双链DNA:
1OD=50卩g/ml
单链DNA浓度（匕g/ml）二稀释倍数xA260X40卩g/ml
8.2琼脂糖凝胶电泳检测法
8.2.1原理
荧光染料漠乙锭可嵌入DNA分子的碱基平面之间，在紫外线照射下发出荧光，其光强度与DNA含量成正比。
比较同一凝胶中待测DNA样品与系列标准DNA的荧光强度，确定DNA含量；通过与标准DNA分子量Marker比较，可知所提取的DNA是否发生降解。
8.2.2试剂
1）10载样缓冲液：
漠酚篮、二甲基晴蓝、聚蔗糖；11
2）50TAE缓冲液:
Tris、乙酸钠、EDTA；
3）漠乙锭；
8.2.3方法
4）DNA标准液，根据具体需要选用。
8.2.3方法
1）配制琼脂糖凝胶（0.5-0.8%M/V）;在＞8©融解后，室温冷却2
分钟（未形成凝胶状）,加入漠乙锭10卩1/100ml
2）电泳，电压5V/cm,时间20-30分钟；
3）电泳结束后紫外灯/凝胶成像系统下观测。
8.3人类DNA定量试剂盒
DNA定量可购买商品化的试剂盒，操作方法和试剂使用应以试剂盒说明书为准。
9DNA标本保存
DNA质检完毕后，将DNA标本编号，贴标签，置于-70©保存，可保存5年以上。
做好DNA标本贮存登记。
（参照《中国少数民族血样DNA收集整理保存技术规程》）
10记录管理
DNA样品登记、DNA提取实验记录、DNA质量鉴定记录、DNA标本贮存登记由专人统一整理。
（参照《人类遗传资源信息管理技术规程》）
11注意事项及实验室安全
11.1在执行本规程规定的操作中应遵循一般分子生物学实验原则。
11.2应遵从《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）和《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233-2002）的要求。
参考文献
[1]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著黄培堂译分子克隆一一实验指南
（第三版）北京：
北京科学出版社2002年8月第一版
[2]卫生部医政司颁布临床基因扩增（PCR）诊断实验室工作规范（试行）
[3]鄂征主编组织培养和分子生物细胞学技术北京：
北京出版社
1995,461-509
[4]王琳芳杨克恭主编医学分子生物学原理北京：
高等教育出版社
2001,268-281
⑸中华人民共和国公安部法庭科学DNA实验室检验规范GA/T383-
20022002
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