近代分离纯化.docx
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近代分离纯化
1. 在目前基因和基因组时代，你觉得生物大分子的分离纯化还有什么重要意义？
（1）分离大分子，研究其结构与功能， 对于了解生命活动规律有重要意义
（2）满足工业生产的需要（3）满足医疗的需要（4）满足基因工程的需要
2 生物大分子的分离纯化与一般有机化学中的物质分离纯化相比有什么相同和不同之处？
首先，通常原料液中目标产物往往比较低，杂质比较多，其中除了含有目标产物外，还含有未转化的底物，所以说生物大分子的分离纯化是相当困难的。
其次，生物大分子物质大多是生物活性物质，易受环境因素如温度、PH、金属离子和微生物等影响，甚至失活，必须设计合理的分离过程和操作条件，实现目标产物的快速分离纯化，获得高活性的目标产物。
再次，用于药物，食品化妆品的生物产物是与人类生命息息相关的，因此，要求分离纯化过程要除去原料液中的热原及具有免疫原性的异体蛋白质等有害人类健康的物质，并且防止这些物质在分离纯化过程中由外界混入。
最后，原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上非常相似的分子及异构体，形成常法难于分离的混合物，因此，一般需要选择具有高度选择性的分子识别技术或高效液相色谱技术分离纯化目标产物，同时生物产物的原料成分复杂，需要采用多种分离技术和多个分离步骤完成一个目标产物的分离纯化任务。
3 离心技术的基本原理是什么？
颗粒在离心管中离心时要受到那几个力的作用？
原理：
将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。
由于不同颗粒的质量，密度，大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不同，由此便可以得到相互间的分离。
受到的力：
离心力、介质的摩擦阻力、浮力、重力及重力浮力（均可忽略不计）
4 差速沉淀离心的原理时是什么？
有什么特点？
原理：
采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速率不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。
此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。
特点：
操作简单，离心后倾斜即可分离上清和沉淀，并可使用容量较大的角式转子。
缺点是，分离效果差，不能一次得到纯颗粒（2-3次）壁效应严重。
颗粒在离心力过大时间过长情况下变形、聚集而失活，挤压严重。
5 与差速沉淀离心相比，区带离心有什么特点？
此法的优点是：
①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适用范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
缺点是：
①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。
6 什么是差速区带离心法?
有什么特点？
将样品置于平缓的预先制好的密度梯度介质上，进行离心，较大的颗粒将比较小的颗粒更快的沉降。
通过梯度介质，形成几个明显的区带（条带）。
离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同的沉降速率沿管底沉降。
离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚地不连续区带。
特点：
①有时间限制，在任一区带到达管底之前必须停止离心。
②仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒，与密度无关。
大小相同、密度不同的颗粒（如溶酶体、线粒体和过氧化酶体）不能用本法分离③沉降系数越大，往下沉降的越快，所呈现的区带也越低。
沉降系数较小的颗粒，则在较上的部分依次出现。
从沉降的情况看来，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底之前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一些特定的区带内。
④区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。
时间越长，区带越宽。
适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。
7 什么是等密度离心?
有什么特点？
等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。
在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种，密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。
在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的唯一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。
只要被分离颗粒间的密度差异大于1%就可以用此法分离。
特点：
①加样位置不拘；②离心平衡后，区带位置、形状不受时间影响；③梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度；④分离依据是组合间“浮力e”差异，与颗粒大小形状无关；⑤离心力大小，组合颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。
8 离心操作的注意事项有哪些？
离心机是实验室中极常见的分离工具，通常依其使用目的可分为数种：
低速离心机、高速冷冻离心机、超高速真空离心机等；低速又有细胞离心机，以及常见的微量离心机等。
使用离心机首重安全，因为离心机失控可造成很大的破坏，因此要注意离心管是否有平衡，离心转速是否超过极限，离心陀是否有腐蚀或过荷。
注意事项：
1常离心机都会有登记表，请在使用前确实登记使用者、转陀、转速、时间；②离心管一定要平衡好，放入离心陀时也要注意位置平衡，绝对不要超过离心机或离心陀的最高限转速；③一定要在达到预定转速后，才能离开离心机，若有任何异状要立刻停机；④通常听见声音即可得知离心状况是否正常，也可注意离心机的震动情形；⑤使用硫酸铵等高盐溶液样本后，一定要把离心陀洗干净，也要清理离心机转舱；⑥超高速离心机则因转速极高，也更复杂，血药另外的专门训练才可使用。
9 DNA提取时一般使用哪些方法将DNA与其它成份（蛋白质和多糖等）分开？
原理分别时什么？
多糖，脂肪含量不高，易于和核酸分离。
重点是除蛋白，除蛋白一般用变性剂使其变性，形成沉淀而分离。
除蛋白的一般方法：
饱和NaCl溶液、高浓度高氯酸盐、氯仿、阴离子去污剂、苯酚等作用是蛋白变性。
蛋白酶K，从枯草杆菌中提取活性很强，极不易被变性，广泛应用在植物、动物、微生物的DNA提取中。
①氯仿法：
能使活性很强的RNA酶A变性；②去污剂法：
十二烷基硫酸钠SDS、十二烷基硫酸锂LDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸、三异丙基磺酸钠、二甲苯磺酸钠，使蛋白质变性沉淀，离心去除，用冷乙醇将DNA沉淀出来；③苯酚法：
用酚水混合物处理，多糖、核酸属于水相，蛋白质溶于酚相。
可用DNA、RNA提取，其溶蛋白性强，抑制核酸酶，可直接得到核酸。
10 碱变性法提取纯化质粒的基本原理是什么？
简要叙述操作步骤。
原理：
根据cccDNA与线性染色体DNA拓扑学发展，通过加热，PH介于12.0-12.5狭窄范围内，变性线性DNA（环状DNA不易变性）两条链完全分开，即使复性，cccDNA复性准确。
线性DNA（复性时聚集成不可溶的网络状聚合物）与RNA、蛋白等形成沉淀，上清液中的cccDNA用酒精沉淀法分离。
步骤：
①含抗生素（一般50μg/ml）的LB培养基培养菌体37℃ 200rpm 过夜；②吸取1.5ml离心，12000rpm 1-2min，弃上清；③加入预冷的100μl SolutionI,充分震荡悬浮。
加入预冷的200μl SolutionII（现配现用），温和的颠倒约5次，冰浴中3-5min。
加入预冷的150μl SolutionIII，温和的颠倒混匀，冰浴5min；④离心，12000rpm 5-10min；⑤取上清，加等体积酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提各一次，小心转移上层至一新的离心管，弃下层有机相和中层蛋白质。
离心12000rpm 5min；⑥取上清，加入2-3倍体积的无水乙醇，-20℃放置20-30min，离心12000rpm 10min⑦弃上清，沉淀加70%乙醇漂洗一次，室温干燥；⑧悬浮于50μl ddH2O或TE（含RNase）至20ng/μl，-20℃保存。
试剂：
①SolutionI：
50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Hcl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），高压灭菌，4℃保存；②SolutionII：
0.2mol/LNaOH，1%SDS，现配现用；③SolutionIII：
5mol/LKAc60ml，11.5冰乙酸，28.5H2O，4℃保存。
11 提取基因组DNA与提取质粒DNA有什么不同？
要注意哪些事项？
基因组DNA与质粒DNA的高级结构不同，大分子量染色体DNA是线性分子，易断裂，不宜用酚氯仿法提取，需操作柔和；质粒DNA环状，结构紧密，易保持完整结构。
在强碱性环境中，核酸等生物大分子易于变性，DNA分子 易于发生氢键的断裂而形成单链分子，但是处于超螺旋状态的质粒DNA受此影响不大；添加酸性缓冲液后，染色体DNA、蛋白质等大分子难于复性，相互缠绕形成复合物，而质粒DNA分子依然受影响不大。
注意事项:
（1）选材新鲜且预处理时间不宜过长。
（2）温度0℃-4℃，除有特殊要求以外，但不同材料和不同方法对温度要求的严格程度也不同。
（3）PH值要适当，一般中性附近。
（4）避免强烈的理化因素，如局部过酸、过碱、强烈机械切力等，特别对大分子DNA（不使用细的吸管或将枪头剪成大口径的）。
（5）防止核酸酶的作用。
12 DNA纯化后应该如何保存？
DNA在以下条件下比较稳定：
中性PH；低温；暗处（避免紫外光）；合理的盐浓度（如100mmol/L NaCl）；在操作过程中无物理剪切。
在DNA保存过程中，还应防止DNA降解酶对DNA的消化，在保存溶液中适当加入金属离子螯合剂，就能有效抑制降解酶的消化反应，一般使用螯合剂为EDTA（乙二胺四乙酸）。
此外，也应注意避免因污染物（来源于细菌或溶液）而混入DNA溶液中的DNA降解酶。
有三种缓冲液可用于DNA保存：
（1）TE[T10E1:
10mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,1mmol/L EDTA（PH8.0）]。
（2）0.1*TE（用于酶促反应）。
（3）T50E[T50E1:
50mmol/L Tris.HCl（PH8.0）, 1mmol/L EDTA（PH8.0）。
用于溶解PH不稳定的DNA]
13 提取RNA时，常使用灭活RNA酶的试剂有哪几种？
它们灭活RNA酶的原理各是什么？
（1）焦磷酸二乙酯（DEPC）：
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
（2）异硫氰酸胍：
目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
（3）氧钒核糖核苷复合物：
由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
（4）RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：
从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
（5）其他：
SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
14 提取RNA时一般采取哪些措施防止外源的和内源的RNA酶污染？
外源RNA酶的污染来源：
试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
内源RNA酶的污染来源：
抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。
在试验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
防止RNA酶污染的措施：
外源性：
（1）所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烘6小时或更长的时间。
（2）塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：
有机玻璃器具不可用氯仿冲洗，可被腐蚀）。
（3）有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，在浸泡在3%H2O2室温10分钟，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。
（4）配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。
然后用高压灭菌出去残留的DEPC。
不能高盐灭菌的试剂，应用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
（5）操作人员戴一次性口罩，帽子，手套，实验过程中手套要勤换。
（6）设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
（7）为了避免mRNA吸附在玻璃器皿上，所有器皿一律经硅烷化处理。
内源性：
（1）样品采集到后，须立即冷冻，防止内源性RNA酶降解。
（2）提取过程中使用RNA酶抑制剂。
（3）RNA样品正确的
储存。
（4）设计好步骤，尽可能连续进行。
15 纯化的RNA应该如何正确储存？
用乙醇沉淀后，应如下保存：
（1）用去离子的甲酰胺溶液溶解并存于-20℃，甲酰胺提供一种稳定的化学环境。
（2）用水溶解沉淀物并贮存于-80℃。
（3）悬浮溶解的RNA沉淀物贮存于-20℃
16 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理是什么？
核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构想的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。
以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应（样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面，分子量或分子大小和形状的核酸通过一定孔径的凝胶时，受阻滞程度不同，表现出不同的迁移率），使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。
此为分离，鉴定，纯化核算片段的标准方法。
用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。
17 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离有什么关系？
不同构型的DNA的移动速度次序为：
共价闭环DNA[致密超螺旋结构]>直线DNA>开环的双链环状DNA[结构松散]。
当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0）,而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度，缓冲液离子强度等的影响。
琼脂糖浓度越低，移动越快。
18 大分子量DNA的非常规电泳有哪几种类型？
基本原理是什么？
（1）脉冲电场凝胶电泳PFGE:
标准PFGE中脉冲的电厂方向与核酸移动的方向成45°夹角，下一脉冲的电场方向与核酸移动的方向在另一侧亦成45°夹角，使DNA分子能随时调整其泳动的方向，找到适合的孔径。
与分子量较小的DNA相比，大分子量需要更多次的改变构型和方向。
应用PFGE可成功分离分子量高达107bp的DNA大分子。
（2）正交交变电场凝胶电泳OFAGE （3）高钳位均匀电场CHEF （4）倒转电场凝胶电泳FIGF
19 能用作纯化依据的蛋白质性质有哪些？
（1）大小：
分子量，多数蛋白质分子量在10000-150000之间。
（2）形状：
形状不同，通过膜，凝胶填料颗粒，电泳凝胶孔时速度不同。
（3）电荷：
蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带正负电荷总和。
（4）等电点：
PI是蛋白质上净电荷为0时的PH值。
（5）电荷分布：
可均匀分布在蛋白质表面或成簇分布，使某一区域带强正电荷，另一部分带强负电荷。
（6）疏水性：
不同蛋白质表面疏水性的差异而实现其分离纯化。
（7）溶解度：
不同的蛋白质具有不同的溶解度。
（8）密度：
含大量磷酸盐，密度大，含脂质，密度小。
（9）配体结合能力：
许多酶与底物，效应分子，辅助因子和DNA模板等紧密结合。
（10）金属结合能力：
酶与金属离子紧密结合通常是通过胱氨酸，组氨酸残基完成。
（11）可逆性缔合：
某些溶液条件下，酶聚合成二，四聚体等。
（12）翻译后翻译：
糖基化，酰基化，磷酸化等。
（13）特异性序列或结构：
氨基酸残基在蛋白质表面的精确几何表象。
（14）非寻常性质：
A 热稳定性 B 抗蛋白酶解的抗性。
（15）基因工程构建的纯化标记：
在编码目的蛋白质基因一端加6-10个组氨酸基团，表达融合蛋白，与Ni+螯合柱结合，用游离咪唑洗脱或PH降至5.9，使His充分质子化，不再与Ni+结合，而使蛋白质得以纯化。
20 测定蛋白质浓度的方法有哪些？
简要叙述各自原理。
一．凯式定氮法：
当含氮有机物（蛋白质）与硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。
氮转变出氨和硫酸化合生成硫酸铵。
消化完后，在凯式定氮瓶中加入强碱（氢氧化钠溶液等）消化液，是硫酸氨分解，放出氨，用水蒸气蒸馏法，将氨蒸入过量的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合，生成氨离子，使溶液中的氢离子浓度降低。
然后用强酸滴定，直至恢复溶液中氢离子浓度为止。
所用的强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数。
二．紫外吸收法：
①280nm光吸收法：
由于蛋白质中络氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在275-280nm波长处有一个紫外吸收高峰，在一定范围内，蛋白质溶液在280nm波长处的光吸收值与其浓度成正比，因此可作定量测定。
②280nm和260nm光吸收差法：
若样品中含有嘌呤、嘧啶等核苷酸类吸收紫外光的物质，在用来测定蛋白质浓度时会有较大干扰。
由于核酸在260nm波长处的光吸收比280nm波长处更强，因此可利用280nm和260nm光吸收差来计算蛋白质浓度。
常用经验公式：
蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260（假定1mg/ml蛋白质溶液的A280为0.1）③215nm和225nm光吸收差法：
选取215nm波长可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比可减少非蛋白质成分引起的误差。
常用经验公式：
蛋白质浓度（mg/ml）=0.144（A215-A225） 三．双缩脲法：
强碱条件下，蛋白质与CuSO4形成紫红色络合物，可在540nm比色测定。
其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸组分无关，测定范围1-10mg蛋白质/ml。
四．Lowery法：
是双缩脲法的发展，首先在碱性溶液形成铜与蛋白质的复合物，然后这个复合物以及络氨酸和色氨酸的残基还原磷钼酸-磷乌酸试剂（福林-酚试剂），产生深蓝色，可在750nm波长处测定吸收度，计算蛋白质含量。
五．考马斯亮蓝G-250染色法：
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水键作用结合后，变为蓝色，可在595nm波长处进行比色测定。
六．BCA法：
原理与Lowery法蛋白质定量相似，即在碱性条件
下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+。
BCA与Cu+
结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
21 蛋白质纯度测定的基本原理是什么？
简要叙述各自的原理。
①高速离心沉降法：
纯蛋白在离心场中以单一的沉降速度移动，在离心管中只形成一个界面则表示该蛋白是纯的。
②恒溶度法：
纯蛋白在一定溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量。
如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线将只呈现一个折点，在折点以前，直线的斜率为1，折点之后斜率为0，不纯的蛋白质的溶解曲线往往呈现2个或更多折点。
③N端定量分析法：
通常如果蛋白质分子只由一条肽链组成，理论上只能检测出一种N-末端氨基酸，如蛋白质分子含有多个亚基，则检测的N-末端氨基酸数目与亚基数一致。
④层析法：
层析时出现单一条带，即层析纯。
⑤电泳法：
电泳时出现单一条带，即电泳纯。
出现一个条带说明样品荷质比方面均一，其中在不同PH下电泳均出现单一条带结果更可靠。
常用的由聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳。
⑥免疫化学法：
根据抗原-抗体间反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。
常用的有免疫扩散、免疫电泳法、双向免疫电泳和放射免疫分析等。
⑦电喷雾免疫质谱：
在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂的蒸发，液滴表面积变小，导致分析物以单电荷或多电荷形式进入气相，通过分析谱图，可以分析出蛋白质的纯度情况。
22 常用测定蛋白质分子量的方法有哪些？
简要叙述各自的原理。
一．根据化学组成测定最低分子量：
用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质的最低分子量。
最低分子量只有与其他方法配合才能确定其真实分子量。
二．渗透压法：
在理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数，而与溶质的形状无关。
所以可用渗透压计算蛋白质的分子量。
三．沉降分析法：
蛋白质在溶液中受到强大离心力作用时，如其密度大于溶液密度，就会沉降。
用超速离心机测定蛋白质的分子量有两种方法：
沉降速度法和沉降平衡法。
①沉降速度法：
离心时蛋白质移动，产生界面，界面的移动可用适当的光学系统观察和拍照。
当离心力与溶剂的摩擦阻力平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值，称为沉降系数。
可以通过沉降系数来衡量蛋白质的分子量。
②沉降平衡法：
在离心过程中，外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，二者可达到稳定平衡。
此时可测定离心管中不同区域的蛋白浓度，沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低，但要达到平衡常常需要几天时间。
四．分子排阻层析法：
层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制。
小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外，流经距离短，流出快。
此方法较简单，但与分子形状有关。
测定分子量时，标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。
五．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：
蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大小和形状有关，加入SDS后，将原有电荷掩盖，而且使分子变成棒状，则排除了分子形状和所带净电荷对电泳的影响，用已知分子量的标准蛋白作标准曲线，即可求出未知蛋白的分子量。
六．粘度法：
利用鸟式粘度计增比粘度，外推特性粘度，根据公式计算分子量。
七．质谱法：
能使物质粒子分化成离子并通过适当电场、磁场将它们按空间位置、时间先后轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析，能进行多电荷离子分析，并计算其原子分子量。
23 细胞破碎的方法有哪些？
简要叙述各自的原理。
一．机械破碎法
⑴匀浆法：
通过固体剪切力破环细胞和组织，释放蛋白质和酶（注意维持低温，玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他可预冷）。
可分为杵状玻璃匀浆器法和高速组织匀浆器法。
⑵高压匀浆法：
借助于高压匀化作用的液体剪切作用使细胞破碎。
⑶超声波法：
可能与超强声波作用溶液时气泡产生、长大和破碎的空气现象有关（注意控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平，产生泡沫会导致蛋白质变性）。
缺点：
产生化学自由基团使活性物质变性失活后会产生大量热，易产生泡沫使蛋白质变性，不易处理大量溶液。
⑷研磨法：
借助研磨中磨料和细胞间的剪切及碰撞作用破碎细胞，主要用于细菌、酵母和一些植物细胞，一般不超过15min。
⑸高速珠磨法：
微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间及珠子和细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。
二．非机械法
⑴酶溶法：
用生物酶将胞壁和胞膜消化溶解的方法（注意选择适当的酶）⑵化学渗透法：
将两倍于细胞容积的纯水泵入细胞中，由于渗透作用，外界的水向细胞内渗透，使细胞溶胀，待溶胀到一定程度，细胞破裂，内含物释放。
⑶低渗透裂解法（溶胀）无细胞壁的细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解。
常用于红细胞加入异丙基氟磷酸（DFP）可抑制或减慢自溶作用，加入碘乙酸可抑制有巯基的蛋白质酶。
⑷反复冻融法：
将细胞于－20℃以下冷冻，室温溶解，反复几次，由于胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破坏，仅适用于提取非常稳定的蛋白。
⑸去垢剂法：
去垢剂在低离子强度和适合的PH下与脂蛋白发生作用，结合脂蛋白形成分子团，由于膜结构上的脂蛋白被溶解，细胞产生渗透压，使细胞内蛋白质流出
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