大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析.docx

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大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析

大豆GmeR基因启动子的克隆及序列分析

　　摘要：

ＧｍｅＲ是一种植物酶学抗病基因，编码的蛋白质具有丝氨酸乙醛酸转氨酶（ＳＧＴ）活性，受水杨酸诱导，与大豆霜霉病抗性密切相关。

为了进一步研究ＧｍｅＲ基因的抗病机理，我们利用染色体步移技术克隆得到长为１０36ｂｐ的ＧｍｅＲ基因５′上游片段，序列分析显示此片段含有典型的ＴＡＴＡ－ｂｏｘ、ＣＡＡＴ－ｂｏｘ、Ｇ－ｂｏｘ和ａｓ－１顺式调控元件。

　　关键词：

ＧｍｅＲ基因；启动子克隆；染色体步移技术；ａｓ－１调控元件

　　中图分类号：

文献标识码：

Ａ文章编号：

0439－８114（２０11）02－0407-04

　　ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＧｍｅＲＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍＳｏｙｂｅａｎ

　　（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）

　　ＺＨＡＮＧＹａｎ－ｙａｎ１，２，ＬＩＭｅｉ２，ＤＯＮＧＬｉ－ｑｉａｎｇ１，２，ＳＵＮＷｅｎ－ｌｉ２，ＣＨＥＮＨｏｎｇ－ｍａｎ１，ＬＩＵＹｕ－ｈｕｉ２

　　（１．Ｐｌａｎｔｐａｔｈｏｌｏｇｙｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１，Ｃｈｉｎａ；

　　２．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：

ＧｍｅＲwaｓａｎｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ，theproteincodedhadtheactivityofｓｅｒｉｎｅｇｌｙｏｘｙｌａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＧＴ），ｗｈｉｃｈｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ（ＳＡ）andwascloselyrelatedtosoybeandowneymildewresistance．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＧｍｅＲｇｅｎｅ，ｔｈｅ１０36ｂｐ５′ｕｐｓｔｒｅａｍｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＧｍｅＲｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙｔｈｅgenomeｗａｌｋｉｎｇ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｉｔｃｏｎｔａｉｎｓｃｌａｓｓｉｃａｌＴＡＴＡ－ｂｏｘ，ＣＡＡＴ－ｂｏｘ，Ｇ－ｂｏｘ，ｗｈｉｃｈａｒｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ａｎｄｏｔｈｅｒcis-regulatoryｅｌｅｍｅｎｔｓｓｕｃｈａｓａｓ－１regulatoryｅｌｅｍｅｎｔ．

　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ＧｍｅＲｇｅｎｅ；ｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇ；genｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ；ａｓ－１regulatoryｅｌｅｍｅｎｔ

　　霜霉病是一种由霜霉菌引起的真菌性植物病害。

植株从幼苗到收获各阶段均可发病，且以成株受害较重，主要危害叶片，由基部向上部叶发展。

发病初期在叶面形成浅黄色近圆形至多角形病斑，空气潮湿时叶背产生霜状霉层，有时可蔓延到叶面。

后期病斑枯死连片，呈黄褐色，严重时全部外叶枯黄死亡。

霜霉病在春末夏初或秋季连续阴雨天气最易发生，病害严重时可造成２０％～４０％的产量损失。

该病害在甜瓜、黄瓜、大豆等一些作物中经常发生。

以大豆霜霉病为例，我国大豆的霜霉病发生区主要分布在东北和华北地区，在大豆生育期，气候凉爽的地区发病较重。

病害严重时引起早期落叶、叶片凋枯、种粒霉烂，减产达３０％～５０％。

幼苗、成株叶片、荚及豆粒均可被害，带菌种子长出的幼苗可使整个植株发病。

对于霜霉病等植物病害的防治，最为根本的措施是培育抗病植株。

而与植物抗病性相关的基因则对于抗病植株的培养有着非常重要的作用。

近年来，越来越多的试验表明组成型表达的基因在植物的抗病性方面起着重要的作用。

Ｗａｎｇ等［１］和Ｈａｏ等［２］报道调节碳代谢的腺苷酸激酶（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ）和ＳＮＦ１（Ｓｕｃｒｏｓｅｎｏｎ－ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ－１）与植物的抗病毒相关。

拟南芥中编码甘油激酶的ＮＨＯ１基因是抗寄生植物抵抗Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ菌必需的，而致命的Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ对植物的危害则是通过茉莉酸信号途径抑制ＮＨＯ１基因的表达而起作用［３］。

Ｔａｌｅｒ等［４］从野生型甜瓜中克隆了两种同源性很高的编码丝氨酸乙醛酸转氨酶（Ｓｅｒｇｌｙｏｘｙｌａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＳＧＴ）的基因Ａｔ１和Ａｔ２，氨基酸和核苷酸序列比较表明，Ａｔ１和Ａｔ２不属于任何一类已知的抗性基因。

Ａｔ１和Ａｔ２在转基因甜瓜中的表达明显提高了丝氨酸乙醛酸转氨酶、丙氨酸乙醛酸转氨酶（Ａｌａｇｌｙｏｘｙｌａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＧＴ）和乙醇酸氧化酶（Ｇｌｙｃｏｌａｔｅｏｘｉｄａｓｅ，ＧＯ）等植物光呼吸中的关键酶的活性和霜霉病抗性。

这些酶的抗病机制被认为是一种新的防卫机制――植物酶学抗病性（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＥＲ）。

近年来，人们在大豆的霜霉病酶学抗性方面的研究也取得了一些进展。

崔玉瑰等［５］通过将霜霉病敏感大豆材料黑农１０号与抗性大豆材料绥７６－５１８７和绥７８－５０３５进行遗传比较分析，发现大豆霜霉病抗性是由单基因控制的。

本实验室已从大豆抗霜霉病抗性品种早丰５号克隆一个新的丝氨酸乙醛酸转氨酶基因――ＧｍｅＲ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．ＤＱ１６７２５０），研究证实具有霜霉病抗性。

为了更好的研究丝氨酸乙醛酸转氨酶抗病机理，从大豆抗性品种早丰５号提取总ＤＮＡ，利用Genｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ克隆了ＧｍｅＲ基因的上游序列并对其结构进行了分析，为进一步了解ＧｍｅＲ基因的表达调控机制打下基础。

　　１材料与方法

　　霜霉病抗性品种早丰５号种于中国农业科学院生物技术研究所网室，该种子由国家作物种质中心秋丽娟博士惠赠。

大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α菌株由本实验室保存。

ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ

　　ＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ购于Ｃｌｏｎｔｅｃｈｓ公司，ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ和限制性内切酶均购自于ＴａKａRａ公司。

　　大豆基因组ＤＮＡ的提取方法为：

取２５~１００ｍｇ新鲜大豆叶片，加液氮碾成粉末，转入１．５ｍＬ离心管中。

加４５０μＬ提取缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－Ｃｌ，５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇，５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ值８．０）及１００μＬ１０％ＳＤＳ，剧烈振荡。

６５℃水浴３０ｍｉｎ，加１６０μＬ３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ（ｐＨ值５．２），置冰上２０ｍｉｎ。

１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１５ｍｉｎ，取上清。

加２倍体积的预冷的无水乙醇，颠倒混匀以利于ＤＮＡ析出。

用玻棒挑出丝状ＤＮＡ，置于１．５ｍＬ小离心管中，７０％乙醇漂洗数次后晾干备用。

　　基因组ＤＮＡ步移文库的构建参照ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ中的说明书进行。

基因组ＤＮＡ分别采用ＤｒａⅠ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕⅠ和ＳｔｕⅠ平末端酶消化，酶切产物与接头连接，构建了４个基因组步移文库（ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３和ＤＬ４）。

　　参照我们克隆并已登陆在ＧｅｎＢａｎｋ中的ＧｍｅＲ基因的ｃＤＮＡ序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．ＤＱ１６７２５０）和ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ的要求，设计两个特异引物ＰＧＳＰ１（５′－ＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＴＧ－３′）和ＰＧＳＰ２（５′－ＴＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＴ

　　ＣＡＡＡＣＣＴＣ－３′）。

引物由上海生工生物工程有限责任公司合成。

　　大豆ＧｍｅＲ基因启动子克隆分两轮ＰＣＲ反应。

第一轮ＰＣＲ反应：

在４个０．５ｍＬ的ＥＰ管（Ｃ１～Ｃ４）中分别以构建好的ＤＮＡ文库（ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３和ＤＬ４）为模板，以基因特异引物ＰＧＳＰ１和接头引物（ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ提供）ＡＰ１（５′－ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ－３′）在热循环仪（ＢＩＯ－ＲＡＤ）上进行ＰＣＲ反应。

反应程序为：

９５℃预变性５ｍｉｎ；紧接着７个循环为９４℃２５ｓ，７２℃３ｍｉｎ；然后接着３２个循环，９４℃２５ｓ，６７℃３ｍｉｎ；最后６７℃延伸７ｍｉｎ。

反应完成后，将上述４管ＰＣＲ产物稀释５０倍（Ｄ１～Ｄ４）用作第二轮ＰＣＲ扩增的模板。

第二轮ＰＣＲ反应：

以基因特异引物ＰＧＳＰ２和接头引物ＡＰ２（５′－ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣ

　　ＧＴＧＧＴ－３′）进行ＰＣＲ扩增，反应程序为：

首先９４℃２５ｓ，７２℃３ｍｉｎ扩增５个循环；紧接着９４℃２５ｓ，６７℃３ｍｉｎ扩增２０个循环，最后６７℃延伸７ｍｉｎ。

为了便于结果的分析，我们根据ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＵｎｉｖｅｒｓａｌＫｉｔ中的方法增加了阴性对照和它提供的阳性对照。

所得最终ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，通过胶回收纯化后与ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，筛选重组子酶切鉴定，验证后送中国农业科学院重大工程楼测序部测序。

　　ＧｍｅＲ基因５′上游片段序列调控元件用植物顺式调控元件数据库ＰｌａｎｔＣＡＲＥ和ＰＬＡＣＥ分析。

　　２结果与分析

　　２．１大豆ＧｍｅＲ基因上游ＤＮＡ序列的克隆

　　用４个内切酶（ＤｒａⅠ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕⅠ和ＳｔｕⅠ）对大豆基因组进行消化，酶切产物与接头连接用染色体步移技术，经两轮ＰＣＲ扩增后，从步移文库ＤＬ２中克隆启动子的片段（图１）。

　　２．２序列分析

　　通过测序及序列比较发现该片段与ＧｍｅＲ基因ｃＤＮＡ序列的５′端部分片段重合，是大豆ＧｍｅＲ基因５′上游区域，片段长度为１０36ｂｐ。

　　采用ＰＬＡＣＥ网站（ｈｔｔｐ：

／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／ｓｉｇｎａｌｕｐ．ｈｔｍｌ）和ＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋＰｒｏｍｏｔｅｒＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ软件以及植物顺式调控元件数据库ＰｌａｎｔＣＡＲＥ对克隆的大豆ＧｍｅＲ启动子序列进行了分析。

结果显示，在＋１处Ｃ为可能的转录起始密码子。

预测转录起始位点上游含有３个ＴＡＴＡ－ｂｏｘ

　　（－１７ｂｐ、－4７ｂｐ和－１９６ｂｐ），３个ＣＡＡＴ-ｂｏｘ（－２３ｂｐ、

　　－２27ｂｐ、－３４１ｂｐ）和有３个Ｇ－ｂｏｘ（－１３９ｂｐ、－２１４ｂｐ、－５４７ｂｐ）。

并且克隆的片断内ＡＴ碱基含量较高，占６７．５％。

通过分析发现与生物抗病相关的顺式作用元件为ａｓ－１（激活序列１）顺式调控元件。

该元件位于转录起始位点下游有＋２３６ｂｐ和＋２７3ｂｐ处（图２，方框表示），它们的共有序列为ＴＧＡＣ。

　　３小结与讨论

　　植物启动子是一段能与ＲＮＡ聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的ＤＮＡ序列。

植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子ＡＴＧ（图２，箭头表示）上游。

植物启动子由核心元件和上游元件构成，如ＴＡＴＡ－ｂｏｘ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ－Ｈｏｇｎｅｓｓ框或Ｈｏｇｎｅｓｓ框）和起始因子（Iｎｉｔｉａｔｏｒ）。

从序列分析可以看出，克隆得到的大豆ＧｍｅＲ基因上游片段含有典型的植物启动子核心元件。

　　植物启动子按其转录方式可以分为组成型、组织特异型和诱导型启动子。

当植物受到真菌、细菌、病毒等病原微生物侵染时，植物体内编码相关保护蛋白质的基因被激活，从而消除有害代谢产物对植物自身的伤害，调控这类保护蛋白质的基因表达的启动子为生物胁迫诱导型启动子［６］。

通过前期的研究发现，ＧｍｅＲ基因编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶与植物抗霜霉病有关，ＧｍｅＲ基因的表达受到水杨酸的诱导，对大豆ＧｍｅＲ基因启动子的序列分析发现含有ａｓ－１顺式调控元件，推测其可能是水杨酸应答元件，该启动子为诱导型启动子。

　　水杨酸是一种植物在逆境反应中起关键性作用的激素［７］。

当病原菌侵染植物时，体内的水杨酸含量急剧增加而激活抗性基因的转录和表达抗体，从而形成有效的防御性应答［８］，Ｇａｒｒｅｔóｎ等［９］研究发现水杨酸通过活性氧作用于ａｓ－１顺式调控元件从而诱导抗病性基因的转录和表达。

Ｒｅｄｍａｎ等［１０］研究发现ａｓ－１顺式调控元件还可以被化学逆境激活，如除草剂、农药、杀虫剂等，并且有组织的特异性，尤其是在子叶中高效表达。

研究为进一步了解ＧｍｅＲ基因的表达调控机制和植物抗病机理打下了一定的理论基础。

　　参考文献：

　　［１］ＷＡＮＧＨ，ＨＡＯＬ，ＳＨＵＮＧＣＹ，ｅｔａｌ．ＡｄｅｎｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓＡＬ２ａｎｄＬ２ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００３，１５：

３０２０－３０３２

　　［２］ＨＡＯＬ，ＷＡＮＧＨ，ＳＵＮＴＥＲＧ，ｅｔａｌ．ＧｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓＡＬ２ａｎｄＬ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈａｎｄｉｎａｃｔｉｖａｔｅＳＮＦ１ｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００３，１５：

１０３４－１０４８．

　　［３］ＫＡＮＧＬ，ＬＩＪ，ＺＨＡＯＴ，ＸＩＡＯＦ，ｅｔａｌ．ＩｎｔｅｒｐｌａｙｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｎｏｎｈｏｓｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅＮＨＯ１ｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｌｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，２００３，１００：

３５１９－３５２４．

　　［４］ＴＡＬＥＲＤ，ＧＡＬＰＥＲＩＮＭ，ＢＥＮＪＡＭＩＮＩ，ｅｔａｌ．ＰｌａｎｔｅＲｇｅｎｅｓｔｈａｔｅｎｃｏｄｅｐｈｏｔｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｅｎｚｙｍｅｓｃｏｎｆｅｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００４，１６：

１７２－１８４．

　　［５］崔玉瑰，姜成喜，吕德昌，等．大豆霜霉病（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｍａｎｓｃｈｕｒｉｃａ）抗病性遗传分析［Ｊ］．大豆科学，１９９２，１１：

３１－３５．

　　［６］ＭＯＵＺ，ＦＡＮＷ，ＤＯＮＧＸ．ＩｎｄｕｃｅｒｓｏｆｐｌａｎｔｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｅＮＰＲ１ｆｕｎｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｒｅｄｏｘｃｈａｎｇｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００３，７：

９３５－９４４．

　　［７］ＦＥＹＳＢＪ，ＰＡＲＫＥＲＪＥ．Ｉｎｔｅｒｐｌａｙｏｆｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，２０００，１６：

４４９-４５５．

　　［８］ＢｒｏｄｅｒｓｅｎＰ，ＭａｌｉｎｏｖｓｋｙＦＧ，ＨｅｍａｔｙＫ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄｉｎｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｃｄ１１［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００５，１３８：

１０３７－１０４５．

　　［９］ＧＡＲＲＥＴＯＮＶ，ＣＡＲＰＩＮＥＬＬＩＪ，ＪＯＲＤＡＮＡＸ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｓ－１ｐｒｏｍｏｔｅｒｅｌｅｍｅｎｔｉｓａｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔａｎｄｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄａｃｔｉｖａｔｅｓｉｔｖｉａｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０００，１３０（３）：

１５１６－２６．

　　［１０］ＲＥＤＭＡＮＪ，ＷＨＩＴＣＲＡＦＴＪ，ＪＯＨＮＳＯＮＣ，ｅｔａｌ．Ａｂｉｏｔｉｃａｎｄｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｓｔｉｍｕｌａｔｅａｓ－１ｅｌｅｍｅｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ，２００２，２１：

１８０-１８５．