pH探针 毕业设计.docx

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pH探针毕业设计

天津师范大学

本科毕业论文（设计）

题目:

对羟苯乙酮罗丹明6G荧光探针的合成与性能研究

学院：

化学学院

学生姓名：

XXX

学号：

09507151

专业：

化学生物学

年级：

2009级

完成日期：

2012年4月25日

指导教师：

XXX

对羟苯乙酮罗丹明6G荧光探针的合成与性能研究

摘要:

本文我们合成了一个新型罗丹明6G酰肼希夫碱化合物N-[4-羟基苯乙酰基]-N’-[3’,6’-二甲基-2’,7’-二乙氨基-氧杂蒽-9’-（2’’-苯甲酰）基]肼I，以1HNMR、13CNMR、质谱、红外、紫外光谱、荧光光谱对其进行了结构表征及性能研究。

对探针分子I进行了不同浓度的氢离子识别性能研究，当体系的pH在1.1~12.9范围内，当pH=1.1~4.0时，探针分子对H+有显著响应，紫外吸收光谱、荧光发射光谱发生变化，同时，肉眼可观察到体系由无色到粉色的颜色变化。

并且，该探针分子在四氢呋喃/Tris-HCl4:

6缓冲溶液（pH=7.5）中进行干扰实验表明，I和14种常见金属离子（Mg2+、Mn2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Ba2+、Sb3+、Cr3+、Hg2+、和Ag+）的相互作用几乎无紫外光谱及荧光光谱响应、或者响应很小。

因此I可作为一种灵敏度高、选择性好、并且不受金属离子干扰的pH荧光探针。

关键词：

罗丹明衍生物；荧光探针；pH检测.

SynthesisandPropertiesofTheFluorescentProbefromRhodamine6GandP-Hydroxyacetophenone

Abstract:

Herein,wehavesynthesizedandcharacterizedanewrhodamine6GSchiffbaseI,whichisnamedN-[4-hydroxybenzeneacetyl]-N’-[3’,6’-dimethyl-2’,7’-diethylin-xanthenes-9’-（2’’-benzoyl）]hydrazine.TheadditionofH+（pH<4.0）toIinaTHF/Tris-HCl（pH7.5）buffersolutioncanbringobviousUV-Visabsorptionandfluorescenceemissionaswellasacolorchangefromcolorlesstopink,what’smore,theadditionof14kindsofmetalionsincludingHg2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Sr2+、Cd2+、Ba2+、Pb2+andBi3+causedalmostnofluorescenceandcolorchanges.Thus,Iwasabletoserveasa“naked-eye”probeforpH.

Keywords:

Rhodamine-basedderivative;Fluorescentprobe;pH-detection.

1前言

1.1罗丹明化合物的修饰

1.1.1氧杂蒽环上的修饰

罗丹明类化合物是一种以氧杂蒽环为母体的功能荧光分子，罗丹明的基本骨架主要由带有3,6位氨基取代的氧杂蒽母体（简称顶环）和9位碳原子所连接的苯环（简称底环）两个片段组成[1]。

罗丹明类化合物的分子结构中的蒽环含共轭π键和烷胺基助色基团，通过引入不同的官能团对罗丹明的结构进行修饰，可以设计合成出很多罗丹明类衍生物[2-5]。

按取代基的位置通常可分为对顶环氨基的修饰和对顶环骨架的修饰。

母环上引入不同的取代基，如芳基、卤素、磺酸基等反应性基团，不仅可以影响此类化合物的最大吸收、发射波长，也直接影响它们的应用性能。

Dimitri[6]用芘丁基磺酸盐合成了N上取代的4-（1-芘基）-丁基罗丹明（图1），并研究了芘与罗丹明之间的能量传递过程，此化合物可用于各种细胞器官氧气浓度的测定。

图1罗丹明顶环上氨基的修饰

Haugland[7]通过扩展π共轭体系以增加刚性，设计并合成出新型的强荧光罗丹明染料。

这一系列染料在581～63lnm处有较强吸收，量子产率在0.64～0.89之间，可以广泛用于生物分析领域。

它以4-溴-3-硝基茴香醚及五种不同的芳香硼酸为原料合成，Ar部分可以是苯环、萘、噻吩、苯并噻吩，其合成路线如下所示：

图2罗丹明顶环上骨架的修饰

1.1.2底环的修饰

罗丹明底环的修饰主要改变罗丹明的荧光发射光谱位置、光谱对环境的敏感性及罗丹明的亲水性。

用卤素取代底部苯环骨架后，罗丹明的荧光发射光谱半峰宽减小，颜色加深，而将羧基酯化后，罗丹明的亲酯性得到提高。

当罗丹明衍生物具有较大的憎水基团时，其物理性质将发生较大改变，一些含长链烷基的罗丹明表现出两亲性，能够溶解于众多极性与非极性溶剂。

在水溶液中，由于含有长链憎水基团，极易聚合形成二聚体，而在有机溶剂中则多以单分子形式存在，这些变化使罗丹明衍生物能够更准确地反映溶液环境的变化[8]。

与氧杂蒽母环互相垂直的底环可通过活性基与蛋白质、核酸等生物大分子及组成单体分子中的-NH2,-OH,-SH等形成共价键，使其荧光性质发生改变，得到的标记物具有选择性好和灵敏度高等优点，从而可反映有关大分子结构和功能的信息，为荧光分析奠定了基础[9]。

在底环上引入卤素可使颜色加深，卤素被某些硫醇取代后可以很容易地引入其它活性基团[10]。

1.1.3底环羧基的内酰胺化修饰

罗丹明内酰胺螺环结构具以下特点：

（1）罗丹明的内酰胺螺环是非共轭结构的，因此在长波处无吸收，无颜色，无荧光；

（2）罗丹明内酰胺螺环结构在酸性条件或与被分析物结合后能够诱导内酰胺结构开环，氧杂蒽结构电子重新排布，共轭结构恢复，因此在长波处有吸收，有颜色，强荧光。

基于此结构的优势，罗丹明内酰胺类衍生物作为一类很好的OFF-ON型荧光传感器而引起了广泛的关注[10-14]。

本实验以罗丹明6G作为母体来进行设计，首先使它形成具有酰胺螺环结构的化合物I，当它与被分析物（氢离子）作用时，内酰胺螺环结构被打开，产生共轭结构，信号从无到有，达到对pH的检测，并且不受其他阳离子的干扰[15-16]。

1.2罗丹明螺内酰胺衍生物在检测金属离子方面的应用

近年来,对重金属离子有较高选择性和敏感性的化学传感器[17-20]的设计与合成已引起大家的强烈关注，因为这些金属离子能够对人体健康产生威胁，并且也会破坏环境。

基于罗丹明环内酰胺的化学感测器以其优良的光谱性质，即较大的高的量子发射产率、拉长到可见光区的吸收和发射波长而备受关注。

这些感测器都是非荧光和无色的，但是金属离子可以诱导环内酰胺结构开环，进而产生强的荧光发射并且变色。

受这种机制的启发，一些以罗丹明衍生物作为荧光探针来检测金属离子的优秀检测体系已经建立起来[21]。

1.2.1检测Cu2+

铜是人体必不可少的元素，摄入过量却又可能造成中毒，主要是因为铜离子可以使蛋白质变性。

当水中铜含量大于0.01mg/L时，对水体自净有明显的抑制作用。

铜对水生生物毒性很大，一般认为水体含铜大于0.01mg/L对鱼类是不安全的。

为及时、准确地监测水的质量，确保人们安全饮水，铜离子的检测一直备受关注。

2012年,Tang[22]等以罗丹明B和8-羟基喹啉为原料合成希夫碱化合物1，该化合物是一种良好的Cu2+荧光分子探针，具有选择性好、灵敏度高、水溶性好等优点，有广阔的应用前景（图3）。

图3探针1对铜离子的检测

2013年，Yang[23]等人利用金属离子诱导罗丹明衍生物开环合成如下探针（图4），铜离子的加入会产生显著的颜色与光谱变化，此探针化合物还用于活细胞内的细胞染色。

图4铜离子探针的结构

1.2.2检测Hg2+

在诸多重金属离子中，汞离子被认为是危害最大的金属离子之一。

汞离子及其衍生物的剧烈毒性源于它们对蛋白质和酶中巯基的高亲核性，一旦它与巯基结合，将会导致细胞功能损坏，进而产生一系列健康问题。

汞离子所带来的健康问题已经促使科学家探索更有效的方法来检测生物体内和环境样品中的汞离子。

2006年，Wu[24]等人在罗丹明6G酰肼上连上吡啶醛形成金属离子探针，实现了对Hg2+的选择性检测。

吡啶和腙上的氮，内酰胺上的氧，能与Hg2+配位从而提供一个合适的空腔捕获Hg2+，进而诱导罗丹明内酰胺结构开环（图5）。

图5探针对汞离子的检测

2010年，YunZhao[25]等合成了一种带有8-羟基喹啉基团的罗丹明B衍生物1，1能在较宽的pH范围内可逆地与Hg2+结合，并且选择性高、荧光和颜色反应灵敏（图6）。

这种“打开-关闭”型的荧光感测器还可用于活细胞内Hg2+的检测。

图6探针1对汞离子的检测

1.2.3检测Fe3+

铁离子在细胞新陈代谢和酶催化方面扮演着重要的角色，人体内铁含量过低会造成缺铁性贫血，糖尿病和心脏疾病，并且会对肝脏和肾脏造成损伤。

因此，灵敏地检测铁离子并且不受其他金属离子干扰的荧光感测器一直是科研人员的焦点。

2010年，Tang[26]等人合成如下化合物1（图7），它能够选择性地监测水溶液中的Fe3+，具有灵敏度高、选择性好并且不受其他金属离子干扰的特点。

图7探针1的合成

2012年，KoorathotaSuman[27]等人合成荧光探针5，当向5的pH=7.4的溶液中加入Fe3+时，会产生明显的颜色变化（由无色到粉色）并且伴有很强的荧光发射，还不受其他金属离子如Mn2+、Hg2+等离子的干扰，更重要的是与Fe3+的配位是可逆的。

1.3选题依据

荧光分子探针[28-29]是一种以光谱化学和光学波导与测量技术为基础、能选择性地将分析对象的化学信息转变为分析仪器易测量的荧光信号类探针。

随着现代分析检测技术的发展，荧光分子探针在分子细胞生物学、微生物学、生物化学、分析化学、化工和医药化学等领域都有了更为广泛的应用，从而极大地促进了荧光探针的发展，并且已经使它的合成与应用研究发展成为生命科学和化学两大学科的交叉性前沿研究领域。

理想的荧光探针应具备如下几个特点：

（1）选择性好，即探针对某一种离子有选择性响应；

（2）检测限低，灵敏度高，这样才有更大的实际应用意义；（3）水溶性好，实际应用中，尤其在生物样品中，水溶液都是优先考虑的作用介质，因此，探针分子必须具有一定的水溶性。

罗丹明类化合物是一种以氧杂蒽环为母体的小分子荧光染料。

罗丹明衍生物的荧光发射波长一般较长，这使其荧光成像图能避免生物体自身具有的短波长荧光的干扰，从而提高探针的灵敏度和分析的准确性，在生物医药领域被广泛用作荧光示踪剂和荧光传感器[30-32]。

罗丹明类荧光探针由于光谱性能优越、易于修饰、结构简单、灵敏度高，尤其是在共存离子存在下对特定离子的特异性响应而备受关注。

罗丹明pH荧光分子探针是一类用来识别氢离子、测定体系pH值的荧光探针。

近年来，人们设计合成出了各种pH荧光分子探针，这些探针既可以利用荧光技术随时监测溶液的pH值，又可以通过溶液的颜色变化定性判断环境的pH值。

虽然已有文献报道了一些pH荧光分子探针，但在已报道的探针中，可用于强酸性溶液中氢离子检测的探针并不多见。

事实上，在自然界中，很多介质和环境如人体的胃液、工厂排放的污水等都是强酸性的，因此，设计合成能应用于强酸性环境的pH荧光分子探针极为重要。

本论文以罗丹明6G为母体，设计、合成、表征了利用罗丹明螺环结构的“开-关”过程识别氢离子的pH荧光分子探针I，并对其识别性能进行了探讨。

2化合物的合成及表征

2.1实验部分

2.1.1主要仪器与试剂

BIO-RADFTS3000红外光谱仪；UV-2550紫外光谱仪；VarianCaryEclipse荧光分光光度计;VarianUnity-plus400MHz核磁共振仪；X-4型数字显示显微熔点测定仪（未校正）；FA型电子分析天平（未校正）；SHZ-D（III）型循环水式真空泵；85-1A磁力搅拌器。

罗丹明6G、对羟基苯乙酮、水合肼、无水乙醇、二氯甲烷、甲醇、三乙胺、冰醋酸、石油醚、乙酸乙酯等均为购自试剂公司的分析纯试剂。

除特别说明外，试剂未经过特殊处理。

2.1.2化合物的合成

2.1.2.1原料的合成

a罗丹明6G酰肼的合成

1.反应原理：

2.实验步骤：

在250mL的圆底烧瓶中加入5g（10.4mmol）罗丹明6G和100mL无水乙醇，然后将7mL80%（144mmol）的水合肼在室温条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合液加热搅拌回流3小时。

当溶液由橙色变为澄清的粉色时反应完毕，冷却至室温，减压抽滤，用15mL蒸馏水洗涤产物3次。

得产物3.89g，产率：

87%,（理论4.467g）。

2.1.2.2目标产物的合成

bN-[4-羟基苯乙酰基]-N’-[3’,6’-二甲基-2’,7’-二乙氨基-氧杂蒽-9’-（2’’-苯甲酰）基]肼的合成

1.反应原理

2.反应步骤

取上面所得罗丹明6G酰肼0.9g（2.1mmol）与0.19g（1.4mmol）对羟基苯乙酮置于100mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇和3滴冰醋酸，加热搅拌回流4小时。

用薄层色谱（TLC）测定反应进行的程度，反应完成后停止回流。

待烧瓶内溶液冷却至室温后，慢慢将反应液倒入50g冰水中，用三乙胺调至pH约为9。

抽滤，所得固体用20mL蒸馏水洗涤3次，然后置于真空下干燥。

所得粗产物用硅胶色谱柱（溶剂极性为石油醚:

乙酸乙酯=5:

3）提纯，得白色固体产物0.87g,产率76%,熔点234ºC。

1HNMR:

δ（CDCl3,400MHz）1.192（6H,t,NHCH2CH3）,1.866（6H,s,Xanthene-CH3）,2.058（3H,s,CNCH3）,3.101（4H,q,NHCH2CH3）,3.472（1H,s,OH）,5.018（2H,s,NH）,6.223（4H,s,Xanthene-H）,6.708（2H,d,J=8.4Hz,Ar-H）,7.043（1H,d,J=3.6Hz,Ar-H）,7.413（2H,d,J=8.4Hz,Ar-H）,7.542（2H,s,Ar-H）,7.823（1H,s,Ar-H）.13CNMR（CDCl3,101MHz）:

14.654,17.521,18.027,37.956,40.019,55.389,62.028,66.622,96.112,106.097,115.527,118.200,123.002,124.145,127.993,128.989,130.822,132.986,147.870,151.782,160.077,160.414,168.592.

2.2表征与分析

2.2.1核磁分析

图8化合物I的氢谱图

I

δ值/ppm：

7.823（s,1H,位置22处的质子共振吸收峰）

7.542（s,2H,位置20,21处的质子共振吸收峰）

7.413（d,2H,J=8.4Hz,位置36,38处的质子共振吸收峰）

7.043（d,1H,J=3.6Hz,位置19处的质子共振吸收峰）

6.708（d,2H,J=8.4Hz,位置35,39处的质子共振吸收峰）

6.223（s,4H,位置3,6,11,14处的质子共振吸收峰）

5.018（s,2H,位置26,23处的质子共振吸收峰）

3.472（s,1H,位置41处的质子共振吸收峰）

3.101（q,4H,位置27,29处的质子共振吸收峰）

2.058（s,3H,位置40处的质子共振吸收峰）

1.866（s,6H,位置24,25处的质子共振吸收峰）

1.192（t,6H,位置28,30处的质子共振吸收峰）

表1化合物I的氢谱分析

2.2.2红外谱图分析

化合物I的红外谱图见附图3。

I

振动频率（cm-1）：

3397cm-1处的宽峰说明酚羟基的存在

3130cm-1处的吸收说明仲胺和酰胺的存在

2966cm-1（C-H伸缩）、1609cm-1、1517cm-1（C=C骨架振动）的吸收说明芳环的存在

1657cm-1处有较强吸收说明了羰基的存在

1270cm-1、1206cm-1处的较强吸收是由C-N、C-O伸缩振动产生

表2化合物I的红外谱图分析

3荧光探针对H+的检测

3.1荧光与紫外光谱

用移液枪量取0.1mL化合物I的1.0×10-3M的储备液,转入10mL棕色容量瓶中，分别用上述配制的13种不同pH值的溶液定容,测得其紫外吸收及荧光发射光谱如下：

Fig.3-1UV-VisabsorptionspectraofI（10μM）uponadditionofdifferentpH（1.1-12.9）aqueoussolutions.

图3-1化合物I的紫外吸收光谱

Fig.3-2Fluorescencespectra（λex=510nm）ofI（10μM）uponadditionofdifferentconcentrationofH+inaqueoussolutions（pHfrom1.1to12.9）.Thesplitswere3nm.

图3-2化合物I的荧光发射光谱

3.3金属离子干扰谱图

Fig.3-3UV-visspectrumofI（10μM）withthepresenceofH+（pH=1.1）and5equivalentsofvariousmetalions（50μM）.inTHF/Tris-HCl（4:

6,v:

v）.InsertshowsthephotoofsensorIwithdifferentions.

图3-3金属离子不产生干扰紫外谱图

从以上图谱我们可以看出，向不同pH溶液中加入适量化合物I（10μM）时会产生相应的紫外吸收与荧光发射，这些吸收与发射主要发生在pH<4.0，这些变化是由氢离子诱导化合物I开环形成共轭结构引起的。

氢离子的加入引起的最大紫外吸收在537nm，最大荧光发射在559nm，并且金属离子的加入不会对氢离子的选择性响应产生影响。

4研究结论

（1）由于罗丹明螺环化合物对于离子检验的特殊用途，我们设计并合成了一个罗丹明6G酰肼希夫碱类化合物N-[4-羟基苯乙酰基]-N’-[3’,6’-二甲基-2’,7’-二乙氨基-氧杂蒽-9’-（2’’-苯甲酰）基]肼并对其进行了结构表征。

结构式如下：

（2）我们对所合成的化合物的性质进行了初步研究。

结果显示探针I可以选择性地检测氢离子（pH<5.1）并且不受诸多金属离子的干扰。

当向pH=1.1的溶液中加入一定量的I（10um）时，溶液颜色立即变粉色并伴有很强的荧光发射，向此溶液中加入氢氧化钠溶液时颜色又由粉色变无色，I与氢离子的相互作用见图4-1。

我们期待I可用于草酸的检测，如图4-2所示，当探针I与草酸作用时会产生无色到粉色的颜色变化。

图4-1探针I对氢离子的识别

图4-2探针I在草酸中发生的颜色变化。

左图为自然光下，右图为紫外灯下。

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