DNA分子标记技术基因克隆技术.docx

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DNA分子标记技术基因克隆技术

DNA分子标记技术基因克隆技术

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2007-10-24　本站论坛

一、遗传标记分为几类？

简述各类标记的特点。

遗传标记（GeneticMarkers）是基因型特殊的易于识别的表现形式。

它一般具有较强的多态性、表现的共显性、不影响重要的农艺性状和经济方便、易于观察记载等优点。

它在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。

随着遗传学的发展，遗传标记也在不断的发展。

从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型。

1形态标记（MorphologicalMarkers）

形态标记是指生物的外部特征特性。

包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记，例如人的肤色、作物的株高、种子的粒形和动物的体重等。

它是最早被使用和研究的一类遗传标记。

在遗传的分离规律、自由组合定律和连锁交换定律以及群体遗传学和数量遗传学的研究和应用等方面发挥着重要作用。

它具有易于识别和掌握、简单直观等优点，但也具有标记数量少、多态性差和易受环境因素影响等不足。

2  细胞标记（CytologicalMarkers）

细胞标记主要指染色体组型和带型。

染色体组型是指生物体细胞所有可测定的染色体特征总称。

包括染色体总数、染色体组数、每条染色体大小和形态、着丝点的位置等。

它是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。

对鉴别真假杂种、对研究染色体结构和数目的变异、物种起源和生物的遗传进化等具有重要价值。

带型是用染色体分带技术体所产生的明显的染色带（暗带）和未染色的明带相间的带纹，使染色体呈现鲜明的个体性。

因此，可以把染色体带型作为一种遗传标记，有效地识别不同物种之间、同一物种不同染色体之间的差异。

带型有Q带、G带、R带、T带等类型，但是该遗传标记也有其标记数目有限的弱点。

3  生化标记（BiochemicalMarkers）

生化标记是指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记。

同工酶是生物体代谢的调节者，与特殊的生理功能和细胞分化相联系，也与基因进化和物种的演变有关，因此，同工酶既可作为生理指标又可作为遗传标记在生物群体的遗传进化和分类研究中广为应用。

另外，同工酶研究也有助于探讨生物个体发育过程中基因表达与调控。

生化标记具有简便、经济、快速和准确等优点，但是同样具有标记数目有限的缺点。

贮藏蛋白与种子的萌发等发育过程有关，也具有生物种属的特异性，可以作为遗传标记。

例如，马铃薯蛋白是马铃薯块茎中的主要蛋白（贮藏蛋白），玉米醇溶蛋白是玉米种子内的贮藏蛋白，按其结构和溶解度分为α、β、γ和δ四大类等。

4  DNA分子标记（MolecularMarkers）

DNA分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。

此DNA片段是将基因组DNA经过限制性内切酶切割和分子杂交或PCR扩增后在电泳凝胶上（或杂交膜上）检测到的。

它广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学和法学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。

总之，遗传标记的发展随遗传学和科技的发展而发展，总的发展趋势为由低级到高级、由间接到直接、由粗略到精确。

上述前3种遗传标记均为以基因表达结果为基础，是对基因的间接反映，第4种标记是DNA水平遗传变异的反映，是对基因的直接反应。

4种遗传标记各有其特点，所以在遗传学研究与应用中要注意使其既发挥各自独特作用又使其互相配合发挥更大的协同作用。

二、DNA分子标记的优点有哪些？

与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点：

1）能对生物各发育时期的个体、各组织、器官和细胞进行检测，直接以DNA的形式表现，不受环境影响，不存在基因表达与否的问题；2）数量丰富，遍及整个基因组；3）遗传稳定，多态性高；4）对生物体的影响表现为“中性”，不影响目标性状的表现，和不良性状无必然连锁；5）多为共显性，能为鉴别纯合基因型和杂合基因型提供完整的遗传信息；6）操作简便等等。

这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学和法学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一，并且对社会产生巨大冲击。

目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSRorSSLP（简单重复序列）和DNA指纹技术等。

三、试述RFLP分析技术的步骤及优缺点。

RFLP标记限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLPs）指用某种限制性内切酶切割基因组DNA时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序列的酶切片段长度差异。

差异的产生主要分两类：

一是碱基突变异致的酶切位点改变（称点多态性，pointpolymorphism）；另一类是DNA内部序列重排，包括大的DNA片段的缺失、交换、重组和插入等，或DNA内部“高变区”（highlyvariableregion）串联重复序列的拷贝数不同而引起的。

差异的显示和检测，是通过DNA凝胶电泳和用克隆的DNA片段作为探针进行分子杂交，再通过放射自显影（或非同位素技术）实现的。

RFLP主要步骤包括限制性内切酶切割、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移和杂交、放射自显影。

首先，用限制性内切酶切割改变的DNA则产生长短、种类、数目不同的限制性片段。

这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，在凝胶上呈现不同的带状分布，具有差异性的DNA片段可通过Southern杂交检测出来。

电泳所得到DNA片段，对于分子量较小的可以经EB染色后直接在紫外灯光下观察，若选择靶DNA，则将在凝胶上呈带状分布的DNA通过Southern转移到NC膜或尼龙膜上，再利用探针进行Southern杂交后，洗去多余探针，经放射自显影即可得到靶DNA。

利用RFLP进行多态性分析具有众多优点，主要表现在：

第一，较高可靠性，这是由限制性内切酶识别序列的专一性决定；第二，来源于自然变异，依据DNA上丰富的碱基变异不需任何诱变剂处理；第三，多样性，通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异，因而在数量上无任何限制；第四，共显性，指RFLP能够区别杂合体与纯合体；第五，数量性，具有数量化。

但也存在不足，如具有种属特异性，在实际应用中受到限制；要制备放射性探针和进行Southern转移及杂交、放射自显影，因而费时、繁琐、污染大，对环境和人体造成不良影响；此外，对DNA含量与纯度要求高，多态性水平低，技术难度高，只适应单/低拷贝。

四、RAPD与RFLP的区别，RAPD与RFLP相比有何优缺点？

RAPD标记随机引物扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）是在PCR技术的基础上，以一系列不同随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，结合到加热变性后的模板链上使之退火，在DNA聚合酶的作用下，合成一段新的互补DNA链。

RAPD要求的引物可随机合成，但必须满足两个条件：

G+C的含量不低于40%，一般为50%～70%；5′与3′端的碱基顺序非反方向对称，否则无法合成专一性的少数几条DNA片段。

其长度以10个碱基为宜，太短（少于9个核苷酸长度）则难以结合到模板DNA分子上，太长则成本提高，且合成多态性DNA片段的可能性降低。

RFLP主要建立在酶切片段的分子杂交基础之上，DNA总量没有变化；而RAPD基于PCR技术通过放大作用，DNA总量增加。

但是他们之间有许多相同之处，如：

需电泳分析，遵守孟德尔定律，对DNA进行多态性分析等。

与RFLP相比，RAPD的优点有:

（1）引物设计是随机的，故可在对各种生物没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行DNA多态性分析。

（2）所需模板DNA的量极少，只要有特定的DNA片段，就可将该DNA片段扩增。

（3）引物为人工合成，通常一套引物可用于多物种的基因组DNA多态性分析。

（4）每个RAPD标记就相当于一个靶序列位点（SequenceTaggedSites），可定向增加RFLP某一区域的DNA标记数，更有效地进行遗传图谱的构建。

RAPD在实际应用中也表现出不足：

（1）RAPD是显——隐性位点，故无法在F2代中知道其基因型（纯合体或杂合体），仍需进行F3代及以后世代的样品分析。

（2）稳定性差，重复率低。

（3）对模板DNA的纯度要求高。

RAPD技术主要用于动物基因图谱的绘制。

建立一个用于标记、定位和选择生产性状基因组的基因图谱，至少需要100～150个在染色体上均匀分布的RFLP位点，但由于RFLP主要分布于染色体端部，而RAPD分布较均匀，故运用RAPD标记对建立标记位点连锁图十分有用。

此外，Ｔｍ低的随机引物，易受外界条件影响，如反应体系Ｍｇ2+浓度；使用不同引物导致产物信号差异太大，无法进行分析。

五、何为基因文库?

简述构建基因文库的过程。

基因文库：

应用DNA重组技术，可以很容易的将各种生物体从比较简单的生物，如病毒、细菌到十分复杂的真核生物的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时应用。

这好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称为基因文库（genomiclibrary）。

基因文库的构建步骤：

1）DNA片段的制备。

从生物组织中分离并纯化基因组DNA后，将DNA用限制酶进行部分或完全降解，将降解物（DNA片段）进行分级分离，除去太大及太小的片段，收集大小合适的片段并与载体连接。

2）DNA片段与载体连接。

常用λ噬菌体DNA作为建立基因文库的载体，因为它既在较高的克隆效率，又可以容纳较大的外源DNA片段。

装备型载体（cosmid）也是常用的载体。

DNA片段与载体用T4DNA连接酶连接。

3）将重组体引入细菌细胞。

体外包装λ噬菌体后，进行感染。

或用转化使质粒DNA进入细胞。

4）筛选鉴定基因组。

用分子杂交，凝胶电泳，DNA序列测定等方法加以筛选及鉴定。

六、作为载体的DNA分子应具备哪些条件？

外源DNA片段要进入细胞，并在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内并载着外源DNA一起进行复制与表达。

这种运载工具称为载体（vector）。

载体必须具备下列条件：

1在受体细胞中，载体可以独立地进行复制。

所以，载体本身必须是一个复制单位，称复制子，具有复制起点。

而且插入外源DNA后不会影响载体本身复制的能力。

2易于鉴定、筛选。

3载体DNA的分子应该较小，易进入受体细胞，可以在受体细胞扩增较多的拷贝，便于结合更大的目的DNA。

在实验操作中不易被机械损伤。

4在载体上应该具有两个以上的易检测的遗传标记。

5载体应该具有多个RE的单一切点。

七、简述外源DNA表达的检测方法。

受体细胞经转化或转导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。

为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，已建立了一系列的筛选和鉴定的方法，主要有以下几种。

1利用克隆载体携带的选择标记基因筛选

目前常用的选择标记基因有抗菌素抗性基因和lacZ＇基因。

1.1利用抗菌素抗性基因进行筛选

不同克隆载体通常分别携带Ampr（抗氨苄青霉素）、Cmpr（抗氯霉素）、kanr（抗卞那霉素）、Tetr（抗四环素）和Strr（抗链霉素）等抗性基因。

当含任何一种抗菌素抗性基因的载体处理不具这种抗性基因的受体细胞，并在含有相应抗菌素的培养基上培养时，只有获得载体的受体细胞才能继续生长，这样便可筛选出含克隆载体的克隆子。

1.2利用乳糖操纵子lacZ＇基因筛选克隆子

具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-葡萄糖苷酸酶（Z）、透性酶（Y）和乙酰基转移酶（A），当培养基中含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代-β-D-乳糖苷）时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。

如含乳糖操纵子缺陷型（lacZ＇）的载体转化互补型菌株，在含有X-gal和IPTG的培养基中培养时，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。

当含有目的基因的DNA片段插入（lacZ＇）基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含有X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。

由此可以根据菌落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。

为区分含目的基因的克隆子与未被转化的受体菌（白色菌落），可在选择培养基中添加克隆载体其他选择标记药物。

2利用双酶切片段重组法初筛克隆子

在无法利用克隆载体选择标记的情况下，可以考虑采用双酶切片段重组法。

根据实验设计，选用两种限制性内切酶切割载体DNA分子，用凝胶电泳回收两端具不同粘性末端的线形载体DNA，并经碱性磷酸酶处理后，与同样用那两种限制性内切酶切割获得的含目的基因的DNA片段连接，转化受体细胞，在含克隆载体选择标记药物的培养基上培养，长出的菌落绝大部分是含目的基因的克隆子。

3利用报告基因筛选克隆子

对于那些不宜用克隆载体选择标记筛选的克隆子的受体细胞，往往在含有目的基因的DNA片段与克隆载体连接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。

这样的重组DNA导入受体细胞后，可根据报告基因的表达产物筛选克隆子。

常用的报告基因有：

1）GUS（葡萄糖苷酸酶）基因；2）LUC（荧光素酶）基因；3）CAT（氯霉素乙酰基转移酶）基因；4）冠瘿碱合成酶基因；5）NPT—Ⅱ（新霉素磷酸转移酶Ⅱ）基因；6）PPT乙酰转移酶基因（PAT基因）。

4克隆子的进一步鉴定

用上述方法筛选的克隆子，难免得到一些假的克隆子。

为进一步鉴定克隆子的真假，可采用限制性内切酶分析、分子杂交、PCR扩增和DNA测序等方法。

4.1限制性内切酶分析法

这是一种最简单也是最常用的方法，从克隆子提取DNA，经凝胶电泳检测，若出现外源DNA带，可初步认定是克隆子；在此基础上，回收外源DNA，根据实验设计选用一些限制性内切酶切割，进一步用凝胶电泳检测，如果检测结果同原来用于转化的外源DNA被这些酶切割的结果一致，则可以认为是真的克隆子。

4.2分子杂交法

根据实验设计，先制备含目的基因的DNA片段的探针，随后采用斑点杂交或DNA印迹（southernblotting）等方法进行鉴定。

4.3PCR法

根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子。

4.4DNA测序法

可以帮助了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作过程中是否发生了变化。

4.5目的基因转录产物检测

可以检测目的基因能否在受体细胞内进行有效的转录。

常用RNA印迹（northernblotting）法检测。

4.6目的基因翻译产物的检测

基因最终表达产物是蛋白质（酶），因此检测蛋白质的一些方法可用于检测目的基因的表达产物。

最常用的是蛋白质印迹（westernblotting）法。

实验一质粒的制备

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    质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。

质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

   质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：

细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。

本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

实验目的：

掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

实验材料：

含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。

实验原理：

在pH12.0～12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。

将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。

通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

实验步骤：

1．取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；

2．用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床，250r/min过夜培养；

3．吸取1.5ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4．加入300μl溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：

应彻底打匀沉淀或碎块）；

5．加入300μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6．加入300μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；

7．12000g离心10分钟；

8．吸取800μl上清液（注意：

不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9．12000g常温离心15分钟；

10．倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11．室温放置或超净台上风干DNA；

12．加40μl灭菌超纯水或TE溶解；

13．质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。

附注：

质粒检测

      电泳检测：

质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

       吸光值检测：

采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。

实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳

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    带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。

电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。

琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

实验目的：

掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

实验材料：

质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。

实验原理：

在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。

采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。

核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

实验步骤：

1．用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

2．调整好梳子的高度；

3．称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50℃时倒入制胶板中；

4．凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；

5．将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；

  pUC185μl+ddH2O3μl+溴酚蓝2μl共10μl于0.5mltube中混合后点样；

6．将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

7．电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

附注：

1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

  ①DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。

分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。

分子越大，迁移越慢。

等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）

   ②琼脂糖浓度：

logU=logU0Krt胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。

不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA

    Agarose：

0.5%：

1-30kb；0.7%：

0.8-12kb

    1.2%：

0.4-7kb；1.5%：

0.2-3kb.

   ③DNA构象：

一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。

当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

   ④所加电压：

低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm

   ⑤碱基组成与温度：

一般影响不大4-30℃

   ⑥嵌入染料的存在：

降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中）

  ⑦电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3．电泳指示剂：

核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。

实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆

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    DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。

DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。

实验目的：

学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。

实验材料：

外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段，克隆载体为PUC18。

实验原理：

限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

实验步骤：

1．载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：

  （50μl反应体系，用1.5mltube，冰上操作）

   DNA            30μl

   R.E            1μl

   10×buffer   5μl

   ddH2O          14μl

   37℃反应1hr，分别取8μl外源片段酶切产物和5μlPUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA

2．加入ddH2O150μl（扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:

1），颠倒混匀，12000g离心10min；

3．吸取上清，加1/10体积3MNaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15