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腺相关病毒知识

第一节AAV病毒的生活周期

腺病毒伴随病毒（adeno-associatedvirus,AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。

这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。

病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.7~6kb之间的线状单链DNA基因组。

从昆虫到人类都已分离到微小病毒。

AAV病毒属于依赖性病毒类（Dependovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinsonetal.1965）,顾而得名。

从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。

大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。

在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hogganetal.1966;Bulleretal.1981）。

因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。

进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。

AAV的生活周期有两种不同的胞内期。

在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。

这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。

AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotinetal.1990,1991,1992;Samulskietal.1993）。

研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinogluetal.1988;Yakobsonetal.1987,1989;Bantel-Schaaletal.1992,1991）。

AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）感染时发生。

辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。

腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV）中与辅助功能有关的基因都已确定。

腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a,E1b,E2a,E4和VARNA（Muzyczka1992），但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物（DNA聚合酶和末端酶）。

1型单纯疱疹病毒（HSV-1）提供辅助功能的情形则有些不同,不仅涉及与HSV病毒基因调节有关的基因包括ICP0和ICP4，还需要HSV病毒DNA复制的所必需的基因产物包括HSV螺旋酶－引物酶复合物（UL5，UL8，UL52）和主要DNA结合蛋白UL29的参与（WeindlerFetal.1991）。

这种在辅助功能方面的不同可能反映了腺病毒感染和疱疹病毒感染期间对宿主DNA合成机制的不同影响。

目前的关于AAV工作模式有以下要点：

（1）AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒；

（2）通过潜伏感染,病毒基因组得以同细胞共存；（3）只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；（4）如果细胞受到刺激，细胞内环境发生改变而表达应激基因；（5）导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达，从而使AAV病毒复制；（6）产生子代病毒并释放，又感染新的正常宿主细胞，建立新的潜伏状态。

用某些可损伤基因的因素如紫外线照射、γ射线照射、各种化学致癌剂或某些代谢抑制剂处理某种类型的哺乳动物细胞，可使之在无辅助病毒存在的情况下能够发生AAV产毒性感染。

虽然这种情形比有辅助病毒存在时每个细胞产生AAV病毒的量要低几个数量级，但上述实验提示AAV病毒并不是一种缺陷性病毒，而是一种强烈偏向于潜伏的病毒。

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第二节AAV病毒的基因组结构和功能

人2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）的基因组为4681个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。

正链和负链DNA均可被包装到AAV病毒颗粒中。

AAV-2基因组的结构如图3-1所示。

基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列（invertedterminalrepeat,ITR）。

ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Rep蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。

一．ITR的结构和功能

AAV病毒ITR的序列和结构见图3-2。

每个ITR长145bp。

其中前125bp可形成一个T形的发夹结构，由两个小回纹结构（palindrome）（图2B和C）组成，旁边为一个较大的回纹结构（A）。

ITR的序列可有两种构型：

flip（B回纹接近3’端）或flop（C回纹接近3’端）。

一个特定分子AAV的两个末端形成flip或flop的机率都相等。

单链形式的AAVITR容易形成如图2所示的T型发夹结构，还可能形成另外的构型。

ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件。

二．Rep基因的结构和功能

Rep基因编码至少4种非结构蛋白：

Rep78,Rep68,Rep52,Rep40。

由p5启动子起始的2种mRNA翻译成Rep78和Rep68；p19启动子起始的2种mRNA翻译成Rep52和Rep40（图3.1）。

Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分别与Rep78和Rep68相同。

Rep78和Rep68蛋白与AAV基因表达的正负调控有关。

这两种蛋白都可以和ITR中的特定序列（5’-GCTCGCTCGCTC-3’）结合。

类似的序列在AAV的3个启动子上游均可找到。

当ITR自我折叠时可加强这种结合作用。

Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。

当其与ITR结合时便成为在124位点核苷酸处特异切割的缺口酶,识别的位点是5’-T/TGG。

这两种蛋白对于AAV生活周期的每一时期都是必需的。

在非允许条件下（没有辅助病毒和刺激因素），Rep蛋白只有微量表达，这种表达又能抑制其进一步的表达。

另外，在非允许条件下Rep的表达似乎可抑制AAV基因组以直接方式复制。

近来的研究证明Rep蛋白的表达对位点特异性整合是必需的。

相反，在允许条件下，Rep蛋白的表达对AAV病毒从整合状态的拯救、各种AAV基因的表达和AAVDNA的复制都是必需的。

Rep52和Rep40参与了病毒的装配，它们在病毒双链DNA合成中是不需要的，但在单链DNA和病毒颗粒的累积中则是必需的。

三．Cap基因的结构和功能

Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kbmRNA,拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3（图2），分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:

1:

10。

没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。

但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。

VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。

VP3似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。

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第三节重组AAV的产生原理及常规制备、检测方法

在基因治疗研究中，重组逆转录病毒和重组腺病毒在基因转移载体中一直占主导地位。

但近年来这一情况有所改变，用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。

这是由于AAV具有以下特点：

（1）安全性好。

迄今从未发现野生型AAV对人体致病;重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；

（2）宿主范围广。

不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；

（3）野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置,利用这一特点,有可能研制出具有特异性整合功能的AAV载体;

（4）AAV-2的基因组仅4681个核苷酸,便于用常规的重组DNA技术进行操作；

（5）物理性质稳定。

在60°C不能被灭活,能抗氯仿;

（6）重组AAV（rAAV）可长期稳定地表达外源基因。

一．重组AAV的产生原理

目前在基因治疗研究中所用的AAV载体均由2型AAV改造而来。

AAV-2的ITR中包含了复制、包装、拯救及整合的信号，这使rAAV的产生成为可能：

外源基因表达盒可完全取代AAV的编码序列，rep和cap基因产物则可由另一个质粒反式提供。

参照野生型AAV的生活周期，表达外源基因的rAAV的产生需要4种成分参与：

1.载体DNA。

载体DNA质粒包括了145bp的AAVITR序列，外源基因的表达单位（通常由转录启动子、目的基因和多聚腺苷酸序列组成）位于两个ITR之间。

2.AAV的复制蛋白（Rep）和外壳蛋白（Cap）。

通常由携带它们相应基因的质粒（称为包装质粒）反式提供。

3.宿主细胞。

多种细胞可用作产生重组AAV的宿主细胞，包括293细胞、HeLa细胞和KB细胞等，其中293细胞用磷酸钙转染的效率最高，因此最常用。

4.辅助病毒。

常用的辅助病毒为腺病毒，疱疹病毒则较少用到。

腺病毒的辅助功能由E1a、E1b、E2a、E4orf6和VARNA基因提供；HSV-1的辅助功能由UL5、UL8、UL52和UL29等基因提供。

在辅助病毒存在的条件下，Rep蛋白可以将含有外源基因表达单位的rAAV基因组从载体质粒上拯救出来，并加以复制，得到大量复制形式的rAAVDNA。

随后，Cap蛋白可将单链的rAAV基因组包装成感染性的病毒颗粒。

二．重组AAV的常规制备及纯化方法

rAAV载体的常规制备过程见图3.3。

通常采用磷酸钙共转染的方法，将载体质粒和包装质粒共转染经腺病毒感染的HeLa或293细胞（HermonatandMuzyczka,1984;Samulskietal.,1987,1989）。

当细胞在腺病毒感染下完全病变后（通常为感染后48-72h），收集细胞，低速离心、去上清。

此时绝大部分rAAV存在于细胞内，去掉上清没有明显损失。

将细胞团块冻融3~4次，裂解液在55~60°C加热30~60min以灭活腺病毒。

低速离心去除细胞碎片后，将rAAV的粗提物用若干次氯化铯平衡梯度离心进行纯化。

如果rAAV基因组与野生型AAV基因组的大小一致，则密度为1.41g/cm3,可以与密度为1.35g/cm3的腺病毒明显分离。

对于转导培养的细胞，用rAAV的粗提物即可；但如果用于动物实验，则需进行若干次氯化铯平衡梯度离心进行纯化，因为即使污染了很少量的腺病毒（无论灭活与否）都能造成病毒接种部位的局部炎症反应。

在rAAV制备过程中，需注意以下问题：

1．rAAV的基因组长度（包括两个ITR在内）应接近野生型AAV基因组4681bp的长度，即外源基因表达盒（包括启动子、目的基因及多聚腺苷酸序列）不超过4.3kb。

2．AAV的ITR在大肠杆菌中不稳定，在大量制备rAAV载体质粒后，检测ITR的完整性是很重要的。

由于在ITR内部含有SmaI的酶切位点，因此用SmaI对载体质粒进行酶切，通过获得的片段即可初步判断ITR是否完整。

通常制备的质粒中，≤20%的质粒会丢失一个ITR,这在rAAV的制备中是可以接受的。

3．rAAV的产量取决于转导效率。

用优化的磷酸钙转染方法对293细胞的转染率可接近100%，但必须保证DNA沉淀颗粒细小、均一，转染液的pH稳定。

转染效率可以通过转染含报告基因（β-半乳糖苷酶基因或绿色荧光蛋白基因）表达盒的质粒来检测。

4．腺病毒感染的进程对rAAV的产量有很大影响。

如果在感染后60h,细胞恰好完全病变并开始脱离培养皿，这种情况下rAAV的滴度最高。

如果腺病毒感染的进程过快，细胞不久就脱离培养皿，rAAV的产量就不会高，这种情况下应降低腺病毒的感染指数（multiplicityofinfection,MOI）。

三．重组AAV的滴度测定方法

rAAV的滴度测定可根据情况采用以下不同的方法进行。

1．测定外源基因表达

测定外源基因的表达是确定rAAV滴度的最严格的方法。

阳性转导信号表明rAAV成功地感染了细胞、脱壳、外源基因得到了表达，而且表达水平足以用合适的方法检测到。

然而，由于在不同的外源基因表达的检测上没有统一的标准，因此携带不同基因的rAAV在产量上不便比较。

2.复制中心检测（replicationcenterassay,RCA）

在该项检测中，已向细胞提供了rAAV复制所必需的全部成分：

用野生型AAV提供了AAV的Rep和Cap蛋白，用腺病毒提供了辅助功能。

阳性信号代表rAAV成功地感染了细胞、脱壳、并有能力复制。

但该方法不能检测出外源基因表达盒是否完整。

3.点杂交或Southern杂交

该项检测采用外源基因表达盒的DNA探针，与得到的rAAV基因组进行杂交。

阳性信号代表已制备出rAAV毒粒，但不代表病毒具有感染性或外源基因表达盒有功能。

目前更倾向于采用Southern杂交代替点杂交，这是因为在rAAV制备过程中可能产生一些缺陷的干扰性基因组，这些缺陷的基因组可被包装成病毒颗粒，在做点杂交时也会出现阳性信号。

因此点杂交检测出的阳性信号不能准确地反映出被包装的全长基因组的数量。

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第四节重组AAV生产策略及纯化方法的新进展

尽管rAAV载体作为基因转移工具具有很多优点，但目前尚缺乏快速、高效的大规模生产和纯化方法，这也成为它用于人体基因治疗的最大障碍。

因此，近年来国际上多个实验室都在探索新的rAAV生产策略和纯化方法，并取得了明显进展。

本节即对此进行简要介绍。

一．rAAV生产策略的新进展

归纳起来，rAAV生产策略可分为两大类，即需要转染的制备方法和不需要转染的制备方法。

（一）需要转染的制备方法

目前多数实验室仍采用质粒共转染的方法（HermonatandMuzyczka.1984;Samulskietal.1987,1989）制备rAAV（见上一节）。

近年来，这种基于共转染的制备方法已进行了多项改进，主要包括以下方面。

1．转染方式的改进

这方面的改进包括用电转法代替磷酸钙共转染（Maxwelletal.1997）,将腺病毒与载体DNA和包装质粒通过多聚赖氨酸偶联,靠腺病毒受体的内吞作用进入细胞（Mamounasetal.1995）等。

2．包装质粒的改进

野生型AAV在细胞内复制时，rep和cap基因均达到很高的拷贝数（106/细胞），并随之表达出高水平的Rep和Cap蛋白。

因此，要使rAAV在细胞内高效复制，同样需要高拷贝数的rep和cap基因（Fanetal.1997）及高水平的Rep和Cap蛋白。

Chiorini等（1995）将rep和cap基因构建到SV40扩增子上，在大T抗原的作用下，rep和cap基因扩增至高拷贝，可使rAAV的病毒颗粒数较对照组（不能扩增的包装质粒）提高60倍；Flotte等（1995）用HIV的LTR启动子代替rep基因自身的p5启动子,提高了Rep的表达,并使rAAV的包装效率增强了10倍。

然而，Li等（1997）的研究却发现，Rep的过高表达反而会使rAAV的产量明显下降。

他们仍用p5启动子控制rep基因，但将Rep的起始密码子ATG突变成低效的ACG,构建成一种新的包装质粒pACG2,这样的改造降低了Rep表达，却使Cap的表达显著提高，并因此提高了rAAV的产量。

类似的研究也表明（Vincentetal.1997），用强启动子提高Cap的表达，可以提高rAAV的产量；而提高Rep的表达，却使rAAV的产量降低。

Xiaoetal（1998）在包装质粒pACG2的基础上，在cap基因的下游又加上了一个p5启动子，使rAAV的产量进一步得到提高。

3．辅助病毒的改进

辅助病毒的辅助功能，一方面体现在它能向细胞提供适合AAV繁殖的环境，另一方面体现在它能调节AAV的基因表达。

然而，辅助病毒最终必须从rAAV中去除才能应用于人体基因治疗，否则，即使是灭活的辅助病毒，其变性的蛋白质也会引起人体免疫反应。

因此，Xiao等（1998）将腺病毒上起辅助功能的基因全部构建到一个新的质粒上，由质粒代替腺病毒向rAAV提供辅助功能。

这样的rAAV生产系统就包括了3个质粒：

载体质粒、包装质粒和辅助质粒。

3个质粒共转染293细胞可实现rAAV的高效生产，平均每个细胞可产生1000个转导单位（transducingunit,TU）的rAAV。

Grimmetal（1998）则将包装质粒和辅助质粒的功能合并到一个质粒上，生产rAAV时仅需载体质粒和包装/辅助质粒共转染。

（二）不需转染的制备方法

用rAAV进行基因治疗,对于治疗1个患者需要的重组病毒颗粒数估计在1014左右。

采用质粒转染的方法制备如此大量的rAAV是很困难的。

研究者们一直希望rAAV能像逆转录病毒载体那样用稳定的包装细胞来生产，因此近年来围绕着rAAV生产细胞株做了大量工作。

要建立理想的rAAV生产细胞株，需要将载体成分、rep和cap以及辅助病毒上具有辅助功能的基因全部克隆到一株细胞中，这虽然在技术上可以实现，但它们之间的相互关系在目前很难达到理想化，因此无法实现rAAV的高效生产。

比较现实的做法是将产生rAAV的4种成分简化，在生产方式上用“感染”的方式代替“转染”的方式。

Vicent等（1990）首先建立了表达AAV蛋白的细胞株。

他们用缺失ITR序列的AAV基因组质粒转染HeLa细胞，得到了几株整合了低拷贝AAV基因组的细胞株。

由于Rep和Cap的表达不高，因此得到的细胞株产生rAAV的能力很低。

几个实验室试图建立高表达Rep和Cap的细胞株，均未成功，这主要是由于AAVRep蛋白的抗增殖作用造成的。

这种作用虽然广为人知，但其机理尚未完全阐明。

也有研究者建立了可诱导表达Rep的细胞株（Holscheretal.1994;Yangetal.1994）,但未能提高rAAV的产量。

我们实验室（Yanetal.1997）曾将rep和cap基因装载到EB复制子质粒上，转染A549细胞建立了稳定表达Rep和Cap的包装细胞株，同样未能显著提高rAAV的产量。

Clark等（1995）和Tamayose等（1996）则采用了另外的策略。

他们将载体DNA和AAV的rep和cap基因都整合在HeLa细胞中，然后用腺病毒感染。

采用这样的策略，每个细胞最多可产生数十个感染单位（infectiousunit,IU）的rAAV。

Gao等（1998）及Liu等（1999）也采用HeLa细胞生产rAAV。

他们构建了携带载体成分的重组腺病毒，并用自身启动子控制的rep和cap基因转染HeLa细胞建立包装细胞系，在众多细胞克隆中筛选出rAAV的高产株作为生产细胞。

由于载体成分插入失活了腺病毒的E1区，而E1a和E1b基因产物对rAAV的辅助作用又是必不可少的，因此还需采用野生型腺病毒提供辅助作用。

在该rAAV生产系统中每个细胞可产生数十个TU的rAAV。

Inoue和Russell（1998）发展了一种rAAV包装细胞系，该细胞整合了含SV40复制起点的载体成分和AAV基因组，SV40T抗原则处于四环素开关控制下。

向培养液中加入四环素类似物强力霉素可诱导SV40T抗原合成，在SV40T抗原作用下，连接了SV40复制起点的载体成分和AAV基因组大量扩增。

用腺病毒感染后，rAAV的产量比质粒共转染法提高了10倍，每个细胞可产生104病毒颗粒。

Conway等（1997）和我们小组（Shuetal.1999）用HSV-1扩增子载体携带rep和cap基因，而将载体成分构建到细胞株上。

在制备表达Rep和Cap的HSV-1扩增子时，野生型的辅助病毒（HSV-1）和扩增子假病毒在物理性质上完全一致，不能分开，这一向被认为是HSV-1扩增子载体系统的最大缺陷。

但在生产rAAV时，这一缺陷恰好可以被利用：

不能除去的野生型辅助病毒可以向rAAV提供辅助功能。

研究者们曾希望在辅助病毒的作用下，携带rep和cap基因的HSV-1扩增子可以通过滚环复制达到高拷贝、在几次传代后扩增子与辅助病毒相比占有明显优势。

然而后来的实验表明用这种扩增子系统生产rAAV只能达到与质粒共转染法近似的水平，原因可能在于携带rep和cap基因的HSV-1扩增子在传代过程中并不具有选择优势，此外，该生产系统所含可变因素较多，难以优化。

最近，我们（Wuetal.1999）和Conway等（1999）先后构建了表达Rep和Cap的重组HSV-1,用它感染携带载体成分的细胞株，可实现rAAV的大规模生产。

采用这样的生产系统，每个细胞可产生200~400TU的rAAV。

这是迄今为止最为简便、高效，最适合于大规模制备的rAAV生产系统。

我们构建的重组HSV-1在重组方式和病毒的性质上与Conway等所构建的重组HSV-1有所不同：

我们采用了一套含有HSV-1全基因组的粘粒系统（Conninghametal,1993）进行重组，Conway等采用的是传统的重组方式；我们构建的重组HSV-1是可复制的，rep和cap基因可随重组HSV-1的复制达到高拷贝，Conway等构建的重组HSV-1是复制缺陷型的，需依赖互补细胞系进行繁殖。

可以看出，上述这些策略实际上是将生产rAAV所必需的4种成分进行不同的组合与合并。

虽然各种策略得到的rAAV产量难以以一个统一的标准进行比较，但通过这些尝试，我们认为用重组HSV携带AAV的rep和cap基因的方式效果最好。

这是因为rep和cap基因可随重组HSV-1的复制达到高拷贝、获得高表达,而表达出的Rep又可将整合于载体细胞株的rAAV前病毒基因组拯救并复制，这在一定程度上模拟了野生型AAV裂解性感染时的情形，因此与其它策略相比具有较大的优势。

下一节将结合我们自己的工作，详细介绍这种新型的rAAV生产系统。

在不需转染的rAAV制备方法中，rAAV的体外包装也值得一提。

这种系统由于不依赖于细胞株，因此不会出现野生型腺病毒或野生型AAV污染的情况，具有较高的安全性。

已有两个研究小组（DingandMunshi,1997;ZhouandMuzyczka,1998）分别报道了rAAV的体外包装，虽然产量不高，但作为一种新的模式，值得进一步研究。

二．rAAV纯化方法的新进展

在rAAV的纯化上，上一节已提到，通常采用氯化铯密度梯度离心。

这种方法费时费力，而且回收率低。

此外氯化铯对人体具有潜在毒性，因此目前已不提倡使用氯化铯的纯化方法。

Gimmetal（1998）利用AAV结构蛋白的单克隆抗体，发展了一种免疫亲和层析的纯化方法，只需将细胞裂解液进行一步纯化，整个过程一天内完成。

可回收到大约70%rAAV，纯度可达80%。

由于肝素是AAV天然受体的类似物，另外两个实验室（Clarketal,1999;Zolotukhinetal,1999）分别发展了肝素亲和层析的纯化方法。

采用这种纯化方法的潜在问题是很多细胞蛋白质也同肝素结合，因此需要解决如何去除杂蛋白的问题。

Zolotukhin等采取的办法是先用碘狄醇密度梯度离心，得到“半纯化”的rAAV,再用肝素亲和层析进行纯化。

这种方法快速（一个工作日即可完成）、简便（层析柱已商品化，可以买到）、重复性好，回收率达到50-70%，纯度可达99%。

Clark等则先用脱氧胆酸裂解细胞，离心得到上清后56°C加热45min。

最初，加热的目的是灭活辅助病毒，但加热、冻融后出现了絮状沉淀，表明脱氧胆酸裂解与热处理可能造成蛋白变性。

离心去除沉淀，再进行肝素亲和层析。

结果表明这种方法同样快速（4小时内即可完成）、重复性好，回收率高于70%，纯度可达99%。

我们实验室利用AAV能抵抗氯仿的特性，提出了一种“氯仿处理―PEG/NaCl沉淀―氯仿抽提”的三步浓缩、纯化方法，收到了很好的效果，这在下一节将详细介绍。

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第五节重组AA