绿色荧光蛋白和PCR技术.docx
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绿色荧光蛋白和PCR技术
绿色萤光蛋白
（greenfluorescentprotein），简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。
由水母Aequoreavictoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。
由海肾（seapansy）所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因（reportergene）。
一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如:
兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。
而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。
中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。
但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。
GFP与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。
在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。
若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。
肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。
用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。
利用GFP的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。
发现过程
1994年，华裔美国科学家钱永健（RogerYTsien）开始改造GFP，有多项发现。
世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。
到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。
不过真发现的有用东西并不很多。
成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所SergeyA.Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。
生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。
萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。
而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。
下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为Aequoreavictoria的水母。
1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。
据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。
因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。
1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。
其后Ridgway和Ashley提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。
钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。
1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。
在1962年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。
其后他们仔细研究了其发光特性。
1974年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。
Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。
水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。
这是物理化学中知道的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。
他离开普林斯顿到WoodsHole海洋研究所后，同事普腊石（DouglasPrasher）非常感兴趣发明生物示踪分子。
1985年普腊石和日裔科学家SatoshiInouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）。
1992年，普腊石拿到了GFP的基因。
有了cDNA，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。
普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。
他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。
一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。
当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：
将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者辅助分子。
将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：
美国哥伦比亚大学做线虫的MartyChalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。
水母素和GFP都有重要的应用。
但水母素仍是荧光酶的一种，它需要荧光素。
而GFP蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。
Chalfie的文章立即引起轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。
在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。
纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少人注意。
如果其他生化学家愿意，他们也可以得到水母素和GFP，技术并不特别难。
在1974年以后，特别是八十年代后，后继的工作，很多研究生都很容易做。
其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色，并非显而易见。
绿色荧光蛋白的应用
1、骨架和细胞分裂
KevinSullivan's实验室
酵母菌内SPB和微管动力学
酵母菌中肌动蛋白的动力
果蝇中MEI-S332蛋白
果蝇有丝分裂和mRNA运输
网丙菌属细胞骨架RNA剪切因子的核内运输
网丙菌属的趋化作用
网丙菌属中细胞骨架动力和细胞运动
核动力
网丙菌属中细胞动力
细胞骨架动力和胞内运输
2、细胞器动力学和泡囊运输
用GFP显示小囊运输
用GFP观察TGN运输
细胞骨架动力学和胞内运输
3、发育生物学
用GFP观察线虫的神经发育
分析果蝇神经发育的不对称性细胞分裂
线虫Lin-14
Fischbachlab
用GFP观察网丙菌属的形态发生学
GFP在小鼠发育中的标记方法
4、神经生物学
神经极性发育
trackingintracellulartransportofpeptideneurotransmittersusingGFPAllenLab
Enhancertrappingusingtau-GFPasreporterlocalizedtoaxons
5、其他应用
CellsurfaceorganizationinNaturalKillercellsDanDavis
localizationofcalmodulininS.pombewithGFP
GFP-plakoglobinandexpressionplasmidsKlymkowskylab
MolecularMotionLaboratoryYaleUniversity
MeasuringdiacylglycerolinvivowithaGFP-PKCchimeraTobiasMeyer
BentleyLabusingGFPforon-linebioprocessmonitoring&control
TrackingviralproteinswithGFPfusions
6、GFPvectorsandtechnology
ClontechInc.SupplierofconstructsformakingGFPfusions
DeltaVision3DmicroscopyplatformoptimizedforimagingGFPinlivingcellsinrealtime
GFPExpressionTrulyAmazingWebSiteaboutGFPtechnology
UniversalImagingCorp.makersoftheMetaGFPimageprocessingplatform
QuantumBiotechnologiesIncSuppliersofGFPandBFPconstructs
GFPinArabidopsis
BabCo/CovanceantibodytoGFP
LightoolsGFPplateilluminationsystems
GFPinChlamydomonas
7、OtherInterestingGFPLinks
GFPResourcesforTeachers
PictureofAequoriavictoria,sourceofGFP
StructureofgreenfluorescentproteinFulltextofYangetalNatureStructuralBiopaper
TableofGFPmutantforms
OpticsinCellBiology
来自海洋的礼物——绿色荧光蛋白
在2008年的诺贝尔化学奖上，绿色荧光蛋白成了主角。
诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。
在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，只见这支试管中的物质发出了绿色荧光……
什么是绿色荧光蛋白？
绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，负责发光的基团位于桶中央，因此，绿色荧光蛋白可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。
装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。
当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。
利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。
原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。
对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。
而这种彻底改变了生物学研究的蛋白质，最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。
在大自然中，具有发光能力的生物有不少，萤火虫是陆地上最为我们所熟悉的发光生物，我国古代还有“捕萤数百入囊内照明夜读”的佳话。
在海洋里，某些水母、珊瑚和深海鱼类也有发光的能力。
特别是有的肉食性鱼类专门靠一条闪着荧光的触角来把其他小鱼吸引到自己的嘴边，《海底总动员》里就有这种鱼。
事实上，大多数发光动物能发光是靠两种物质——荧光素和荧光素酶——合作产生的结果。
不同发光生物的荧光素和荧光素酶结构是不一样的。
因此，这些生物的发光本领只能是它们自己的“专利”。
20世纪60年代，一位日本科学家从美国西岸打捞了大量发光水母，带回位于华盛顿州的实验室进行研究。
这些水母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧光，这位科学家希望找到这种水母的荧光素酶。
然而，经过长期的重复努力，居然毫无收获。
他大胆地假设，这种学名叫Aequoreavictoria的水母能发光也许并不是常规的荧光素／荧光素酶原理。
他想，可能存在有另一种能产生荧光的蛋白。
此后，他进行了更多的实验，终于搞清楚了这种水母的特殊发光原理。
原来，在这种水母的体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝光未经人所见就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光。
这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质，就是绿色荧光蛋白。
这位日本科学家也因为这项发现，获得了刚刚颁发的诺贝尔化学奖，他就是日本科学家下村修。
绿色荧光蛋白有什么用呢？
绿色荧光蛋的发光机理比荧光素／荧光素酶要简单得多。
一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。
在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。
将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。
生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。
传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”，因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞。
然而，绿色荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上。
1993年，马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生绿色荧光蛋白，这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。
至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。
后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。
目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。
有了这些荧光蛋白，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。
通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪，由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了今年的诺贝尔化学奖。
瑞典皇家科学院将绿色荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代生物科学研究中最重要的工具之一。
PCR技术
1.PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基蚶┰龇糯蠹赴偻虮丁５酱锲教ㄆ?
Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。
进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。
引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
2.PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
TaqDNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：
15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：
以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：
G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：
每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板（靶基因）核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
3.PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用
94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长
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