香龙血树树叶提取黄酮及初步检验.docx
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香龙血树树叶提取黄酮及初步检验
韩山师范学院
学生毕业论文
（2012届）
题目（中文）香龙血树叶黄酮的提取及初步鉴定
（英文）Sweetdragonbloodleavesflavonoidsextraction
andpreliminaryappraisal
系别：
化学系
专业：
化学班级：
xxxxxxxx
姓名：
xxx学号:
xxxxxxxxx
指导教师：
xxxx
韩山师范学院教务处制
诚信声明
我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。
毕业论文作者签名：
签名日期：
年月日
摘要：
对乙醇提取香龙血树叶中总黄酮的工艺进行了研究。
结果表明：
每1g原料用20mL的60%乙醇在超声波下提取20min时提取效率较好。
每1g香龙血树枯叶用30mL60%乙醇，在超声波中提取30min，其黄酮产率仅低于新鲜叶0.45%
关键词：
香龙血树叶；总黄酮；超声波；提取
Abstract:
tostudysweetdragonbloodleaves’flavonoidstechnologybyethanol.Theresultsshowthateach1g20mLofrawmaterialwith60%ethanolinultrasonicextractionunder20minwhengoodextractionefficiency.Every1gsweetdragonbloodwiththe30mL60%treeleavesethanol,inultrasonicextractionfor30min,theyellowketenesyieldjustbelow0.45%freshleaf.
Keywords:
thedragonbloodleaves;Theflavonoids;Ultrasonic;extraction
目录
1.概述……………………………………………………………………………（5）
1.1研究意义………………………………………………………………………（5）
1.2黄酮类物质的概述……………………………………………………………（5）
1.3黄酮类物质的提取和测定方法………………………………………………（6）
1.4黄酮类物质的鉴别方法………………………………………………………（7）
2.材料与仪器………………………………………………………………………（7）
2.1主要仪器………………………………………………………………………（7）
2.2试剂……………………………………………………………………………（7）
2.3样品及前期处理………………………………………………………………（7）
3.实验内容及结果分析……………………………………………………………（7）
3.1黄酮总含量的测定原理………………………………………………………（7）
3.2标准液的制备以及标准曲线方程……………………………………………（8）
3.3香龙血树叶黄酮类化合物的提取……………………………………………（8）
3.3香龙血树中枯叶中黄酮类的提取…………………………………………（13）
3.4香龙血树提取液中黄酮类化合物的显色反应……………………………（13）
4.结论……………………………………………………………………………（14）
参考文献…………………………………………………………………………（15）
致谢………………………………………………………………………………（16）
香龙血树叶黄酮的提取及初步鉴定
1.概述
1.1研究意义
香龙血树又称巴西铁树，别名巴西木、巴西千年木、金边香龙血树，为百合科、龙血树属常绿乔木，是世界著名的新一代室内观叶植物。
由于龙血树属植物含有黄酮类、酚类、三萜及皂苷等化学成分，其叶基部和茎、枝可提取中药，有止血的作用。
目前对香龙血树的研究主要集中在种植上，而对其黄酮类化合物提取、应用开发技术方面的研究尚无见报。
本课题就是：
对乙醇提取香龙血树叶中总黄酮的工艺进行了研究，寻找从香龙血树提取黄酮的最佳工艺比以及对提取的黄酮类物质进行初步鉴定，旨在探索香龙血树的可利用价值。
1.2黄酮类物质的概述
黄酮类化合物广泛存在于自然界中，数量之多列天然酚性化合物之首，具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物，属于植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。
由于其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。
黄酮类化合物广泛存在于主要存在于双子叶及裸子植物的叶、果、根、皮中；在植物中主要与糖结合成苷的形式存在。
其化合物可分为下列几类：
黄酮和黄酮醇；黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）；异黄酮；异黄烷酮（又称二氢异黄酮）；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮（又称澳咔）；黄烷和黄烷醇；黄烷二醇（3，4）（又称白花色苷元）等。
随着科学研究的发展，至今为止，科学家已经发现的黄酮类化合物种类已达5000多种。
近年来，人们很热衷于天然植物药的开发，植物药以天然、低毒、绿色、可再生等特点备受青睐。
黄酮类化合物就以广谱的药理作用而受到人们的注目。
有关研究表明，黄酮类化合物是一类具有广泛开发前景的天然抗氧剂，目前从中草药提取分离黄酮类化合物报道较多，已知的黄酮类化合物单体已有8000多种，多数具有颜色，在植物体内大部分以配基的形式存在，少部分以游离形式存在。
黄酮类成分具有一定的药学性能，如降低心肌耗氧量、增加冠状动脉及脑血管流量、降血糖、抗氧化、消除体内自由基、抗衰老、增强机体免疫力等功能。
对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题，黄酮类化合物是一类具有广泛开发前景的天然药物。
[1]
图1黄酮类化合物的基本类型及结构
1.3黄酮类化合物的提取方法
目前，黄酮类化合物的提取方法有：
热水提取法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、酶辅助提取法、半仿生提取法、双水相萃取分离法、膜分离法等。
各种提取方法都各有利弊，并且在我国仍然广泛使用。
[2]本实验主要是用有机溶剂提取法以及超声波辅助提取法。
[3][4]
1.4黄酮类化合物的测定方法
黄酮类的测定方法有：
分光光度法、比色法、色谱测定方法、薄层扫描法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法、毛细管电泳法等。
本实验采用分光光度法测定样品中的总黄酮含量，操作简便易行，耗时少，分析结果准确度高。
[5]
1.5黄酮类物质的鉴别方法
黄酮类的鉴别方法有：
纸色谱法、盐酸-镁粉还原反应、金属盐类试剂络合反应、四氢硼钠（钾）反应、硼酸显色反应、浓氨水反应等。
[1]本实验选取实验室常见的试剂，采用简单的方法，利用香龙血树叶的黄酮提取样品分别与碱式醋酸铅水溶液、硼酸溶液、氢氧化钠溶液、三氯化铁水溶液反应进行结构鉴定。
2.材料与仪器
2.1主要仪器
722s分光光度计（上海棱光技术有限公司）、KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）、SSI-BⅢ循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限公司）、分析天平（北京赛的科斯仪器系统有限公司）、植物样本粉碎机、
2.2主要试剂
无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠硝酸铝、氢氧化钠、醋酸铅水溶液、硼酸溶液、三氯化铁水溶液、香龙血树叶子（分新鲜、干枯叶子，本次实验一般采取新鲜叶子）
2.3样品及前期处理
将新鲜的香龙血树叶子和干枯的香龙血树叶子置于烘箱内（60℃），干燥48h,充分干燥后粉碎、进行二次筛选，将筛选所得粉末装入干净的药剂瓶中，备用。
3.实验内容及结果分析
3.1黄酮总含量的测定原理
硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮的原理为:
在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成络合物，加入氢氧化钠溶液后其样品显橙红色,并在500nm波长处有吸收峰，符合定量分析的比尔定律，可以利用其定律进行产率计算。
一般采用芦丁标准液进行定量比较分析。
3.2标准液的制备以及标准曲线方程
精密量取质量浓度为0.2mg/mL的芦丁对照品溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂溶液为空白。
按分光光度法（中国药典2005年版一部附录ⅤB），在510nm波长处测定吸光度，以浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标，得标准曲线方程：
Y=0.0122X-0.0001，R2=0.9996，其线性范围为0~48μg/mL，浓度与吸光值有良好的线性关系。
[6]]
3.3香龙血树叶黄酮类化合物的提取
香龙血树叶黄酮类化合物―—粉碎―—石油醚浸泡―—抽滤―—超声波提取―—抽滤―—定容―—显色―—测定吸光度―—计算含量
精密量取3mL上述溶液于比色管中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂溶液为空白。
按分光光度法在500nm波长处测定吸光度。
由得到标准曲线线性回归方程计算出提取液的总黄酮量，并计算其提取率。
计算公式为：
黄酮得率/%=（待测液中总黄酮的质量/香龙血树叶质量）×100%
3.3.1实验因素的确定[7]]
用超声波法提取黄酮类物质，提取时间大大缩短，产率较高，且实验可在室温下进行，设备简单，操作方便，是提取黄酮类物质的一种有效方法。
其原理是超声波的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出。
本实验利用超声波辅助提取方法进行提取。
在原料粉碎粒度一定的条件下，影响超声波提取的因素有很多，如溶剂用量、溶剂浓度、提取时间、提取温度、超声波功率、溶剂种类。
提取溶剂可以选用水或有机物，常用乙醇、甲醇、丙酮、水等或某些极性较大的混合溶剂如甲醇：
水（1：
1）进行提取。
一般游离苷元，难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂及稀碱液中，在这几种有机溶剂中，除了乙醇不含毒性且应用广泛之外，其它几种像甲醇、丙酮等有机溶剂均是毒性较大。
故此研究中选用乙醇作为提取剂。
超声波的功率对提取率也有影响，超声波的功率越大，对细胞膜的破坏作用越大，越有助于黄酮类化合物的释放与溶出，提高其产率。
但是从实际操作上来讲，超声波的功率太大会增加能量的消耗，增加生产成本，综合考虑，超声波的功率定在250W。
由于本台超声波清洗器缺乏调温的功能，所以本次研究不考虑研究温度对总黄酮的影响。
综上考虑，本实验主要研究乙醇浓度、料液比、提取时间对总黄酮得率的影响。
先通过单因素实验确定其最佳水平范围，再通过正交实验确定最佳提取条件。
3.3.2单因素对总黄酮类物质得率的影响[8][9][10]
3.3.2.1乙醇浓度对黄酮得率的影响
称取1.000g香龙血树叶粉末4份，先用石油醚浸提3个小时，除去叶片上的叶绿素，抽滤，将滤渣置于回流冷凝装置中，各加入30mL（即料液比为1:
30,m/V）在不同浓度的乙醇（50%、60%、70%、95%、100%）在超声波中回流提取30min，趁热过滤，冷却后用同等浓度乙醇定容于50mL容量瓶中，得黄酮得率与乙醇浓度的关系见图1。
图2可看出，随着乙醇浓度的增加，黄酮得率增加，当乙醇浓度达到60%时，黄酮类化合物溶解度最大，黄酮得率最高；乙醇浓度再增加，黄酮类化合物溶解度降低，这是由于存在一些醇溶性的杂质，故本试验选择乙醇浓度为50%～70%范围内较为合适。
表1乙醇浓度对香龙血树叶黄酮提取效果的影响
乙醇浓度/%
30
50
60
70
95
香龙血树叶质量/g
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
超声波提取时间/min
30
30
30
30
30
料液比
1:
30
1:
30
1:
30
1:
30
1:
30
黄酮得率/%
1.24
1.45
1.94
1.87
1.56
图2乙醇浓度对黄酮得率的影响
3.3.2.2料液比对黄酮得率的影响
分别称取1.000g香龙血树叶粉末5份，先用石油醚浸提3个小时，除去叶片上的叶绿素，抽滤，将滤渣置于回流冷凝装置中，分别加入10mL、15mL、20mL、25mL、30mL（即料液比为1:
10～1:
30）的70%乙醇，在超声波中回流提取30min，趁热过滤，冷却后用同等浓度乙醇定容于50mL容量瓶中，得黄酮得率与乙醇浓度的关系见图3。
从图3中可看出，随料液比的增大，黄酮得率增加，但料液比达到1:
20以后增幅不大。
因此当料液比在1:
20～1:
30范围内，黄酮得率较高
表2料液比对香龙血树叶黄酮提取效果的影响
料液比
1：
10
1：
15
1：
20
1：
25
1：
30
香龙血树叶质量/g
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
超声波提取时间/min
30
30
30
30
30
乙醇浓度/%
70
70
70
70
70
黄酮得率/%
1.12
1.26
1.71
1.78
1.87
图3料液比对黄酮得率的影响
3.3.2.3提取时间对黄酮得率的影响
分别称取1.000g香龙血树叶粉末5份，先用石油醚浸提3个小时，除去叶片上的叶绿素，抽滤，将滤渣置于回流冷凝装置中，分别加入30mL的70%的乙醇，在超声波中分别回流提取20～60min，趁热过滤，冷却后用同等浓度乙醇定容于50mL容量瓶中，黄酮得率与提取时间的关系见图3。
从图3可看出，随着提取时间的延长，黄酮得率增大，但提取时间达到40min后，黄酮得率趋于平衡，因此提取时间在40～60min范围内，黄酮得率较高。
但由于提取50min时所得的黄酮产率跟提取60min所得的黄酮产率相同，从节省时间、综合成本来看，本试验选择提取时间为30min～50min范围内比较合适。
表3超声波提取时间对香龙血树叶黄酮提取效果的影响
超声波提取时间/min
20
30
40
50
60
香龙血树叶质量/g
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
1.0000
料液比
1：
30
1：
30
1：
30
1：
30
1：
30
乙醇浓度/%
70
70
70
70
70
黄酮得率/%
1.78
1.87
1.92
1.93
1.93
图4提取时间对黄酮得率的影响
3.2.3正交优化试验[11][12]
不同浸提条件的正交实验结果单因素实验对上述不同提取工艺参数进行了初步的筛选，为了分析参数影响主次因素，得到最佳的提取工艺，进行正交试验。
参照单因素实验结果，以影响黄酮类化合物提取率的乙醇浓度、固液比、提取时间为三个影响因素，取各自的不同水平进行正交试验，实验设计及结果分析如表2所示。
表4正交试验因素水平表
水平
乙醇浓度A
料液比B
提取时间C
1
50%
1:
20
30
2
60%
1:
25
40
3
70%
1:
30
50
表5正交试验及结果分析
编号
A
B
C
黄酮得率/%
1
1
1
1
1.57
2
1
2
2
1.48
3
1
3
3
1.46
4
2
1
2
1.67
5
2
2
3
1.76
6
2
3
1
1.83
7
3
1
3
1.26
8
3
2
1
1.55
9
3
3
2
1.77
均值1
1.503
1.500
1.650
均值2
1.753
1.597
1.640
均值3
1.527
1.687
1.493
极差
0.250
0.187
0.157
从表5可看出，各实验因素及因素水平对香龙血树叶子的总黄酮物质提取率大小的影响表现出一定的差异性。
在本实验中最大的均值为最好值，对应的水平为最好水平。
把各个因素的最好水平组合在一起，就是选出的最优的水平组合。
因此从表5可以得出，4个因子中提取乙醇浓度对黄酮产率影响最大，由极差数据R可见，各因子对黄酮含量的影响主次顺序依次为乙醇浓度（A）＞料液比（B）＞提取时间（C）；综合分析正交试验结果，确定最佳工艺条件为A2B3C1，即用60%乙醇，料液比为1:
30（m/V），提取时间30min（250W）为合适。
对数据的综合分析，可以得出测量的最佳条件为：
在250W的超声波功率下，用60%乙醇30mL,提取时间30min.在该条件下测得香龙血树叶子的总黄酮物质提取率为1.94%。
结果表明，用最佳工艺条件提取，提取物总黄酮的含量高于其它正交试验值。
3.3香龙血树中枯叶中黄酮类的提取
巴西木性喜光照充足、高温、高湿的环境，亦耐阴、耐干燥，在明亮的散射光和北方居室较干燥的环境中，虽能生长良好，但也容易发生叶子枯黄现象，用枯叶来提取黄酮类化合物，可以变废为宝。
分别称取1.000g香龙血树枯叶粉末3份，将其置于回流冷凝装置中，分别加入30mL（即料液比为1:
30）的60%乙醇，在超声波中回流提取30min，趁热过滤，冷却后用同等浓度乙醇定容于50mL容量瓶中，得黄酮平均得率为1.48%，与同质量的香龙血树新鲜叶的黄酮产率的黄酮产率1.94%相比较，其黄酮产率仅低于新鲜叶0.45%。
由于香龙血树中枯叶不含叶绿素，在提取黄酮试验过程中可以免去加入石油醚浸提3个小时的步骤，从能源药品、时间的角度比较分析可得，采用香龙血树的枯叶提取黄酮，既节省石油醚药品，又缩短了试验时间，且石油醚具有一定的毒性，没有添加石油醚更低毒、绿色。
试验的产品也由于完全不含叶绿素而使其色泽鲜亮透明；但不足的是，由于采用的原料被暴晒、冷冻或被真菌侵入，其部分黄酮类的结构不确定是否已被破坏或者产生变异。
3.4香龙血树提取液中黄酮类化合物的显色反应[13][14]
（1）铅盐：
取3mL提取液于试管中，滴加碱式醋酸铅水溶液，溶液先变浑浊，静置，可观察到溶液中有浅黄色沉淀。
说明香龙血树提取液中含有酚类化合物。
（2）硼酸显色反应：
取3mL提取液于试管中，滴加2mol/L的硼酸溶液，可观察到溶液生成亮黄色，说明提取液中的黄酮类化合物分子中具有5-羟基黄酮或2-羟基查耳酮类结构。
（3）碱性试剂显色反应:
二氢黄酮易在碱液中开环，转变成相应的异构体查耳酮，显橙色至黄色。
黄酮醇类在碱液中先呈黄色，通入空气后变为棕色。
分子结构中有邻二酚羟基或3，4-二羟基取代时，在碱液中不稳定，易被氧化，产生沉淀。
取3mL提取液于试管中，滴加1mol/L的氢氧化钠溶液，观察到溶液显橙色。
说明提取液中的黄酮类化合物分子中具有二氢黄酮结构，不具有黄酮醇类结构。
（4）氯化铁试验：
三氯化铁水溶液或醇溶液为常用的酚类显色剂。
多数黄酮类化合物因分子中含有酚羟基，故可产生阳性反应，但一般仅在含有氢键缔合的酚羟基时，才呈现明显反应。
取检品的水溶液1ml，加三氯化铁试液1－2滴,呈现蓝黑色，说明提取液中的黄酮类化合物分子中具有氢键缔合的酚羟基结构。
4.结论
香龙血树是深受人们喜爱的室内观叶植物，本实验通过对材料进行超声波预处理，并在单因素分析的基础上进行正交试验，再采用可见光分光光度法在波长为500nm处测定其黄酮类的含量。
通过单因素和正交试验确定了最佳提取工艺的条件是以60％的乙醇溶液为溶剂，固液比为1：
30，超声波提取时间为20min，提取率最高。
确定了影响因素的主次为乙醇浓度、固液比、提取时间。
随着乙醇浓度的不断提高，黄酮提取率增加，但当达到一定浓度后，提取率反而会下降。
随着料液比的增大，黄酮得率也不断增加，但但料液比达到1:
20后就增幅不大。
随着提取时间的延长，黄酮得率增大，但提取时间达到40min后，黄酮得率趋于平衡了。
本次实验还对已经完全干枯的香龙血树叶进行黄酮类的提取，并将其提取实验步骤及黄酮类的产率与新鲜的香龙血树叶进行比较分析，综合所得，用干枯的香龙血树叶提取黄酮类产物，具有环保的深远意义。
本次实验通过四种显色反应，对所提取香龙血树叶中的黄酮类进行简易的结构鉴别。
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致谢
在我大学四年里，我非常感谢韩山师范学院提供给我来之不易学习的机会，使我在化学教育教学方面收获颇丰，系统地学习了化学专业知识和化学教育教学理论。
特别是我在完成论文期间，我的指导老师衷明华教授给予了我许多具体的指导，提出了非常宝贵的意见。
衷老师严谨的治学态度、务实的工作作风和负责任的工作态度深深影响教育着我，为我今后的学习、工作和生活指明了方向，为此我谨致以老师最衷心的感谢！
同时，感谢所有曾给予我关心、指导和帮助的各位老师和同学！
xxx
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