生物制品检验技术实验.docx
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生物制品检验技术实验
本科生课程实验
（生物工程专业10年级1班）
实验名称
生物制品基本成分测定
姓名：
王帆
同组人姓名：
王兆、庄琳、卢扬、梁美兰
二○一二年十一月
目录
一、绪论………………………………………………………………………1
二、实验…………………………………………………………………9
2-1实验目的………………………………………………………………9
2-2实验原理………………………………………………………………9
2-3仪器药品………………………………………………………………10
2-4实验步骤………………………………………………………………10
2-5数据记录与处理………………………………………………………13
2-6结果与讨论………………………………………………………………14
2-7结束语……………………………………………………………………15
三、参考文献…………………………………………………………………15
一、绪论
生物制品
中文名称：
生物制品
英文名称：
biologicalproduct
定义：
一类用于疾病诊断或防治的制剂。
生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。
生物制品不同于一般医用药品，它是通过刺激机体免疫系统,产生免疫物质（如抗体）才发挥其功效，在人体内出现体液免疫、细胞免疫或细胞介导免疫。
生物制品的种类：
根据采用的材料、制法或用途不同，可分为六类：
疫苗类药物、抗毒素及抗血清类药物、血液制品、重组DNA制品、诊断制品以及其他制品。
生物制品是药品的一大类别，但生物制品的其实材料都具有生物活性、其制备过程是无菌操作的生物学过程，并以生物学技术和分析技术来控制其原料，中间品及成品的质量。
因此，应根据生物制品生产和质量管理的固有特性，对生物制品的特殊要求进行规定。
药品：
指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症，用法和用量的物质。
（包括材料、重要饮片、中成药、化学原料及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清制品和诊断药品等）
生物制品检验技术
生物制品检验的性质和任务
性质：
用化学、物理化学或生物化学的方法和技术来研究生物制品的质量及其控制方法，是一门研究和开发生物制品及其质量控制的“技术学科”。
主要包括：
生物制品形状的检测、生物制品化学组成的检测、物制品杂质限量的检测、生物制品含量的检测等。
任务：
生物制品的常规检验：
以“生物制品质量全面监控”为中心，开展生物制品质量检验
①成品检验（原料,制剂）
②生产过种种质量控制（中间体）,优化工艺
③贮藏过程中的质量控制（稳定性考察）
为新制品研究开发提供科学的质量控制方法
①新制品开发及新剂型质量及稳定性研究
②天然产物活性成分的化学结构确证
③现代生物计数所研制的生物制品质量标准研究
由于生物制品具有：
分子量不是定值、生化法结构确证、需检查生物活性、要求安全性检查、需做效价测定的特点。
其化学性质与生物学性质都很不稳定，又易受微生物污染，故对生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等应有严格要求，以生产出具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小，疗效可靠及营养价值高等特点的安全、高效的生物制品。
为此，必须进行原材料、生产过程和最终产品的全程质量检验、控制，以确保产品符合质量标准要求。
分子量不是定值：
大部分生物制品的活性组分均为大分子的生命物质（如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等）。
组分相同，但相对分子量不同而产生不同的生理活性，因此常需进行相对分子量的测定。
生化法结构确证：
由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用化学药物或结构已知的生化药物所常用的方法，还需要生物化学分析如：
氨基酸组成、N末端氨基酸序列、肽图等
需检查生物活性：
生物制品对热、酸、碱、重金属及pH等变化敏感，各种理化因素的变化易对生物活性产生影响。
特别是多肽和蛋白质。
除理化分析，还需生物检定，防止蛋白质失活
要求安全性检查：
物制品组分复杂，有效成分浓度很低，生物大分子杂质含量比较高，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物。
如重组乙型肝炎疫苗涉及的安全性检查包括：
细胞外源因子检查、原液、半成品、成品中有关血清白蛋白残留量、CHO细胞DNA残留量检查、热原检查、过敏试验、异常毒性检查等。
需做效价测定：
对于生物制品有效成分的检测，除应有一般化学方法或理化分心进行有效成分含量测定外，更应根据产品的特异生理效应或专一化反应拟定其专属性的生物效价测定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。
《生物制品批签发管理办法》规定：
对每一批次的疫苗类制品、血液制品、用于血源筛查的体外生物诊断试剂以及国家食品药品监督管理局规定的其他生物制品，在出厂上市或者进口时进行强制性检验、审核。
检验不合格或者审核不被批准者，不得上市或者进口。
课程实验
此次生物制品检验技术实验主要包括生物制品中水分的测定、生物制品中蛋白质含量的测定、氨基酸的分离鉴定。
生物制品中水分、蛋白质、氨基酸的基本研究
水分测定：
水分：
干燥制品中水分含量的高低，直接会影响冻干制品的质量和保存效期。
冻干血浆水分含量越低越好，能使保存期延长，不易变性。
活菌苗含水量过高，易造成活菌死亡或蛋白质变性使制品失效。
但含水量过低，能使菌体脱水，同样会造成活菌死亡，降低效力。
直接干燥法：
基于生物制品中的水分受热后，产生的蒸汽压高于空气在电热干燥箱中的分压，使制品中的水分蒸发出来，同时，由于不断的加热和排走水蒸气，而达到完全干燥的目的，制品干燥速度取决于整个压差的大小。
测定时样品必须磨碎，全部经过20~40目筛，混匀。
在磨碎过程中，要防止样品水分含量变化。
一般水分在14%以下时称为安全水分，即在实验室条件下进行粉碎过筛等处理，水分含量一般不会发生变化。
但要求动作迅速。
制备好的样品存于干燥洁净的磨口瓶中备用。
测定时，要精确称取上述样品2~10g（视样品性质和水分含量而定），置于已干燥、冷却并称至恒重的有盖称量瓶中，移入95~105℃常压烘箱中，开盖2~4小时后取出，加盖置干燥内冷却0.5小时后称重。
再烘1小时左右，又冷却0.5小时后称重。
重复此操作，直至前后两次质量差不超过2mg即算恒重。
本实验采用直接干燥法！
卡尔费休法：
1935年由卡尔费休提出，采用I2、SO2、吡啶、无水CH3OH（含水量在0.05%以下）配制成试剂，测定出试剂的水当量，在试剂与样品中的水进行反应后，通过计算试剂消耗量而计算出样品中水含量，国际标准化组织把这个方法定为测微量水分国际标准，我们国家也把这个方法定为国家标准测微量水分。
1、原理：
在水存在时，即样品中的水与卡尔费休试剂中的SO2与I2产生氧化还原反应。
I2+SO2+2H2O→2HI+H2SO4
此反应是可逆反应，当硫酸浓度达到0.05%以上时，即能发生逆反应。
若要让反应按照一个正方向进行，需要加入适当的碱性物质以中和反应过程中生成的酸。
经实验证明，在体系中加入吡啶，这样就可使反应向右进行。
2、3C5H5N+H2O+I2+SO2→2氢碘酸吡啶+硫酸酐吡啶
生成硫酸酐吡啶不稳定，能与水发生反应，消耗一部分水而干扰测定，为了使它稳定，可加无水甲醇。
3、硫酸酐吡啶+CH3OH（无水）→甲基硫酸吡啶
4、上面三步反应写成总反应式为：
I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH→2氢碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶
5、从反应式可以看出1mol水需要1mol碘，1mol二氧化硫和3mol吡啶及1mol甲醇而产生2mol氢碘酸吡啶、1mol甲基硫酸吡啶。
这是理论上的数据，但实际上，SO2、吡啶、CH3OH的用量都是过量的，反应完毕后多余的游离碘呈现红棕色，即可确定为到达终点。
6、 I2︰SO2︰C5H5N=1︰3︰10
卡尔费休试剂的配制与标定 若以甲醇作溶剂，则试剂中I2、SO2、C5H5N（含水量在0.05%以下）三者的克分子数比例为：
I2︰SO2︰C5H5N=1︰3︰10 这种试剂有效浓度取决于碘的浓度。
新配制的试剂其有效浓度不断降低，其原因是由于试剂中各组分本身也含有一些水分，但试剂浓度降低的主要原因是由一些副反应引起的，较高消耗了一部分碘。
这也说明了配制这种试剂要单独配，分甲乙两种试剂并且分别贮存，临用时再混合，而且要标定。
但目前我国市场上使用的卡尔费休水份测定试剂，无论是单组份的，还是双组份的一般都由厂家已经调配好的可直接使用产品，但由于卡尔费休试剂是一种很不稳定的混合物质，因此用户在使用时都必须进行标定，以测定其真实的水当量数据。
卡尔费休法测定水份，需要注意如下几点：
①此法适用于多数有机样品，包括食品中糖果、巧克力、油脂、乳糖和脱水果蔬类等样品；
②样品中有强还原性物料，包括维生素C的样品不能测定；样品中含有酮、醛类物质的，会与试剂发生缩酮、缩醛反应，必须采用专用的醛酮类试剂测试。
对于部分在甲醇中不溶解的样品，需要另寻合适的溶剂溶解后检测，或者采用卡氏加热炉将水份汽化后测定。
③卡尔费休法不仅可测得样品中的自由水，而且可测出结合水，即此法测得结果更客观地反映出样品中总水分含量。
④固体样品细度以40目为宜，最好用粉碎机而不用研磨，防止水分损失。
蛋白质：
蛋白质是含氮有机物，自然界中的蛋白质含氮比较稳定，平均含量约为36%，即，100克蛋白质平均含氮16克。
因此在测定生物样品的蛋白质含量时，可先测定样品中的含氮量，再乘以系数6.25，便可以换算成蛋白质含量。
目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法（Biuret）、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）、Folin酚试剂法。
这五种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点。
各种蛋白质含量测定方法比较
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法
灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为±2%
费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时
将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）
用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间
双缩脲法
灵敏度低，1-20mg
中速20-30分钟
多肽键+碱性Cu2+紫色络合物
硫酸铵：
Tris缓冲液，某些氨基酸
用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似
紫外吸收光法
较为灵敏，50-100微克
快速5-10分钟
蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处德光吸收
各种嘌呤和各种核苷酸
用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正
考马斯亮蓝法
灵敏度最高，1-5微克
快速5-15分钟
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其λmax由465nm变为595nm
强碱性缓冲液，TritonX-100SDS
最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化
Folin酚试剂法
灵敏度高，<5微克
慢速40-60分钟
双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原
硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇
耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
双缩脲法：
实验操作简便迅速,但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1～20mgPmL时测定结果较准确。
双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
紫外吸收法：
简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。
此法测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故本法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。
核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。
但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。
考马斯亮蓝法：
该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。
干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。
此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
Folin法：
优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。
缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
而且，耗费时间长，操作要严格计时，颜色深浅随不同蛋白质变化。
凯氏定氮法：
适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。
凯氏定氮法：
蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
（1）有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4
反应式为：
CuSO4+2NH2—+H2S04+2H+＝（NH4）2S04
（2）在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中
反应式为:
（NH4）2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4
2NH3+4H3BO3＝（NH4）2B4O7+5H2O
（3）用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量
反应式为：
（NH4）2B4O7+H2SO4+5H2O＝（NH4）2SO4+4H3BO3
（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3
氨基酸（Aminoacid）：
构成蛋白质（protein）的基本单位，是含有氨基的羧酸，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。
生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
除甘氨酸外均为L－α－氨基酸其中（脯氨酸是一种L－α－亚氨基酸），其结构通式如图（R基为可变基团）。
构成蛋白质的氨基酸都是一类含有羧基并在与羧基相连的碳原子下连有氨基的有机化合物，目前自然界中尚未发现蛋白质中有氨基和羧基不连在同一个碳原子上的氨基酸。
除甘氨酸外，其它蛋白质氨基酸的α－碳原子均为不对称碳原子（即与α－碳原子键合的四个取代基各不相同），因此氨基酸可以有立体异构体，即可以有不同的构型（D－型与L－型两种构型）。
氨基酸结构通式
纸层析法（paperchromatography）依据极性相似相容原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。
由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。
纸层析法是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法又称纸色谱法，是用滤纸为支持物，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，纸纤维上吸附的水分是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。
一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。
根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。
纸层析法可分为一般纸层析法，圆形纸层析法、反相纸层析法和双向纸层析法等。
将样品点在滤纸上（此点称为原点），溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。
为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。
氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann'spurple）。
所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。
茚三酮显色反应受温度、pH，时间影响较大。
如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。
样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。
样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。
铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量测定氨基酸含量。
由于纸上层析设备条件较简单，操作比较简便，并可以分离微量样品，因此纸层析方法已成为生化分析和研究的主要方法之一，广泛应用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、维生素以及脂肪酸等的分离鉴定。
二、实验
2-1实验目的
实验一生物制品中水分的测定，掌握直接干燥法原理及方法
实验二蛋白质含量的测定，了解凯氏定氮法的原理及操作流程
实验三学习氨基酸的分离与鉴定，了解纸层析法的原理和操作方法
2-2实验原理：
实验一生物制品中水分的测定
此次实验运用直接干燥法测量奶粉中水分的含量。
其原理基于生物制品中的水分受热以后,产生的蒸汽压高于空气在电热干燥箱重中的分压,使制品中的水分蒸发出来,同时,由于不断的加热和排走水蒸汽,而达到完全干燥的目的,制品干燥的速度取决于整个压差的大小[5]。
实验二生物制品中蛋白质含量的测定
此次实验运用经典的凯氏定氮法测量蛋白质含量，其原理是样品用浓硫酸消化时，其中的含氮有机物分解放出氨，氨与硫酸化合生成硫酸铵。
在消化时常加入硫酸铜和硫酸钾作催化剂，以加速分解速度并提高消化的温度。
消化完毕，加入强碱使消化液中的硫酸铵分解，放出氨。
利用蒸汽蒸馏法，用硼酸溶液吸收蒸馏出来的氨，氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成离子，使吸收液中的氨离子浓度下降，然后用标准酸溶液滴定，使吸收液中的氢离子恢复到原先的浓度，即可从消耗的酸量，计算样品中的含氮量。
样品消化，蒸馏的化学反应可归纳如下[16]：
（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3↑+Na2SO4+2H2O
实验三氨基酸的分离鉴定——纸层析法
此次试验运用纸层析法，其原理是用滤纸作为惰性支持物，层析溶剂由有机溶剂和水组成的物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：
Rf=原点到层析中心的距离/原点到层析剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数[10]。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
本试验利用纸层析法分离氨基酸[11]。
2-3材料与试剂：
实验一
实验样品：
实验样品为奶粉。
器材：
电子天平，烘箱，称量瓶
实验二
仪器药品：
凯氏蒸馏器、凯氏烧瓶、消化架、三角烧瓶、滴定管、移液管、量筒烧杯、天平、2%硼酸、浓硫酸、催化剂：
硫酸铜和硫酸钾按3∶1混合，研细。
混合指示剂：
0.1%溴甲酚绿酒精溶液10ml，0.1%甲基红酒精溶液2ml，混合即得，贮于棕色瓶内。
实验三
实验仪器：
层析缸；毛细管；喷雾器；层析滤纸。
试剂：
扩展剂（将20ml的正丁醇和5毫升的的冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静止后分层，放出下层水层备用）；氨基酸溶液（0.5%的赖氨酸，脯氨酸，结氨酸，苯丙氨酸，亮甘酸溶液及他们的混合液）；显色剂50-100毫升0.1%水和茚三酮正丁醇溶液
2-4实验步骤：
实验一
测定时，精确称取奶粉2~10g（视样品性质和水分含量而定），置于已干燥、冷却并称至恒重的有盖称量瓶中，移入95~105℃常压烘箱中，开盖2~4小时后取出，加盖置干燥内冷却0.5小时后称重[6]。
再烘1小时左右，又冷却0.5小时后称重。
重复此操作，直至前后两次质量差不超过2mg即算恒重[7]。
实验二
1．样品的消化
（1）在分析天平上准确称取生物制品干粉（40─60目过筛）100─500mg（视样品中含氮量而定）2份。
（2）取50ml凯氏烧瓶3只，将称好的样品分别送入第1、2只烧瓶底部，第3只烧瓶不加样品，作为空白对照，以测定试剂中的微量含氮化合物。
于各个烧瓶中加入催化剂0.3g，浓硫酸5ml，然后将烧瓶置于通风橱消化架上，先用小火加热，待瓶内水分蒸完，硫酸开始放出SO2白烟，可加大火焰，使液体保持微沸状，直至溶液呈透明蓝绿色为止。
在消化过程中，要经常转动烧瓶，使得瓶壁上的碳化颗粒，为浓硫酸回流至瓶底，使消化完全。
为了缩短消化时间，当溶液变为浅棕色时，可加3─4滴30%过氧化氢。
消化完毕，冷却，待蒸馏。
2．氨的蒸馏
（1）蒸馏装置的洗涤：
先用自来水将凯氏定氮仪清洗干净，按图1装置好。
在蒸汽发生瓶中（烧瓶1）加入约2/3体积的蒸馏水，加入浓硫酸数滴（在酸性情况下，水中氨不会蒸馏出来）及沸石（或毛细管数根）使沸腾均匀，关闭活塞A和B，将烧瓶1中的水煮沸，使蒸汽充分洗涤仪器，并检查装置的各个部分有无漏气现象，然后打开活塞B，让蒸汽洗涤漏斗约5分钟，再将活塞B关闭，继续蒸馏约5分钟，使全部蒸馏器洗涤干净。
先移去三角烧瓶，再移去煤气灯，略等数秒钟，此时烧瓶1内气压下降，积聚在蒸馏瓶3内的水，被吸到管2内，开启活塞A，废液即从管2底部放出。
以后每个样品蒸馏完毕，都需进行上述的洗涤过程2─3次。
（2）消化液的蒸馏：
先打开活塞A和B，再将事先准备好的盛有5ml2%硼酸及2滴混合指示剂的三角烧瓶，放在冷凝管下端，使管口浸入液面下。
取蒸馏水1ml加到凯氏烧瓶中，使与消化液混合，小心地将此溶液从漏斗倒入蒸馏瓶3中，再用少量蒸馏水洗涤克氏烧瓶，洗液也从漏斗倒入蒸馏瓶3中，如此洗涤3次。
然后从漏斗加入30%NaOH7ml，用蒸馏水少许洗涤漏斗2次，每次放液时都应控制活塞B，保留少许蒸馏水于漏斗内，密封之以防逸出氨气。
关闭活塞A和B，立即将烧瓶1加热沸腾，开始蒸馏。
三角烧瓶中的液体由棕紫色变为蓝绿色，再继续蒸3分钟，将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟。
用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端，洗涤液直接流入三角烧瓶中，然后移去三角烧瓶，再移煤气灯，使蒸馏瓶3中的废液吸到管2中，开启活塞A放出废液。
然后按上述步骤洗涤蒸馏器备用。
3.滴定
蒸馏完毕后，将三角烧瓶内的溶液，用0.01mol/L盐酸滴定，使溶液从蓝绿色变为淡紫色，即为终点。
分别记下样品和空白所消耗的0.01mol/L盐酸ml数，分别以Vs和V0表示之[8]。
实验三
1、取层析纸一张。
在纸的一端距边缘2厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1-1.5厘米作一记号。
2、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，干后再点一次。
每点在纸上的扩散直径最大不超过3毫米。
3、扩展用线将滤纸缝成筒状，只得两边不能接触。
将盛有扩展剂的培养
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