细胞凋亡坏死细胞活性检查常见方式及试剂.docx

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细胞凋亡坏死细胞活性检查常见方式及试剂

线粒体膜电位指示染料

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件.它在凋亡进程中与caspase活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。

基于以上研究，Biotium研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。

MitoView™633

MitoView™633是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料（激发光/发射光622/648nm）。

利用NucView™488和MitoView™633凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜（图.1）或流式细胞仪（图.2、3）下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。

图1.利用MitoView™633进行活细胞染色:

Hela细胞

图2.流式细胞仪分析：

Jurkat细胞一组用CCCP使线粒体去极化，另一组利用staurosporine作为凋亡诱导剂。

利用MitoView™633染色

图3.流式细胞仪分析：

对照（A）与经staurosporine处置（B）的Jurkat细胞（JC-1染色）.FL1（x-轴）为绿色荧光;FL2（y-轴）为红色荧光。

（A图）较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降.（B图）较低的红绿荧光比例说明：

由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。

JC-1线粒体膜电位检测试剂盒

JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。

在健康细胞中,JC-1以聚合体（J-aggregates），的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光（激发光/发射光585/590nm）。

相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光（激发光/发射光510/527nm），如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。

经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。

通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变能够很容易地检测到细胞膜电位的下降，从而能够用于初期的细胞凋亡检测。

Rhodamine123

Rhodamine123是一种绿色荧光染料（激发光/发射光505/534），普遍用作检测线粒体膜电位（流式细胞仪检测）。

TMRE和TMRM：

四甲基罗丹明乙脂或是甲基脂,是穿膜型的红色荧光探针（激发光/发射光548/573nm），它们很容易被线粒体摄取。

这些荧光探针经常使用于线粒体膜电位检测（流式细胞仪检测）。

DASPEI

DASPEI是一种红色的线粒体膜电位荧光染料（激发光/发射光461/589nm），被普遍用于高通量分析检测。

DiIC1（5）

DiIC1（5）是一种深红的羟花青染料（激发光/发射光638/658nm）,常被用于检测凋亡细胞中的线粒体膜电位。

MCB谷光苷肽检测试剂盒

在细胞凋亡事件的初期，细胞质中谷胱甘肽（GSH）水平开始下降。

细胞内GSH的排除超级活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能致使了凋亡初期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反映。

MCB（Monochlorobimane）（激发光/发射光380/461nm）是一种荧光染料，在GST的作用下，它能够与谷胱甘肽结归并会发出蓝色荧光。

能够通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡初期细胞内氧化还原状态的转变。

（图4）

图4.Jurkat细胞别离以DMSO处置（作为对照）和1uMstaurosporine处置（凋亡诱导4小时）。

利用MCB谷光苷肽检测试剂盒检测其谷胱甘肽（GSH）水平。

NucViewTM488Caspase-3底物

可在活细胞中实时检测caspase-3活性

在凋亡初期的进程中，caspase-3裂解对应的胞浆胞核底物，致使了细胞在形态上和生理生化功能上产生了一些列转变。

NucView™488Caspase-3底物是一种穿膜型的荧光标记的caspase底物，可在活细胞中实时检测caspase-3活性。

传统的荧光caspase底物不能用于活细胞的caspase活力检测，因为其需要裂解细胞；其他的一些检测手腕也仅仅只能检测在一个细胞群落中caspase的平均活力。

基于荧光标记的caspase抑制剂的检测技术（FLICA）能够进入活细胞检测caspase活力，可是荧光探针本身确实是不可逆转的caspase抑制剂，因此无法在活细胞中实时检测caspase的活力。

产品特性:

•双功能:

许诺研究人员在凋亡细胞内检查caspase-3的同时染色细胞核，显示在细胞核在凋亡进程中经历的形态学转变；

•可不能阻碍caspase-3的活性,能够实现实时检测caspase-3；

•直接加入细胞培育液即可快速染色，无需清洗残余；

•可用甲醛固定,兼容免疫染色；

•可利用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪进行检测；

•兼容贴壁细胞与悬浮细胞。

NucView™488Caspase-3底物是Biotium公司研发的用于活细胞实时检测caspase-3活性的荧光探针，适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪。

这种底物由一段大量带负电荷的DEVD肽段与一种DNA结合染料连接而成。

这种底物最初不能结合DNA，也不能产生荧光，这种底物能够穿过细胞膜进入细胞质，在那个地址被Caspase-3所剪切，从而释放出和DNA高亲和力的染料，释放出的染料迁移进入细胞核并将细胞核染成亮绿色。

（图1、图2）。

图1.NucView™488荧光底物检测caspase活性的原理

图2.利用Staurosporine诱导Jurkat细胞凋亡后，利用NucView™488（活细胞caspase3检测）（绿色）和CF™594AnnexinV染色（红色）。

NucViewTM488Caspase-3活细胞凋亡检测试剂盒

由贮存在DMSO中的NucVIEW™488Caspase-3底物与caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO组成.

NucViewTM488Caspase-3底物

别离以1mM浓度别离存储在DMSO或是PBS中的形式提供。

DMSO贮存形式NucView™488Caspase-3底物适用于一样类型的细胞，PBS贮存形式针对DMSO灵敏型的细胞。

NucViewTM488Caspase-3底物与CFTM594-AnnexinV双凋亡检测试剂盒

是一种双凋亡检测方式试剂盒，包括用来检测磷酸化丝氨酸（PS）转位的深红色荧光探针CF594-annexinV和Nucview488caspase-3底物（图.2）.

NucViewTM488与MitoViewTM633凋亡检测试剂盒

包括了深红荧光探针MitoView™633和NucView™488Caspase-3底物，通过荧光显微镜或是流式细胞仪可同时检测线粒体膜电位与caspase-3活性。

（图.3）.

图2：

利用流式细胞术检测细胞在凋亡进程中的caspase-3的活性和线粒体膜电位（NucView™488和MitoView™633凋亡检测试剂盒）

样本：

staurosporine诱导凋亡的Jurkat细胞

仪器：

BDFACSCaliburflowcytometer.

FL1（x-轴）：

NucView™488，FL4（y-轴）：

MitoView™633从图中能够看出，在凋亡进程中，NucView™488的荧光信号增强的同时线粒体膜电位在下降（MitoView™633荧光探针检测）

AnnexinV偶联物

AnnexinV是一段35-36kDa的磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力。

细胞发生凋亡初期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，AnnexinV通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡初期细胞的胞膜结合1。

用荧光标记

的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生（图.1、图.2）。

Biotium提供了多种波段荧光标记的annexinV偶联物，其标记的荧光染料是Biotium独创的具有超高亮度和光稳固性的CF™荧光探针，可适用于各类凋亡和坏死细胞的检测分析。

图1.Jurkat细胞凋亡检测，NucView™488（绿色）与CF647-AnnexinV（品红）染色。

Figure2.流式细胞术分析：

别离是未利用和利用staurosporine诱导Jurkatcell凋亡，利用NucView™488和CF647-AnnexinV染色。

Apoptosisandnecrosisquantitationkits

咱们的凋亡/坏死定量检测试剂盒包括了一对荧光探针：

绿色的CF488A-AnnexinV和另一种非穿膜性的红色核酸结合染料（PI、7-AAD、EthD-III）。

由于其不能穿透细胞膜，因此关于有完整细胞膜的凋亡初期细胞不能染色，而坏死细胞和凋亡晚期的细胞，其膜的完整性丧失，能够被染色。

将其与CF™488A-AnnexinV匹配利用，能够将凋亡初期的细胞和晚期的细胞和死细胞

区分开来。

Dualapoptosisassaykit

咱们的双凋亡检测试剂盒包括用来检测磷酸化丝氨酸（PS）转位的深红色荧光探针CF594-annexinV和检测caspase-3活性的Nucview488caspase-3底物。

足够在流式细胞仪或荧光显微镜上进行至少50次实验。

凋亡与坏死定量检测试剂盒

Apoptosis&NecrosisQuantitationKit

Biotium的凋亡/坏死定量检测试剂盒包括了一对荧光探针：

绿色的CF™488A-AnnexinV和另一种非穿膜性的核酸结合染料（如：

PI、7-AAD、EthD-III）。

由于其不能穿透细胞膜，因此关于有完整细胞膜的凋亡初期细胞不能染色，而坏死细胞和凋亡晚期的细胞，其膜的完整性丧失，能够被染色。

将其与CF™488A-AnnexinV匹配利用，能够将凋亡初期的细胞和晚期的细胞和死细胞

区分开来。

（图.1）.Biotium独创的CF™488荧光染料在亮度和光稳固性上远超传统的绿色荧光染料。

CF™488-AnnexinV和7-AAD（7-氨基放线菌素D）凋亡检测试剂盒

适用于荧光显微镜的凋亡检测（图.1）,因为7-AAD在绿色荧光通道的溢出效应最小。

而CF™488-AnnexinV和PropidiumIodide（PI，碘化丙啶）凋亡检测试剂盒推荐适用流式细胞仪（图.2）.

Apoptosis&NecrosisQuantitationKitPlus

包括CF™488A-AnnexinV和EthidiumhomodimerIII荧光探针。

EthidiumhomodimerIII,（EthD-III）1,2是一种非穿膜性的核酸结合染料，这是由Bioium研发的新型探针，它和传统的Propidiumiodide（PI：

碘化丙啶）相较，具有

更好的DNA亲和性和更高的亮度。

TheApoptotic,Necrotic,andHealthyCellsQuantitationKit

那个试剂盒除CF™488A-AnnexinV和EthidiumhomodimerIII一对荧光探针，还包括了Hoechst33342,这是一种穿膜性的蓝色DNA荧光染料（激发光/发射光350/461nm），从而实现凋亡、坏死、健康细胞的定量检测。

Calcein-AM活细胞检测试剂盒

可用于活细胞定量检测;动物细胞存活率和细胞毒性检测试剂盒中含有1对探针：

calcein-AM和ethidiumhomodimerIII（EthD-3）,绿色荧光的CalceinAM基于胞内脂酶活性检测活细胞，而红色荧光DNA染料EthD-3基于膜完整性的破坏检测死细胞。

图1.Staurosporine诱导的Jurkat细胞CF™488A-AnnexinV探针（绿色）与7-AAD探

针（绿色）

图2.流式细胞术分析Jurkat细胞：

左图为对照，右图利用1uMstaurosporine处置5小时，利用CF™488AAnnexinVandPIApoptosisKit进行分析。

活细胞为AnnexinV（-）/PI（-）,初期凋亡细胞显示为AnnexinvV（+）/PI（-）,凋亡晚期细胞和坏死细胞显示为AnnexinV（+）/PI（+）。

dUTP偶联物与TUNEL试剂盒

在细胞凋亡中,染色体DNA的断裂是一个重要的标志事件1.凋亡细胞的DNA双链断裂或只要一条链上显现缺口会产生的一系列DNA的3’-OH结尾，可在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT）的作用下，将荧光素或是生物素标记的dUTP偶联物连接到断裂DNA的3’-OH结尾，能够通过流式细胞仪或是荧光显微镜检测到dUTP偶联物发出的荧光。

这确实是常说的TUNEL法（TdT介导的dUTP缺口结尾标记技术）的原理。

TUNEL法凋亡检测是分子生物学与形态学相结合的研究方式，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特点，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培育的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一样的组织化学和生物化学测定法要高，因此在细胞凋亡的研究中已被普遍采纳。

CF™荧光标记dUTP偶联物

Biotium提供各类波段的CF™荧光染料标记dUTP偶联物，用作直标法TUNEL凋亡检测。

咱们的CF™488A和CF™594TUNELAssayApoptosisDetectionKits包括完整的反映缓冲液、用于TUNEL标记的TdT酶，和Biotium独创的具有超高亮度和光稳固性的绿色荧光CF™488A和深红色荧光CF™594偶联的dUTP。

整个实验操作进程,简便、快速，实验结果直观而且灵敏度高。

生物素标记的dUTP偶联物

Biotium提供数种不同连接臂长度的生物素-dUTP偶联物.这些偶联物可用于TUNEL法凋亡检测，能够利用荧光标记的链霉亲和素或是抗生物素的抗体进行显色分析。

一样情形下，dUTP与生物素之间的连接臂长度越短，其与DNA的

3’-OH结尾的连接效率越高，之间的连接臂长度越长，生物素与链霉亲和素结合的效率越好。

生物素与dUTP之间的数字说明其连接臂的长度，例如：

biotin-11-dUTP表示之间是11个原子的连接臂长度。

图1.Jurkat细胞无处置（对照），1uMstaurosporine诱导凋亡3小时，CF™488TUNELAssayApoptosisDetectionKit染色分析，利用DAPI（蓝色）共染色。

活性染料与凋亡诱导剂

活性染料

Biotium独创的RedDot™2非穿膜性的核酸结合染料，能够基于细胞膜完整性选择性的对细胞核进行染色。

RedDot™2也能够作为透性化细胞、固定细胞或组织切片的核酸复染剂。

EthidiumhomodimerIII1,2（EthD-III）是一种非穿膜性的核酸结合染料，这是由Bioium研发的新型探针，它和传统的Propidiumiodide（PI：

碘化丙啶）相较，具有更好的DNA亲和性和更

高的亮度。

Biotium提供多种的非穿膜性的核酸荧光染料，可基于细胞膜的完整性来标记细胞。

包括EthDIII、7-AAD和PI。

咱们也提供各类穿膜性活细胞染色的核酸荧光探针，包括深红的RedDot™核酸染料,Hoechst染料,和acridineorange（AO：

丫啶橙）,这些染料与ethidiumbromide（EB）联合利用，可用作活细胞与死细胞的鉴定。

凋亡诱导剂

化学凋亡诱导剂在细胞凋亡的研究中有着普遍的应用。

Staurosporine是一种非特异性的蛋白激酶抑制剂，能够诱导多种类型细胞凋亡。

咱们也提供ionomycin,一种钙离子载体，它能够通过激活钙蛋白酶来诱导凋亡的发生。

活细胞定量检测

Biotium公司提供数种用于细胞存活率和细胞毒性查验试剂盒，他们依照不同的原理检测细胞存活率和细胞毒性的不同方面。

Calcein-AM活细胞定量检测试剂盒

Calcein-AM是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光。

Calcein-AM由于在Calcein（钙黄绿素）的基础上增强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。

当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein（钙黄绿素）留在细胞内,发出强绿色荧光。

与其它同类试剂相较，Calcein-AM是超级适合作为荧光探针去染活细胞的，因为Calcein（钙黄绿素）可不能抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性，因此它的细胞毒性很低。

Calcein-AM活细胞检测试剂盒可用于活细胞定量检测;动物细胞存活率和细胞毒性检测试剂盒中含有1对探针：

calcein-AM和ethidiumhomodimerIII（EthD-3）,绿色荧光的CalceinAM基于胞内脂酶活性检测活细胞，而红色荧光DNA染料EthD-3基于膜完整性的破坏检测死细胞。

关于活的或死的细菌细胞的检测，请利用细菌细胞存活率和细胞毒性检测试剂盒（Cat#30027），它一样提供了两种荧光的染色。

Resazurin（刃天青）,MTT,与XTT细胞活性检测试剂盒MTT,XTT,和resazurin（又名：

AlamarBlue®阿尔玛蓝）都能被活细胞线粒体所代谢而产生荧光物质,利用荧光或吸光度测量，可检测这种转变，从而检测细胞活性和定量活细胞数量。

MTT、XTT在活细胞中会被代谢成有色的formazin盐，能够利用酶标仪测量其吸光度（OD值）5,6。

MTT产生的是一种不溶性的formazin盐，因此在测量时需要裂解细胞，而XTT在测量时无需裂解细胞。

Resazurin（刃天青又名：

AlamarBlue®阿尔玛蓝））是一种非荧光蓝色染料。

加入培育液中，可作为氧分子电子传递链的受体，其代谢产物是一种粉红色荧光复合物（resorufin），呈现由蓝向红转变的颜色转变，可用光度计测定，也可用荧光检测。

图1.HeLa细胞定量检测利用CalceinAMCellViabilityAssayKit进行检测

检测前：

96板培育24小时。

图2.用CalceinAM/Ethd-3染色的Hela细胞。

活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。

图3.Hela细胞活性定量分析。

Resazurin细胞活性检测试剂盒

ATP-Glo™BioluminometricCellViabilityAssayKit

ATP-Glo™BioluminometricCellViabilityAssayKit是通过定量存在的ATP，确信培育物中活细胞数量的方式。

其中ATP是细胞代谢活性的指示剂。

本试剂盒采纳生物发光（bioluminescent）法，利用Fireflyluciferase（萤火虫荧光素酶）催化底物D-Luciferin（荧光素）的转化，高效利用ATP的能量，发射出光子。

发光信号与存在的ATP量呈正比，而ATP与存在于培育基中的细胞数量直接呈正比.8-10ATP-Glo™kit最低能够检测到单个细胞或是0.01picomole的ATP,检测信号的线性范围能够达到6个数量级。

ATP-Glo™kit适用于单样品系统的luminometer荧光发光检测仪或是全自动96孔板luminometer荧光发光检测仪。

图2.Jurkat细胞数量滴度曲线，利用ATPGlo™BioluminetricCellViability试剂盒分析.仪器：

单管型luminometer，Jurkat细胞悬浮液依次10倍稀释