用16SrDNA方法鉴定细菌种属.docx

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用16SrDNA方法鉴定细菌种属

用16SrDNA方法鉴定细菌种属

一、实验目的

1。

掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；

2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、实验原理

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。

是一种快速获得细菌种属信息的方法.

　16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟,其种类少,含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称.在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23SrDNA的拷贝数相同。

16SrDNA由于大小适中，约1。

5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鉴定细菌,其技术路线如下：

细菌基因组的提取：

PCR的基本原理:

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链，以便它与引物结合,为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）:

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

二、操作步骤

1、细菌基因组DNA提取；

2、PCR扩增；

3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；

4、扩增片段回收；

5、DNA片段测序。

三、结果处理与分析

在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1。

02g，放入回收的凝胶后为1.42g,,则凝胶为400mg，因此加入的BindingBuffer为1200μl。

我们小组选用B116Ssequence,以下为制作进化树过程:

1、根据B116S基因序列，到NCBI上比对，确定其种属

（1）NCBI主页（http：

//www.ncbi。

nlm。

nih。

gov/）依次点击进入BLAST

（2）选择nucleotideBLAST

（3）将B1序列复制到文本，框里ChooseSearchSet处点复选按钮others，最后点BLAST

（4）点击BLAST后，数据进行提交.BLAST结果如下：

图中“Evalue”指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totlescore）都是数值越高相似度越高。

我组将数据按照Querycover从100％开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。

（5）导出数据

数据导出格式选择FASTA：