生物化学讲义16DNA的复制修复和重组 考研生物化学精编辅导讲义.docx

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生物化学讲义16DNA的复制修复和重组考研生物化学精编辅导讲义

第三部分、分子生物学－信息途径

第十六节：

DNA的复制、修复和重组

中大历年考题：

一、填空题

1.DNA复制时，引发前体和引发酶构成____________。

（0828）

2.端粒的简单串联重复DNA合成由_________酶负责。

（0724）

3.基因组中能独立复制的单位称__________。

（0725）

4.现已发现大肠杆菌有五种不同的DNA聚合酶，其中真正负责DNA复制的是_________。

（0619）

5.DNA复制的两大特点是_________复制和_________复制。

（0501）

6.基因组中能够独立复制的单位称_________。

（0502）

7.DNA连接酶催化的连接反应需要能量供给，大肠杆菌以_________为能量来源，而动物细胞以_________为能量来源。

（0503）

8.大肠杆菌的三种DNA聚合酶中有5’-3’外切酶活性的是_________。

（0504）

9.真核生物DNA聚合酶中负责冈崎片段合成的是_________。

（0505）

10.端粒的简单串联重复DNA合成由_________酶负责。

（0506）

11.DNA复制后最常见的修饰是某些碱基的___________，目的是自我识别，以免受到自身核酸内切酶的破坏。

（0524）

12.反向重复序列_________（05三7）

13.基因突变________（05三9）

14.复制体________（05三10）

15.基因家族_________（04三5）

16.复制子__________（04三8）

二、判断题

1.生物物种随基因组增大，独特基因减少，家族基因增多。

（0820）

2.细胞器基因组都是环状DNA分子。

（0828）

3．小鼠基因组的中性位点的年替换率大于人类的基因组。

（0830）

4.原核生物和真核生物的聚合酶都是以dNTP为底物。

（0719）

5.噬菌体的整合由整合酶引发，其功能相当于Ⅱ型拓扑异构酶。

（0722）

6.人类的球蛋白基因基因簇包括了在不同发育阶段表达的各种基因。

（0727）

7.原核生物基因组包括少量的非转录DNA，如复制和转录的调控区域。

（0728）

8.在复制子中，复制起点与自主复制相关，而与复制的拷贝数不相关。

（0601）

9.5－氟尿嘧啶是直接抑制DNA复制的抗癌药。

（0602）

10.真核细胞都是二倍体，而原核细胞都是单倍体。

（0622）

三、问答题

1.简述生物物种保持稳定的分子基础。

（08三7）

2.随着逆转录酶的发现，有人认为RNA是最初的遗传信息载体，但为什么目前发现的物种多数以DNA作为贮存遗传信息的物质？

（07三4）

3.限制性内切酶在酶切过程中有哪些影响因素？

（07三6）

4.简述形成抗体多样性的分子机制。

（07三8）

5.有很多因素可以导致DNA的损伤，但又是如何保证“种瓜得瓜，种豆得豆”的呢？

（06三5）

6.简述真核生物与原核生物DNA复制的异同。

（05四7）

7.简述真核生物与原核生物基因组结构的主要差别。

（05四8）

知识点复习：

§16.1DNA的复制

DNA的生物合成:

两种方式①DNA复制②RNA反转录

DNA复制的特征：

半保留复制：

DNA复制过程中，新产生的子代分子的一条链来自亲代，另一条链是新生成的，复制方式称为DNA的半保留复制。

半不连续复制：

DNA复制时，一条链的合成方面与复制叉移动方向一致，称为前导链，其合成是连续的，另一条链的合成方向与复制叉移动方向相反，称为滞后链，其合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制，不连续片段称为冈崎片段。

双向复制：

原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。

DNA复制的起点和方式

（1）：

复制起点

复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。

有

时，两条链的复制起点并不在同一点上（不对称复制，如D环

复制）。

复制单位

复制子，基因组能独立进行复制的单位，每个复制子都含

有一个复制起点。

原核生物的DNA和真核生物细胞器的DNA是单个复制子，真核

生物染色体DNA是多复制子，都在一个固定的起点开始复制，

复制方向

大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复

制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。

习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。

复制子是独立完成复制的功能单位。

复制方式

滚环式，如：

噬菌体ΦX174；

D-环式，如：

线粒体、叶绿体DNA复制。

直线双向复制，真核染色体DNA采用这种方式。

真核生物染色体DNA的复制速度比原核生物的慢。

参与DNA复制的物质：

底物:

dATP,dGTP,dCTP,dTTP

聚合酶:

依赖DNA的DNA聚合酶

模板:

解开成单链的DNA母链

引物:

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子

原核生物DNA聚合反应有关的酶类：

DNA聚合酶

拓扑异构酶：

兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。

DNA解链酶

单链结合蛋白（SSB）：

结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。

引物酶和引发体：

启动RNA引物链的合成。

DNA连接酶

拓扑异构酶：

拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。

拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。

DNA解链酶：

解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。

目前发现存在至少存在两种解链酶。

单链DNA结合蛋白：

单链DNA结合蛋白（SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。

这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。

其作用为：

①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

E.coli.DNA聚合酶I（Kornberg酶）

单体酶，含一个Zn2+。

用蛋白水解酶将DNA聚合酶I部分水解可得：

大片段（Klenow），活性：

5’→3’聚合活性、3’→5’外切活性。

小片段，活性：

5’→3’外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。

Klenow片段的用途：

a.补齐DNA3，隐缩未端;b.标记DNA片段未端;c.cDNA合成第二链d.DNA测序

功能：

对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

E.coli.DNA聚合酶Ⅱ

单体酶，可能在DNA的修复中起某中作用。

基因发生突变，细菌依然能存活

E.coli.DNA聚合酶Ⅲ（复制酶）

寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。

DNA聚合酶Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶。

5’→3’外切酶活性只作用于单链DNA。

DNA连接酶:

大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP作为能量来源。

原核生物的DNA复制的过程:

预引发：

1．解旋解链，形成复制叉：

由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，拓扑异构酶和解链酶使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。

单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。

2．引发体组装：

其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

引发：

在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

复制的延伸:

由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。

在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α（延长随从链）和δ（延长领头链）。

以3‘→5’方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5‘→3’，这一条链被称为前导链。

而以5‘→3’方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时其链的聚合方向与复制叉移动的方向相反，这条链是不连续合成的，称为随后链。

冈崎片段：

由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随后链的合成也是一段一段的。

DNA在复制时，由随后链先形成的一些短DNA片段称为冈崎片段。

冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

复制的终止：

去除引物，填补缺口：

在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。

连接冈崎片段：

在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

真核生物DNA的复制：

真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，每个复

制子在100-200bp之间，比细菌染色体DNA小得多。

真核生

物DNA复制叉移动的速度也比原核的慢。

真核生物染色体DNA复制时，核小体解开，但组蛋白八聚体并不散开。

真核生物DNA的末端有端粒结构，富含G/C。

人的端粒为TTAGGG。

端粒的功能是：

A，稳定染色体末端结构。

B、防止染色体间末端连接。

C、可补偿滞后链5-末端在消除RNA引物后造成的空缺。

端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以所含的RNA为模

板合成DNA端粒结构。

保证复制忠实性的原因主要有以下三点:

DNA聚合酶的高度专一性

严格遵循碱基配对原则。

DNA聚合酶的校对功能

错配碱基被3’-5’外切酶切除。

起始时以RNA作为引物

起始时以RNA作为引物的作用：

DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？

这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。

已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。

因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。

逆转录－RNA指导的DNA合成：

逆转录酶有3种酶的活性：

①依赖RNA的DNA聚合酶活力：

合成DNA

②RNaseH活性：

水解除去RNA-DNA杂合分子中的RNA

③依赖DNA的DNA聚合酶活性：

以DNA为模板合成双链DNA

逆转录酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在与

RNA病毒引起细胞恶性转化有关。

逆转录酶无校对功能，因此错误率较高，端粒酶就是一种逆转录酶。

逆转录酶的引物可以是寡DNA，也可以是RNA，但要有游离3’-OH末端。

§16.2DNA的修复

DNA的损伤修复：

一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。

然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。

紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷结构。

CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC），使复制、转录受阻。

细胞对DNA损伤的修复系统有五种：

A、错配修复；B、直接修复；C、切除修复

D、重组修复；E、易错修复。

错配修复

Dam甲基化酶可使DNA的GATC序列中腺嘌呤N6位甲基化,通过是否甲基化，识别“新”和“旧”链，需要DNA聚合酶Ⅲ和DNA连接酶。

Lynch综合症（遗传性疾病）----DNA错配修复缺陷造成。

直接修复

光复活是其一种方式，它分解紫外线引起的嘧啶二聚体，但哺乳动物没有。

切除修复

I、结构缺陷的修复；II、无嘌呤无嘧啶——碱基缺陷或错配

比较特殊的是靠DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶填补完缺。

着色性干皮病----缺乏切除修复。

重组修复：

遗传信息有缺损的子代DNA分子可通过遗传重组而加以弥补，即从同源DNA的母链上，将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处。

然后再用合成的序列来补上母链的空缺。

此修复发生在复制之后，又称为复制后修复，在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。

应急反应（SOS）和易错修复：

诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。

SOS主要包括两个方面：

增强DNA修复和抑制DNA聚合酶修复，使得DNA得以复制。

SOS反应是RecA蛋自和LexA蛋白相互作用引起的。

并导致易错修复。

RecA的活性有三种：

DNA重组活性、DNA单链结合、蛋白酶活性。

DNA的突变：

DNA的突变的类型包括：

A、碱基对的置换；B、移码突变

嵌入染料（EB等）造成移码突变。

人类癌症的发生是由于某些基因缺陷或变异所致。

这些基因包括原癌基因和抑癌基因。

§16.3DNA的重组

重组的三种类型：

同源重组

位点专一重组

转座（又称异常重组）

同源重组：

同源重组的形式

常发生在同源染色体之间（分子间重组），也可发生在同一DNA分子内（分子内重组）

Holliday模型：

说明同源重组的一个经典模型，基于重组过程中有十字形的中间产物。

同源重组的RecBCD重组途径：

存于E.coli中，需要RecBCD蛋白（RecBCDprotein，recB、recC、recD基因的产物）的参与。

位点专一重组：

噬菌体的整合与切除

噬菌体整合到宿主基因组需整合酶（Int，的int基因编码）及宿主蛋白IHF，并通过同源区域attP（）与attB（宿主）的重组而达成

噬菌体从宿主基因组切除需整合酶（Int）、Xis（的xis基因编码）及IHF，是整合的逆过程。

附着位点

attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15bp，称为O）；attP的必需序列从–152到+82（以O的中点为0），而attB只需25bp左右的序列（包括中间的O）

转座：

细菌转座子

插入序列（IS）：

最简单的转座子，只含有转座所必需的元件：

两端有反向重复序列（15～25bp），中间有编码转座所需的酶的基因（至少有2个，编码转座酶）。

插入序列在转座时，其插入位点两旁会产生一小段正向重复。

转座的机制

复制性转座：

转座过程有DNA复制，结果一个转座子留在原位，另一个插入到新的位点

保守性转座：

转座子离开原位置，插入到新的位点；这种转座又称非复制性转座。

转座：

玉米的Ds和Ac

Ac能自行转座，而Ds必须要有Ac的帮助才能转座。

Ac或Ds插入到功能基因中，就会使该基因失活。

反转录转座子

以RNA作为中介进行复制（转座），与反转录病毒的复制相似，含有编码反转录酶的基因，能进行反转录；酵母中的transposonyeast、果蝇中的copia等反转录转座子的两端有LTRs。