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双向电泳

双向电泳

报告题目

双向电泳

作者姓名

徐青龙

班级学号

2010114020121

指导教师

邵锦震

完成时间

2013年9月

生物学实验教学中心

目录

引言4

1实验材料5

1.1实验试剂制备5

1.2实验材料7

2实验方法7

2.1蛋白质样品的制备和纯化7

2.2双向电泳8

2.2.1第一向等电聚焦分离8

2.2.2第二向SDS-PAGE电泳8

2.3斑点检测9

2.3.1考马斯亮蓝染色9

2.4数据分析与结果处理10

3结果与分析10

3.1电泳结果分析10

3.2凝胶图像分析11

3.3ImageMaster2DPlatinum分析12

4总结与延伸14

4.1对电泳的结果进行染色方法的拓展14

4.2多种分析技术15

4.3结果标准化16

4.4蛋白点的后续分析17

4.4.1切点17

4.4.2蛋白的酶解17

4.4.3MALDI-ToF质谱17

致谢18

参考文献18

双向电泳

李雪收（指导老师：

邵锦震）

（湖北师范学院生命科学学院生物技术1004班湖北黄石435002）

摘要：

双向电泳（Two-dimensionalelectrophoresis）是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。

这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：

第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将蛋白质分离。

在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（Mr,相对分子量）大小将它们分离。

双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。

因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。

双向电泳在1975年由P.H.O'Farrel和J.Klose发明，在早先的技术中，第一向分离在含有载体两性电解质窄试管中灌注而成的凝胶中进行。

自从双向电泳技术产生以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认。

而由于各方面的改进在最近几年才广泛应用。

关键词：

双向电泳等点聚焦（IEF）SDS-PAGE蛋白质分析

双向电泳

李雪收（指导老师：

邵锦震）

（湖北师范学院生命科学学院生物技术1004班湖北黄石435002）

引言

双向电泳技术（two—dimensionalpolyaerylamidegelelectrophoresis，2D—PAGE）作为一种分离和检测复杂生物体系中蛋白质的方法由OFarrell等于1975年首先提出【1】。

2D—PAGE技术很大程度的提高了蛋白质分析的分辨率和精确度，将蛋白质组研究提高到一个新的水平，在蛋白质组学领域里得到了大量的应用，利用该技术可对一种样本中的许多蛋白质同时进行系统化的分离、鉴定、定量【2】。

双向电泳在这一领域中的应用也正是因为其同时分离数千种蛋白质的无与伦比的能力，同时，该技术还可检测翻译后和翻译过程中的蛋白质修饰，这是无法通过基因组序列分析进行预测的。

双向电泳技术的应用领域有蛋白质组分析、细胞鉴别、疾病标志物探测、治疗监测、新药发现、癌症研究、纯度检测、以及微量蛋白质纯化等【3】。

双向电泳的实验原理是根据不同的蛋白质具有不同的分子量和等电点的特点。

利用这一性质首先根据蛋白质等电点不同在pH梯度胶中等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF）将其分离；然后，按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS2PAGE）使其第二次分离。

第一向等电聚焦（IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同将它们分开的一种电泳技术。

蛋白质是两性分子；它们整个分子要么带有正电或负电，要么不带电，这依赖于环境的pH值。

整个蛋白质分子的带电量取决于组成蛋白质的氨基酸的侧链及碳端和氮端所有电荷总合。

等电点（isoelectricpoint,pI）是一个特定的pH值，此时整个蛋白质分子的净电荷为零。

蛋白质在环境pH值低于pI时带正电，而高于pI值时带负电。

pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。

在pH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所净电荷为零的点移动。

蛋白质若所带电荷为正，则它向负极移动，在它到达pI点位置之前在它们通过pH梯度时，其所带的正电荷会逐渐减弱。

带负电的蛋白质则要向正极移动，所带的负电荷会逐渐减少直至为零。

如果蛋白质偏离等电点，其立即带上电荷而返回等电点的位置。

这就是等电聚焦的聚焦效应，能将蛋白质在其等电点上浓缩及分离。

并根据所带电荷微小的差异，能将蛋白质分离【4】。

第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据多肽的分子量的大小将其分离的。

它是在含有十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行的。

由于在样品和凝胶中存在SDS，蛋白样品内部所带的电荷量可不用考虑。

SDS是一种阴离子去污剂，通过以每克蛋白样品1.4克的比例缠绕在多肽连上使多肽变性。

与SDS结合形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。

SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质－SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，使蛋白质自身的电荷产生屏蔽形成带有稳定的净负电荷的复合物。

当使用一种还原试剂如DTT，蛋白质在半胱氨酸侧链间形成的二硫键能被打断。

当蛋白质同时用SDS和还原剂进行处理，蛋白在凝胶中的分离主要由分子量来决定。

实际上，分子量的对数与SDS-多肽胶粒移动的相对距离之间存在着近似线性相关性。

（注意：

这种线性相关只对某些分子量范围的蛋白有效，这种分子量范围是由聚丙烯酰胺的浓度百分比来决定的。

）从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来测定蛋白质的相对分子质量【5】。

单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。

在SDS-PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带【6】。

1实验材料

1.1实验试剂制备

（1）.样品提取缓冲液（USB提取液,25ml）:

成分

尿素

13.5g

9.0mol/L

NP-40

2.5mL原液

10％（V/V）

两性电解质

pH3-10250µl

0.5%（V/V）

pH4-6250µl

0.5％（V/V）

pH6-8250µl

0.5％（V/V）

β-巯基乙醇

1.25mL原液

5％（V/V）

（2）样品覆盖液（2ml，制备时，取1ml样品提取液，加水至2ml）：

4.5mol/l尿素

5％NP-40

2.5％β-巯基乙醇

0.75%两性电解质（含0.25％pH3-10，0.25％pH4-6，0.25％pH6-8）

溴酚蓝（微量）

（3）丙烯酰胺储液（T=30%,C=2.7%,IEF-PAGE专用，50ml）：

将14g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，补足体积到50ml。

4℃保存备用。

（4）平衡缓冲液（SDS-PAGE电泳加样缓冲液，500ml）

10mmol/LTris-HCl，pH6.8

5%巯基乙醇（或200mmol/LDTT）

4%SDS

0.2%溴酚兰

20%甘油（或40%蔗糖）

（5）2%琼脂糖（100ml）：

　　　2.0g琼脂糖溶于25mlTris-Cl/SDS（pH6.8）（4×），加水稀释到100ml。

（6）IEF-PAGE电极液：

下槽液（10×）：

25mmol/lH3PO4溶液（1000ml）。

上槽液（10×）：

50mmol/lNaOH溶液（1000ml）。

（7）0.2%考马斯亮蓝R-250染色液（1000mL）：

500ml甲醇

400ml蒸馏水

100ml冰乙酸

2.0g考马斯亮蓝R-250

（8）脱色液:

5%甲醇

7%乙酸

88%H2O

（9）保存液：

取甘油30ml，加脱色液至300ml。

1.2实验材料

菠菜（Spinaciaoleracea）幼嫩的茎叶为材料。

2实验方法

2.1蛋白质样品的制备和纯化

TCA-丙酮沉淀法：

1.取菠菜（叶去叶脉）5g,置于研钵中，加入适量丙酮（含10%TCA）洗去色素。

并重复一次。

再加入丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇）洗去色素。

并重复一次。

2.将得到的沉淀回收，晾干后，取0.5g，加入USB提取液1ml，并35℃水浴。

3.取上液，15000rpm/min离心10min，保存上清，即所制备的蛋白样本。

2.2双向电泳

2.2.1第一向等电聚焦分离

（1）制备IEF胶条：

称取2.0g尿素，加入0.75ml双蒸水，0.75ml10%NP-40，37℃水浴至完全溶解，加入0.6ml30％IEF凝胶储液（28.38％Acr/1.62％Bis）和两性电解质（pH3-10:

50µl,pH4-6:

50µl,pH6-8:

50µl）混匀，加入10µl10%AP和3µlTEMED原液，充分混匀，灌制17cm长的管状胶。

（2）胶液聚合后，在DYY－Ⅲ27型圆盘电泳槽中插入管状IEF胶条，尼龙网封住IEF胶条玻管下口，加入下槽液，没过IEF胶条0.5-1cm，用注射器排尽玻管下口气泡。

（3）用微量进样器点样100µl左右，再加入20µl样品覆盖液。

每管加入2µl不含SDS的1%溴酚蓝溶液。

（4）加入上槽液，淹没胶条玻管上口，排除气泡，在25℃条件下按200V×15min，300V×20min，400V×30min，500V×30min，600V×16h进行等电聚焦电泳。

（5）取出玻管，吸去两端的溶液，用双蒸水清洗。

将注射器吸满蒸溜水，套上200µl的tip头，从玻管一端将胶条打出。

（6）将胶条置于小烧杯中，加入平衡液（含溴酚蓝）使之覆盖，然后放在37℃恒温震荡箱中震荡30分钟，以用于第二向SDS-PAGE电泳。

2.2.2第二向SDS-PAGE电泳

灌胶

（1）用棉花蘸洗涤剂反复擦洗玻璃板，用双蒸水漂洗，自然晾干；

（2）装好玻璃板，并将玻璃板置于通风橱中，使用水平仪保证玻璃板架的水平。

（3）配制12.5%的丙烯酰胺凝胶两块（85mL）

成分

体积（ml）

水

27.03

30%丙烯酰胺

35.45

1.5MTris（PH8.8）

0.63

10%SDS

0.85

10%过硫酸铵

0.425

TEMED

0.03

（4）将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留0.5cm～1cm的空间，用水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。

一般凝胶与上方液体分为三层后，表明凝胶已基本聚合。

（5）凝胶凝固后，保证胶面湿润，定时补充去离子水。

（6）在桌上先放置干的滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在滤纸上，吸干胶条上的平衡液。

（7）用电泳缓冲液冲洗胶条三遍，胶面朝外贴在玻璃外板上，用琼脂糖凝胶封口，保证胶条下方不要产生任何气泡。

（8）放置15分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

（9）在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。

将凝胶转移至电泳槽中。

（10）在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时恒流15mA/块胶，15min后改为30mA/块胶。

（11）待溴酚蓝指示剂达到距底部边缘0.5cm时停止电泳。

（12）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并在正极端切角以作记号。

将二维胶放入固定液进行固定。

2.3斑点检测

2.3.1考马斯亮蓝染色

考染试剂：

染色液（200mL）：

成分

质量/体积（g/mL）

0.1%考马斯亮蓝R250

0.2

1.0MTris（PH6.8）

0.62

50%乙醇

0.63

5%乙酸

100

纯水

10

90

脱色液（可直接使用纯水）

成分

体积（ml）

7.5%冰乙酸

75

10%过硫酸铵

50

水

875

染色步骤

（1）电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。

（2）置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。

 具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。

凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。

凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。

通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。

染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。

（3） 倒出染色液。

染色液可以回收重复使用至少2-3次。

（4）加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。

（5）置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。

期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。

 脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。

脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。

（6） 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。

2.4数据分析与结果处理

（1）用凝胶成像系统对所得的结果拍照保存。

（2）双向电泳图谱的分析：

双向电泳图谱的分析的一般过程为获取凝胶图像；调整和校准凝胶图像；检定和定量蛋白点；注释蛋白点和像素；匹配凝胶图像；分析、整合数据并报告结果。

该过程检验、分析蛋白质双向电泳结果，从而决定下一步的实验去向，应用软件为ImageMaster2DPlatinumversion5.0。

先将图片导入软件，凝胶图像选点，设置landmark，进行自动匹配，并分析数据。

3结果与分析

3.1电泳结果分析

1.在制备蛋白质样品步骤中可以加入变性剂和稳定剂，如EDTA通过螯合金属离子有效抑制蛋白酶的活性。

DTT二硫苏糖醇，作为还原剂，防止蛋白通过巯基氧化聚合，增加蛋白的可溶性。

并对提取的蛋白进行纯化，蛋白质纯化的目的在于去除样品蛋白中的盐、糖以及一些大分子杂质，杂质的存在严重影响双向电泳的结果。

采用丙酮沉淀法，加入3-4倍体积的-20℃保存的丙酮沉淀大于1小时。

沉淀结束后使用13200rpm转速离心10min，去上清，将EP管置于冰上晾干5min，后用水化液溶解。

并在提取的过程中保持低温。

在TCA-丙酮沉淀提取蛋白的方法中，最后离心获得的沉淀较丙酮沉淀难溶，可使用丙酮冲洗沉淀样品，以除去残余的室温放置5min，待样品蛋白中的丙酮挥发完毕，使用水化液溶解沉淀。

2.电泳分析

样品蛋白在裂解液、水化液中等含有尿素的溶解液中时，不得加热此种样品，避免尿素水解成乙氰酸盐，造成蛋白氨基甲酰化，导致pI值的偏移。

尿素储液存放时间过长，则可形成氰酸盐，从而发生蛋白质的甲酰化。

分装后的裂解液、水化液储存于-20℃，一旦取出溶解后不能再继续使用。

电极纸垫：

采用纸质滤纸片，剪成3mm宽，用去离子水润湿后再用滤纸吸出多余的水，保证滤纸片湿润而不是过于潮湿。

将湿润的滤纸片置于胶条与电极之间，可以减少盐分对等电聚焦的影响。

（如果采用此方法，等电聚焦的伏特小时数需延长10%）

SDS使蛋白变性并形成带负电荷的蛋白-SDS复合物。

DTT在胶条平衡中的目的是打断二硫键，使变性的非烷基化蛋白处于还原状态。

IAA通过烷基化反应，使蛋白质硫醇基团烷基化，在电泳过程中防止蛋白再氧化，封闭打断的二硫键的部位，使其不能相互连接。

在电泳过程中蛋白质的再氧化会产生拖尾或其他假象，同时可以使残留的DTT烷基化，从而防止点拖尾或其他银染假象。

3.2凝胶图像分析

图1：

双向电泳电泳图

3.3ImageMaster2DPlatinum分析

图2：

ImageMaster2DPlatinum相关性点分析

统计结果：

InformationonselectedSpots（Saliency≥7.0000）：

SpotID

X

Y

Area

Vol

%Vol

Saliency

12

1898

566

4.63081

92.918

0.288021

17.5475

13

1489

567

3.64157

33.125

0.102679

7.44112

14

1518

636

1.64157

12.3101

0.0381581

7.8809

15

1837

655

2.98924

24.0036

0.0744048

9.79321

16

655

660

2.07168

21.8077

0.0675983

7.93335

17

1668

676

2.5448

34.0779

0.105633

13.4785

18

1542

715

3.54121

54.7724

0.16978

6.71307

19

1451

733

9.11826

129.066

0.40007

8.30234

20

253

731

6.74551

127.355

0.394768

26.728

21

1504

748

15.5555

613.978

1.90317

50.6118

22

1753

731

2.24372

15.0825

0.0467518

6.63945

23

1553

738

9.19711

203.971

0.632256

19.8303

24

878

793

83.0966

8196.36

25.4066

146.596

25

749

761

21.319

1213.99

3.76306

38.7862

26

1010

784

53.0895

4334.66

13.4363

88.7887

27

1593

754

6.63798

95.2046

0.295109

15.9507

28

1323

753

3.25447

33.6868

0.10442

10.843

29

1433

756

3.48386

20.6795

0.064101

6.66754

30

1867

796

2.76702

28.3979

0.0880259

13.4797

31

1508

821

4.27956

68.9242

0.213647

8.44476

32

1466

823

4.65232

125.593

0.389306

32.585

34

1806

886

18.5448

920.429

2.85309

51.2679

35

1752

876

6.12902

115.577

0.358259

10.5573

36

1682

879

9.13977

214.982

0.666389

32.6987

37

1001

894

3.05376

18.4582

0.0572155

10.0048

38

1506

905

2.92473

25.8252

0.0800515

9.47507

39

1768

951

5.9068

162.573

0.503934

13.8048

40

1802

953

6.83153

211.248

0.654814

16.2535

41

269

956

5.362

102.186

0.31675

17.038

42

334

962

9.97131

179.815

0.55738

15.5136

43

482

973

9.94263

113.909

0.353089

7.87917

44

404

973

8.63081

159.458

0.494279

27.2431

45

1239

986

2.37275

11.6021

0.0359633

6.5698

46

1474

1016

12.8315

564.089

1.74853

68.9102

47

1542

1013

11.1971

236.698

0.733702

22.5011

48

1409

1021

3.82078

24.2353

0.075123

7.707

49

1008

1032

3.41218

31.2929

0.0969998

7.94514

50

626

1043

3.05376

51.9244

0.160952

16.3684

51

1049

1053

3.43368

45.7393

0.14178

21.8562

52

837

1054

3.6344

50.6731

0.157073

9.43077

53

356

1076

2.93189

24.4956

0.0759299

8.28236

54

418

1082

5.67024

189.858

0.588512

32.726

55

1503

1085

3.25447

35.592

0.110326

12.4773

56

527

1100

10.5161

591.122

1.83232

75.0258

57

1680

1111

19.8423

1098.17

3.40404

62.0424

58

1763

1100

8.53045

186.215

0.577217

24.5927

59

1549

1101

5.16845

63.9161

0.198123

12.689

60

1485

1101

3.03225

24.7537

0.07673

9.15732

61

731

1128

8.5878

465.332

1.44241

66.4737

62

1843

1123

5.40501

58.3774

0.180955

12.0423

63

940

1125

4.53046

52.2117

0.161843

10.1146

64

1027

1138

2.76702

16.1906

0.0501867

8.99046

65

232

1216

6.25805

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0.182977

15.6134

66

1983

1384

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67

1208

1408

10.6595

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68

905

1415

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69

1340

1439

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70

1024

1446

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1.13929

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71

1248

1446

8.70249

132.158

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72

1517

1493

12.0358