开展原位杂交技术可行性报告FISH.docx

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开展原位杂交技术可行性报告FISH

荧光原位杂交技术-FISH

可行性报告

******医院

FISH的发展前景……………………………………………..1

FISH的原理…………………………………………………..1

FISH的技术特点……………………………………………..1

开展FISH的重大意义……………………………………….2

FISH在临床中的应用及操作程序…………………….…….8

FISH项目给社会及医院带来的效益…………………….…11

公司简介……………………………………………….……..14

售后服务……………………………………………….……..15

开展荧光原位杂交（FISH）检测项目

一．FISH的发展前景

随着医疗水平的整体提高，“个体化诊断”、“分子诊断”和“靶向治疗”受到愈来愈多的重视。

以荧光原位杂交（FISH）为代表的分子细胞遗传学技术近十几年来已从基础医学研究广泛地转向临床医学检测领域。

由于技术本身操作简单，重复性好、具有较高的灵敏性及特异性，因此很适应于临床医学检测。

在美国，FISH探针已被FDA列为“特异性分析试剂”，不需批准即可用于临床医学检测。

FISH已成为一种常见检测手段，广泛地用于产前、产后遗传病诊断及血液肿瘤、实体瘤等方面的检测。

被FISH检测的样本种类较多，可以是羊水、绒毛、流产组织，也可以是外周血、骨髓、体液及各种肿瘤组织等。

在中国，近几年FISH已经得到了越来越广泛的应用，尤其在血液病诊断、产前诊断和实体肿瘤检测方面。

二．FISH的原理

原理：

以核酸碱基互补配对原则为基础所发展出来的检测技术,主要是利用DNA序列的互补性,通过荧光标记的DNA探针与预处理的待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下,对荧光信号进行辨别和计数，即可对细胞、组织样本中的染色体或基因异常进行检测和诊断

三.FISH的技术特点

FISH技术具有以下几个方面的优势：

●操作简单－拥有离心机、水浴锅等常规仪器即可完成实验

●所需人工少－整个流程中人工操作时间在2-4小时之间

●结果报告快－常规FISH项目中基因或者染色体检测通常24小时内得到结果

●结果直观－结果观察只需在荧光显微镜下判断信号的数目即可，无需人员特殊培训

四．开展FISH的重大意义

●鉴别诊断

●指导临床用药，指导临床用药方案选择，筛选靶向药物适用者。

●判断预后指标，疾病风险预测。

●辅助病理科病理分级

●监测治疗效果

●产前快速诊断

五：

FISH在临床当中的应用及操作流程

1：

在乳腺癌中的应用

1）检测项目：

HER-2/neu基因、17号染色体数目

在乳腺癌诊断和指导用药方面,FISH显示出极强的优势。

乳腺癌是严重危害妇女生命最常见的恶性肿瘤，寻找有效的治疗手段一直是肿瘤学研究的重要方向。

大约25-30%的乳腺癌有HER-2/neu基因扩增，一般来说，HER-2/neu扩增与乳腺癌预后差相关。

Herceptin是一种针对HER-2/neu异常扩增的靶向治疗药物，能特异性地抑制具有HER-2/neu癌基因扩增的癌细胞的生长，使病人预后大大改善。

HER-2/neu扩增是决定Herceptin使用的关键性指标，而检测HER-2/neu的金标准即为FISH。

目前临床中检测HER-2扩增情况主要是应用免疫组织化学方法和FISH方法。

免疫组化方法属于病理科常规检测项目，价格低廉，但是对于靶向药物治疗来说，蛋白水平的检测不能完全替代基因检测。

主要是在两个方面：

免疫组化结果评判需要人工主观判定，对于1＋、2+结果存在不明确的可能，

关于内参照，鉴于免疫组化技术本身特点，无法在一次实验中，同一样本上进行两个指标的检测，此种检测可能会因为17号染色体的非整倍现象而导致错误的结果。

FISH优势：

1.FISH结果判定是在荧光显微镜下观察荧光信号数目，不存在主观原因，

2.FISH可以同时检测17号染色体数目，避免由于17号染色体发生异常而导致的错误结果判定。

目前比较公认的HER-2基因检测是按照以下流程进行：

下图是标准结果图，红色信号代表HER-2基因，绿色信号用于检测17号染色体数目，当红色和绿色信号数目比值大于2.2时即可判定为HER-2基因异常扩增。

2）乳腺癌患者TOP2A基因的检测：

●TOP2A基因异常的乳腺癌患者对于含蒽环类药物的治疗方案更为敏感：

临床研究的试验表明,如果患者存在TOP2A基因异常，相对于使用CMF方案来说，使用CEF方案的病人拥有更长的无复发生存期（RFS）及总生存期（OS）。

TOP2A基因异常的病人可以明显受益于含有拓扑异构酶抑制剂的辅助化疗方案。

TOP2A扩增的病人使用CEF方案进行治疗可以降低61%的复发风险和51%的死亡风险，而没有TOP2A扩增的患者使用CEF方案只能降低6%的复发风险和10%的死亡风险。

●存在TOP2A基因异常的乳腺癌患者预后更差：

对于乳腺癌的研究表明，TOP2A在乳腺癌组织的表达水平与其预后指标存在一定的联系，TOP2A基因异常的病人预示着更短的无复发生存期（recurrence-freesurvival，RFS）但总生存期（OS）并无改变；并且TOP2A缺失的病人预后更差

2：

FISH在宫颈癌中的应用

检测项目：

TERC基因

宫颈癌是全球35岁以下妇女第2位最常见的肿瘤，也是妇女生殖系统最常见的肿瘤，严重地危害妇女身体健康。

在我国，每年约有新发宫颈癌病人10万，死亡人数3-5万。

早期诊断是治疗宫颈癌及提高患者预后的有效手段。

国际上通用的筛查宫颈癌的方法一般为宫颈细胞涂片形态检查及HPV病毒检测。

细胞涂片检查敏感性一般在55％－80%左右，但一旦观察到异常细胞，特异性可达到90%以上。

HPV检测虽敏感性高，在84%－100%之间，但特异性一般只在64%－95%之间，因为许多HPV阳性的病人在一年之内可转阴，并不会导致宫颈癌的发生。

鉴于以上的问题，从宫颈癌筛查及早期诊断角度出发，迫切需要其它可靠指标或手段来协助以上检查，使筛查更准确、可靠及更有预见性。

由美国NIH直接领导的针对宫颈癌的研究表明，宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增。

其中，涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶（hTERC）基因。

该基因的扩增可阻止细胞凋亡，因而可导致肿瘤产生。

TERC基因检测意义：

●准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，即区分CIN2和CIN3与正常、ASCUS,及CIN1的灵敏度和特异性超过90%

●预测CIN1/CIN2向CIN3发展的风险因素，其灵敏度是100%，特异性是70%

●对hTERC基因扩增的检测极有助于宫颈癌的筛查及早期诊断。

而检测这一基因扩增的标准方法即为FISH技术。

3：

FISH在膀胱癌检测中的应用

检测项目：

p16基因、3、7、17号染色体数目

膀胱肿瘤是泌尿系统中发病率最高的肿瘤，约占中国所有恶性肿瘤发病的20%左右。

膀胱癌多发于男性别，男女发病的比例约为3∶1。

膀胱癌的发病年龄多在50岁以上且随年龄增大而发病率增加，近三分之二的膀胱癌病患是65岁以上的老人。

膀胱癌在初被诊断时大多局限于膀胱，但约有6%病人已有远处转移。

各临床分期的膀胱癌，包括早期疾病，治疗后复发率都非常高。

复发后的膀胱癌生物学行为和原发疾病显著不同，往往向更高的临床分期和病理分化级别发展。

为此针对膀胱癌的早期诊断和术后监测成为疾病治疗中关键的一个部分。

目前FDA已经批准以上几个检测指标可以用于膀胱癌的检测和监测。

应用FISH检测膀胱癌主要是针对以下四个指标，p16基因和3、7、17号染色体数目。

遗传学改变中9号染色体部分（如p16位点）或全部丢失是最常见遗传学异常之一，这一异常与膀胱癌的早期发生密切相关。

此外，膀胱癌的发展与染色体不稳定性如3号、7号及17号染色体的非整倍性也紧密相连。

在检测中如以上四个指标中有一个异常，则高度怀疑病人患有膀胱癌；如两个或两个以上指标异常则可以确诊膀胱癌；如一个指标出现了复杂的异常，也可判断为膀胱癌患者。

与传统膀胱癌检测和术后监测方法相比，FISH使用的样本为尿液，避免了由于侵入性取材给患者造成心理和生理的刺激。

更容易被患者接受。

FISH检测主要特点是：

无创性早期诊断

1｝结合膀胱镜检查监视膀胱癌复发

2｝检测与膀胱癌进展与分级相关的染色体异常

3｝不受BCG免疫治疗影响

与现有的诊断方法相比，能在分子水平最先发现复发

。

4：

FISH在产前检测中的应用

检测项目：

13、18、21、X、Y染色体数目

遗传病中，很大的一部份是由于染色体异常而引起的，目前，发现的种类已经超过1000多种。

例如Down综合症，绝大部份就是由于21号染色体异常，呈现出三倍体的深色体组型而引起的，患者常具有严重的病症，如发育迟缓、智力低下等，此外13号染色体的三倍体的患者也出现严重的病症，如智力严重缺陷且伴有兔唇的表征。

据统计，各种染色体疾病在人群中的爆发率相当高，在新生儿中，发病率就高达7.3‰，其中某些染色体异常，如18号染色体三倍体所引发的Edward综合症在人群中的爆发率甚至高达1/2000。

在现在普遍晚婚、晚育的社会形势下，以上染色体发病率则更高。

因此，对胎儿进行产前检测以及时发现异常胎儿，并辨明胎儿所患染色体疾病的种类，从而采取相应的措施的必要性越来越为人们所重视。

研究表明，发生于13、18、21、X和Y染色体上的异常从而引起的疾病占新生儿染色体疾病的85%-90%。

即只需通过对上述五条染色体进行分析，就可以对目前胎儿常见的唐氏综合症（21三体）、18号染色体三体综合症、13号染色体三体综合症、Klinefelter（47，XXY）综合症、Turner（45，X）综合症、三X染色体（47，XXX）综合症、XYY（47，XYY）综合症等进行检测。

传统的产前诊断，以采用羊水细胞样品，先进行细胞培养后，根据羊水中期细胞染色体的形状和带型，将染色体进行配对，制成染色体图谱，以此对染色体疾病进行诊断。

核型分析所需的中期细胞量大，需先对获得的羊水进行细胞培养，并在取样培养的7天左右方可进行样品化验，此种检测方法耗时长、操作烦琐，对医务人员要求高，无法在各级医院广泛开展。

此外，核型分析仅能诊断染色体数目和大片断的异常，对小片断的缺失，如少于5Mb的区段缺失仍无法分辨出来。

荧光原位杂交技术作为准确而快捷的分子诊断工具，在产前诊断领域的优势非常明显：

1｝对被测细胞并无特殊的要求，分裂期或间期细胞均可进行检测

2｝无需细胞培养，可以做到即取即测

3｝24小时即可出诊断报告，可及时为医生、受检者提供参考数据

4｝操作简便，利用不同颜色的荧光探针可在同一样本中同时检测多种染色体的异常

5：

FISH在血液肿瘤中的应用

●慢性淋巴细胞性白血病（慢淋）

检测项目：

RB1、P53、ATM、D13S25、CSP12

慢淋是欧美白种人中最常见的白血病，在中国，慢淋也变得越来越多见。

临床上，有的慢淋病人只能存活几个月，而有的病人则能生存超过20年。

长期以来，人们对慢淋的认识一直停留在临床观察上。

近几年，随着基因组医学的发展，对慢淋发生及发展的了解有了更进一步的认识。

尤为重要的是，利用分子细胞遗传学技术，人们对慢淋病人的预后判断也变得更为科学及准确。

现已知，几个遗传学指标比现已存在的任何其它指标能更准确地预测慢淋病人的预后，如：

p53基因丢失（平均生存32个月），ATM基因缺失（平均生存79个月），12号染色体三体（平均生存114个月）及13q14缺失（平均生存133个月）等，而检测这些指标的标准方法即是FISH技术。

无疑，这些慢淋遗传学研究的发现对临床个体化治疗提供了极有意义的理论依据及指导。

●多发性骨髓瘤

检测项目：

RB1、P53、1q21、D13S319、IGH

多发性骨髓瘤也为一常见血液肿瘤，临床上，病人预后总的来说不好，迫切需要新的治疗方法出台。

目前，国际血液界治疗多发性骨髓瘤一般先根据不同的临床及实验室指标评估病人的预后风险，然后制定相应的方案治疗病人。

因而，探索准确的预后风险评估指标至关重要。

目前，公认的较可靠的指标有β2—微球蛋白、C—反应蛋白、骨髓浆细胞形态，浆细胞增殖率，及分子细胞遗传学改变等，而其中以分子细胞遗传学指标最为重要。

现已知，多发性骨髓瘤病人在接受常规化疗后平均能生存24.7个月［若有t（4；14）和/或t（14；16）易位或p53基因缺失］，42.3个月（若有13q14缺失）或50.5个月［仅有t（11；14）易位或没有任何以上遗传学改变］。

而检测这些遗传学改变的标准方法为FISH技术。

●慢性粒细胞性白血病

检测项目：

费城染色体检测（BCR/ABL）

慢性髓性白血病（慢粒）为白细胞增加和脾肿大，其发病率为0.5人/10万，30~40岁的人居多，男性发病率较女性稍高。

性粒细胞性白血病（CML）患者90%以上具有典型的Ph染色体，即染色体t（9;22）（q34;q11）易位，形成BCR/ABL融合基因。

10%以内的患者具有变异型、复杂型或隐匿型Ph易位。

BCR/ABL融合基因编码的蛋白具有酪氨酸激酶活性，导致细胞恶性增殖。

Ph染色体或BCR/ABL阳性已经成为CML的主要诊断标准。

针对BCR/ABL融合蛋白已经发展出有特效的治疗药物STI571（格列卫）。

多数患者可在半年内达到细胞遗传学缓解。

应用常规核型分析检测方法可以检测该异常，但核型分析存在以下几个问题，

●分辩率有限，一般检测5MB大小片断的异常

●可以记数的染色体分裂相有限，对于异常细胞含量少的样本检测比较困难

●需要细胞培养，耗时长

●对于临床中应用的PCR方法，其灵敏度很高，但也存在以下的问题，

由于其存在基因扩增，对于微小残留样本等一些特殊样本，无法准确判断异常细胞百分比，对于后期治疗用药指导性存在误差

FISH在这一领域有着完美的表现：

●FISH可以检测100kb左右的异常，远远高于核型分析的分辩率

●由于是原位杂交，可以直接体现异常细胞百分比，对于临床后期治疗有着很强的指导作用

耗时短（24小时出结果），操作简单

目前FISH检测费城染色可以应用于以下几个方面，

✓疾病确诊

✓指导临床用药

✓治疗效果监测

✓移植效果监测

✓微小残留检测

6：

性染色体错配骨髓移植

检测项目：

X、Y染色体

性染色错配的骨髓移植效果监测，除了常规检测方法，对于性染色体细胞比例监测也是非常重要的一个环节。

由于FISH方法需要样本量少、检测快速，在这一领域有着重要的应用。

目前很多骨髓移植医院采用FISH对错配移植进行检测，应用最为广泛的有北京道培医院、苏州血液研究所、广州南方医院等大型医院。

7：

在非小细胞肺癌当中的应用

非小细胞肺癌检测（EGFR）

EGFR拷贝数的增加约占非小细胞肺癌的30％～40％

●EGFR基因扩增的患者，应用gefitinib的有效率为35%,疾病控制率高达70%；而拷贝数不增加的患者用药的有效率仅为9.8％

●检测EGFR基因是否扩增可以有效指导吉非替尼（易瑞沙）的使用。

实验操作

应用荧光原位杂交技术对不同样本进行检测时，主要的操作流程是一致的，包括以下几个步骤：

六：

社会效益.医院效益.

1.价格体系

FISH检测项目主要成本在于探针，以下为每人份检测探针价格列表，

检测项目

探针名称

每人份单价（元）

产前染色体数目异常检测试剂盒

GLP13/GLP21

CSP18/CSPX/CSPY

DiGeorge/VCFS综合症检测试剂盒

GLPTUPLE1/GLPARSA

多发性骨髓瘤检测试剂盒

GLPRB1

GLPP53

GLPD13S319

GLPIGH

GLP1q21

慢性淋巴细胞性白血病检测试剂盒

CSP12

GLPD13S25

GLPATM

GLPRB1

GLPP53

乳腺癌检测试剂盒

GLPHER-2/CSP17

子宫颈细胞检测试剂盒

GLPTERC/CSP3

膀胱癌检测试剂盒

CSP3/CSP7

GLPp16/CSP17

性染色体检测试剂盒

CSPX/CSPY

费城染色体检测试剂

GLPBCR/GLPABL

注：

以上单价按照20人份探针报价计算

2.

收费标准

2007年6月中国卫生部在《医疗机构临床检验项目目录》中第1801项中明确了“荧光原位杂交”可以应用于临床检测，网址：

。

各级医院可以根据实际情况开展FISH项目。

基于此，很多城市开始进行临床收费，以上海为例，FISH检测1200元/次，多色FISH检测2400元/例。

总体来说，收费标准主要分为两个级别，单次FISH实验800-1500元，多色FISH检测2000-3000元。

3.院方效益

鉴于FISH项目主要成本为探针，所以按照已有收费标准，以｛乳腺癌检测试剂盒为例｝山东省物价2500元/每人。

计算以下内容

检测项目

探针成本/例

（元）

利润空间

（元）

手术数量/去年/最低预估检测数量

盈利（元）

GLP13/GLP21

843.5

1156.5-2156.5

DiGeorge/VCFS综合症检测试剂盒

309

491－1191

多发性骨髓瘤单个探针

427.5*

372.5－1072.5

慢性淋巴细胞性白血病单个探针

422*

378－1078

乳腺癌检测试剂盒

1069

931－1531

子宫颈细胞检测试剂盒

356.5

443.5－1143.5

膀胱癌检测试剂盒

1021.5

978.5－1978.5

性染色体检测试剂盒

522.5

277.5－977.5

费城染色体检测试剂

438.5

361.5－1061.5

合计

注：

*表示多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病按照组合中价格最高探针计算

4.经济效益及社会效益

经济效益:

该平台的建立可以加速开展先进的检测项目,如荧光原位杂交、免疫荧光等多种涉及荧光信号结果的检测方法。

先进检测方法的引进可以提高医院临床检测水平，提供更先进、更准确的检测方法，为制定个体化诊断和治疗提供可靠依据，提高诊断准确率、明确靶向治疗方案，减少医患纠纷。

同时先进的检测项目可以吸引更多患者就医，减少病源外流，合理增加医院相关诊断、治疗收入。

此外也能够加强医院科室科研能力，为科研教学提供先进的技术平台。

社会效益：

新检测项目和更为全面的项目开展，能够为患者提供更多的疾病检测方法，有效及时的进行疾病的确诊，监测治疗效果，避免病情的延误，减少反复检测带来的经济负担，更好的为广大患者服务