微生物实验芽孢观察.docx

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微生物实验芽孢观察

微生物实验报告

细菌的芽孢染色观察实验

刘欣怡2

生命科学基地班

组别：

周一下午三组

同组者：

曹平平，周楠，

刘艺，刘希伟

实验时间：

2012年10月22号

一、实验目的

1、学习并掌握芽孢染色法

2、了解芽孢杆菌的形态特征

3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术

二、实验器材

1、菌种

枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。

2、溶液和试剂

5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。

3、仪器和其他用品

酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。

三、实验原理

1、芽孢又叫内生孢子（endosopre），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。

细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

2、芽孢菌体的特点：

a.芽孢的含水率低，38%～40%。

　b.芽孢壁厚而致密，分三层：

外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。

中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。

内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。

芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。

　c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。

吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。

在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。

芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。

　　d.含有耐热性酶。

　　芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。

细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。

3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。

芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

4、芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节。

芽孢可作为培养基灭菌彻底与否的检验依据、在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。

5、产生芽孢的几个属：

芽孢杆菌属（Bacillus）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、芽孢八叠球菌属（Sporosarcina），

四、实验内容

根据实验提供的两种细菌，即枯草芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌，然选一种或者两者都选，进行制片，进而染色观察细菌芽孢的形态特征。

若选择两种菌，可以再制作在同一个载玻片上。

五、实验步骤

1、涂片

取一块洗净并自然晾干的载玻片，分别滴两小滴蒸馏水于载玻片靠近中央处；用接种环无菌操作，先将接种环在酒精灯上烧2遍，从酒精灯旁用稍冷却的接种环从枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面或梭状芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面挑取适量菌苔（接触一或两下），在载玻片上的两滴蒸馏水中分别涂抹（接触三到四下），使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜或观察到小水滴有些浑浊。

记录两者相对位置，不要弄混。

并且还要记清载玻片真反面，可以做标记。

2、干燥固定

可以有酒精灯进行加热干燥，用夹子夹住载玻片在火焰上过1到2遍就放到手背上试一下玻片温度，一不烫手为原则，一直重复操作直至液滴完全干燥固定。

3、染色

向干燥固定好的片子上加数滴孔雀绿染液，使菌完全被覆盖，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热（可以在酒精灯上过几下，稍停一下再在酒精灯上过几下根据染液冒蒸汽的实际情况自行判断做法）至染料稍冒蒸汽并开始计时，维持5min。

加热过程中及时补充染液。

切勿让涂片干涸。

4、冷却后水洗

染色结束后，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。

5、复染

水洗好后，用番红水覆盖菌，染色2min。

6、水洗干燥

复染结束后，用缓流水洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。

然后自然风干。

7、镜检

将制好的玻片放在显微镜下，先低倍镜，再高倍镜，最后滴加香柏油用油镜观察芽孢形态，并记录。

8、实验结束

实验结束后，整理实验台，仪器归位，电器拔下电源，擦净染液。

六、实验结果及记录照片

1、芽孢染色观察结果：

显微镜视野中，芽孢呈现绿色，菌体呈现淡淡的红色或者无色透明（番红水复染不成功），亦或者视野中仅有几个番红水复染上了红色的菌。

枯草芽孢杆菌芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或末端，菌体基本无大变化；梭状芽孢杆菌芽胞呈圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。

综合来看，视野中，能看到有的菌中间有较亮且染为绿色的部分，即为芽孢。

有的芽孢在菌的中间出现，即中生芽孢；有的芽孢在菌的末端出现，即端生芽孢；有的芽孢向外膨胀；有的芽孢不向外膨胀；有的芽孢游离在菌体之外，估计是操作中动作较大使得芽孢脱落下来。

2、芽孢染色观察记录图：

该图为梭状芽孢杆菌的观察视野。

从图中可以看到第一次孔雀绿染色较好，但是水洗脱色以及复染色有点失败，大部分菌体没能染上红色，菌体大部分是绿色或无色。

该图中能看到几个染色较好的细菌，菌体为红色，内含绿色的芽孢，为中生芽孢。

该图为枯草芽孢杆菌的观察视野。

图中可以看到染色较好的绿色芽孢，但是菌体近乎都为无色的，说明水洗脱色较好但是复染色不成功。

对于菌体没能复染上红色，有两大可能原因：

一是番红水浓度低，二是染色时间不够。

3、全班内搜寻好的实验玻片，进一步观察芽孢的形态特征

本实验图片从其他组获得，观察视野中可以看到一些复染色较好、呈紫红色的菌体，当然还有一些菌体是绿色或者无色；芽孢染色较好，被染成了绿色，但是游离的芽孢很多，估计有较为严重的不当操作致使很多芽孢从菌体中脱落下来。

4、资料查找图：

与自己的实验结果进行对比，更进一步了解芽孢形态特征。

中生芽孢

端生芽孢

游离芽孢

七、实验结果分析

1、本实验的观察结果：

能较为清楚地观察到芽孢的存在，而且能观察到不同的芽孢着生方式。

观察到不少的芽孢游离在菌体之外，估计和自己的操作有较大关系，分析此现象发生的原因可能有如下三种：

a.由于芽孢较厚，耐压力细胞体强，可能由于在图片时用力过大，将细胞体的细胞壁压碎从而使的芽孢脱落出来；b.可能是由于菌体培养时间过久，芽孢正处于复苏阶段，所以大多数芽孢都从菌体中游离出来；c.可能在干燥固定和染色两个步骤中，加热的温度太高使得芽孢从菌体中裂出。

芽孢染色较好，均为绿色或浅绿色，但是外面的菌体基本上没染上番红水的红色，但是外面的菌体水洗脱色不错，在观察视野中成无色透明状。

没能复染上番红水的红色的原因可能有：

番红水是番红染液的稀释液，浓度小不易使菌体染上色；番红水复染的时间较短，不足老师要求的2min；水洗后直接进行复染，或略了载玻片上的残余水，没有先用番红水冲载玻片而是直接覆盖，使得染液浓度又降低。

2、绿色芽孢及红色菌体的观察现象分析：

由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用番红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圈。

但是用着色力强的染色剂孔雀绿，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经染色便难以被水洗脱。

当用对比度大的复染色剂番红染色后，芽孢仍保留初染剂孔雀绿的绿色，而菌体和芽孢囊被染成复染色剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

3、要保证本实验获得成功，必须要注意以下几点

a.选用适当菌龄的菌种，幼龄的尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已破裂。

b.加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，如热不够则难以着色。

c.脱色必须等玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。

八、实验注意事项

1、加热时使用载玻片夹子或试管夹，以免烫伤。

2、使用染料时一定要注意避免沾到衣物上。

3、载玻片一定要洗净，自然晾干。

4、向载玻片上滴加两滴蒸馏水时一定要注意水滴要小。

5、载玻片未干燥固定前，注意水平放置玻片，以防载玻片上的两滴水滴混合以至于制片失败。

6、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。

7、制片的干燥固定操作中，注意加热程度及载玻片温度，以免加热温度太高使得菌和芽孢裂开。

8、孔雀绿染色计时是从加热覆盖了染液的载玻片、看到有蒸汽冒出开始的。

9、孔雀绿染液染色过程中，需加热，但是不要一直放在酒精灯火焰上加热，以防载玻片加热断裂，可以在火焰上多过几下后移开稍稍冷却。

10、孔雀绿染液染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

11、补充染液，需要先将载玻片从酒精灯火焰上移开，等待稍稍冷却后再向载玻片上滴加孔雀绿染液，以防冷的染液遇到热的载玻片使得载玻片断裂。

12、本次实验中，水洗均冲洗载玻片无菌面。

13、实验中，图片时要动作轻缓，以防因动作太大而使得芽孢从菌体上脱落下来。

14、孔雀绿染液染色过程中，要注意不能持久加热，会使得载玻片温度很高，温度很高容易使得芽孢和菌体裂开。

15、孔雀绿染液加热染色后，需要将载玻片冷却一小段时间后再水洗，以防热的载玻片突然遇到冷的水流发生断裂。

16、注意两次染色的时间。

17、番红水复染并水洗干净后，一定要自然晾干载玻片。

18、镜检时，先低倍镜，再高倍镜，最后滴加香柏油换为油镜。

19、实验后洗干净手再离开。

九、实验思考题

1、用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?

说明原因。

答：

不能。

细菌的芽孢具有厚而致密的壁。

透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。

2、为什么芽孢染色需要进行加热？

答：

芽孢壁厚，透性低，不易着色。

加热条件下染色，染料可以进入菌体内，也可以进入芽孢。

3、用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等载玻片冷却后再用水冲洗？

答：

若玻片不冷却就直接冲洗，会因为突然遇冷而炸裂。

4、细菌芽孢用孔雀绿染色并加热时，为什么不能蒸干染液？

答：

加热染色都不能把染料蒸干,染料被蒸干后积聚在玻片以及菌体上,干扰光线穿透影响镜下观察菌体结构情况。

5、若在视野中多看到游离的芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。

答：

a.由于芽孢较厚，耐压力细胞体强，可能由于在图片时用力过大，将细胞体的细胞壁压碎从而使的芽孢脱落出来。

b.可能是由于菌体培养时间过久，芽孢正处于复苏阶段，所以大多数芽孢都从菌体中游离出来。

c.可能在干燥固定和染色两个步骤中，加热的温度太高使得芽孢从菌体中裂出。

6、本实验为什么应选用适当菌龄的菌种？

答：

幼龄菌种尚未形成芽胞，而老龄菌芽胞囊已破裂。

十、实验小结

总体来看本次试验还是比较顺利的。

本次试验的不足之处是芽孢染色效果很好，但是菌体染色效果不是很好，偶尔有几个菌体被染上了红色或者淡红色，大部分都是透明的。

自我分析菌体没能复染上番红水的红色的原因可能有：

a.番红水是番红染液的稀释液，浓度小不易使菌体染上色；

b.番红水复染的时间较短，不足老师要求的2min；

c.水洗后直接进行复染，或略了载玻片上的残余水，没有先用番红水冲载玻片而是直接覆盖，使得染液浓度又降低。

除去这点不足，在本次芽孢染色实验，我学会了很多。

首先，我学会了是芽孢染色方法；其次，我对芽孢有了一个较为系统的认识，我认识到了多种形态的芽孢和并了解了芽孢对于细菌的重要性，我明白了芽孢不仅仅是生物的休眠体，芽孢的各种特性还是进行生物物种鉴定和分析的重要依据。

通过本次试验，我还对细菌的芽孢的描述方法有了一定的了解。

我相信本次实验会对以后的学习和研究等方面大有帮助。

在以后的微生物实验中，我要着重熟练操作，并且对比相似的操作，比如各种染色操作，提高自己的实验技能，为以后打下坚固的实验基础。

十一、参考文献

沈萍陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社