41 生鲜肉中三聚氰胺的测定 DB21T 1687.docx

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41生鲜肉中三聚氰胺的测定DB21T1687

辽宁省质量技术监督局　发布

2008-12-01实施

2008-11-19发布

生鲜肉中三聚氰胺的测定

DeterminationofMelamineinFreshMeats

DB21/T1687—2008

DB21

辽宁省地方标准

ICS65.120

B46

备案号：

1前言

本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出并归口。

本标准由辽宁省质量技术监督局发布。

本标准附录A为资料性附录。

本标准负责起草单位：

农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）。

本标准起草人：

王淑芬张建勋刘全刘敬先刘凯杨希国于家丰王丽娜田晓玲曲韵坤。

本标准首次发布。

生鲜肉中三聚氰胺的测定

11　范围

本标准规定了生鲜肉中三聚氰胺残留检测的制样和酶联免疫（ELISA）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）测定方法。

本标准适用于生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中三聚氰胺残留检测。

本标准中的酶联免疫法为筛选方法，筛选结果为阳性的样品需要用仲裁法确证，高效液相色谱法和气相色谱-质谱法为定量方法，其中气相色谱-质谱法为仲裁法。

酶联免疫法定量限为0.20mg/kg，高效液相色谱法定量限为0.20mg/kg，气相色谱-质谱法定量限为0.10mg/kg。

12　规范性引用文件

下列文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法

13　制样

13.1　试样的制备

从原始样品中分取出约500g，经绞肉机绞碎、匀质使均匀。

13.2　试样的保存

-20℃以下贮存。

14　酶联免疫法

14.1　原理

本方法基于酶联免疫法中的竞争性测定法原理，通过样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，除去未结合的三聚氰胺酶标记物后，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质，加终止液后在450nm下读取各微孔吸光度值。

吸光度值与样品中的三聚氰胺含量成反比。

14.2　试剂和溶液

14.2.1　除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。

水应符合GB/T6682二级水的规定。

14.2.2　三聚氰胺试剂盒（附系列标准品溶液，酶标记物，清洗液、底物，终止液，说明书）。

14.2.3　异辛烷（C8H18）

14.2.4　三氯甲烷（CHCl3）

14.2.5　异辛烷+三氯甲烷混合液：

准确量取40ml异辛烷（4.2.3）和60ml三氯甲烷（4.2.4）,混匀即得。

14.2.6　10%甲醇/20mMPBS：

称取0.62gNaH2PO4·H2O，5.73gNa2HPO4·12H2O和9gNaCl用蒸馏水溶解，并定容至1000mL，取此溶液900mL，加入100mL甲醇混匀即得。

14.3　仪器和设备

14.3.1　酶标仪（带450nm滤光片）。

14.3.2　涡旋混合器。

14.3.3　冷冻离心机。

14.3.4　微量加样器：

20µL、50µL、100µL、150µL、250µL。

14.3.5　恒温干燥箱。

14.3.6　分析天平：

感量0.01g。

14.3.7　振荡器

4.3.8绞肉机

4.3.9匀浆机

14.4　测定步骤

14.4.1　样品处理

准确称量2g试料（3.1）精确到0.01g，加入10mL10%甲醇/20mMPBS（4.2.6），涡旋30s，振荡5min，4000r/min离心5min，取2mL上清液加入2mL异辛烷+三氯甲烷混合液（4.2.5），混匀，4000r/min离心5min，静置，取上层150µL待测。

14.4.2　测试程序

取出欲测数量的微孔条安插在酶标板上，分别吸取0µg/L、20µg/L、100µg/L、250µg/L、500µg/L标准溶液（4.2.2）和试样萃取液（4.4.1）各150µL至包被有三聚氰胺抗体的对应微孔中，分别加入50µL三聚氰胺酶标记物溶液，振荡使混匀，25℃左右孵育30min。

倾尽酶标板，清洗液（4.2.2）洗板4次，拍干。

加100µL底物（4.2.2）至每个微孔中，振荡使混匀，25℃左右孵育30min。

加100µL终止液（4.2.2）至每个微孔中，振荡混匀，450nm下读取各微孔吸光度值。

注：

不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差异，比如稀释倍数，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。

试剂盒使用前恢复到室温。

标准和样品做平行试验以增加准确性。

14.5　结果计算

以空白溶液（浓度为0的标准溶液）的吸光度值为100%作为计算基准，折算出各标准溶液和试样萃取液的相对吸光度值。

………

（1）

相对吸光度值（%）=

绘制标准相对吸光度值与浓度（µg/L）关系曲线，校正曲线在20µg/L-500µg/L范围内为线性。

试样萃取液的浓度（µg/L）可以从校正曲线上读出。

15　高效液相色谱法

15.1　原理

试料中的三聚氰胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，混合型阳离子交换固相萃取小柱净化，高效液相色谱仪测定，外标法定量。

15.2　试剂和材料

除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。

除色谱用水应符合GB/T6682一级水的规定外，水应符合GB/T6682二级水的规定。

15.2.1　三聚氰胺对照品：

含三聚氰胺（C3H6N6）不得少于95.0%。

15.2.2　三氯甲烷（CHCl3）。

15.2.3　乙腈（CH3CN）：

色谱纯。

15.2.4　甲醇（CH3OH）:

色谱纯。

15.2.5　庚烷磺酸钠（C7H15SO3Na）。

15.2.6　柠檬酸（C6H8O7•H2O）。

15.2.7　氨水（NH3•H2O）。

15.2.8　氮气（N2）：

普通氮气。

15.2.9　0.122mol/L三氯乙酸溶液：

准确称取三氯乙酸20g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。

15.2.10　0.058mol/L乙酸铅溶液：

准确称取乙酸铅22g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。

15.2.11　80%甲醇溶液：

准确量取80mL甲醇（5.2.4）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。

15.2.12　5%氨化甲醇溶液：

准确量取5mL氨水（5.2.7）于100mL容量瓶中，用甲醇（5.2.4）定容至刻度，现用现制。

15.2.13　离子对缓冲溶液：

称取2.02g庚烷磺酸钠（5.2.5）和2.10柠檬酸（5.2.6）于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

15.2.14　三聚氰胺标准储备液：

精确称取约50mg三聚氰胺标准品（5.2.1），精确到0.0001g，置50mL棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液（5.2.11）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。

15.2.15　三聚氰胺标准中间液：

用移液管准确吸取5.00mL标准贮备液（5.2.14）于50mL棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液（5.2.11）定容至刻度，配成浓度为100μg/mL的标准中间液。

15.2.16　三聚氰胺标准工作液：

分别准确吸取0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL的标准中间液（5.2.15）于100mL容量瓶中，用80%甲醇溶液（5.2.11）定容至刻度，配制浓度为0.50、1.00、2.50、5.00、10.00μg/mL的标准工作液。

15.3　仪器和设备

15.3.1　高效液相色谱仪（配紫外检测器）。

15.3.2　色谱柱：

SB-C18或SB-C8柱。

15.3.3　分析天平：

感量0.0001g。

15.3.4　天平：

感量0.01g。

15.3.5　组织匀浆机。

15.3.6　匀浆杯：

30mL。

15.3.7　离心机

15.3.8　离心管：

50mL。

15.3.9　混合型阳离子交换固相萃取柱：

60mg/3mL。

15.3.10　固相萃取装置。

15.3.11　氮气吹干仪。

15.3.12　涡旋混合器。

15.3.13　振荡器。

15.3.14　微孔滤膜：

0.45μm。

15.4　测定

15.4.1　提取

取（2±0.05）g试料（3.1），置50mL离心管中，依次加入10mL三氯乙酸溶液（5.2.9）、2mL乙酸铅溶液（5.2.10）、3mL三氯甲烷（5.2.2），涡旋30s使其充分混匀，中速振荡提取10min，10000r/min离心5min，取上清液备用。

15.4.2　净化

依次用3mL甲醇（5.2.4）、3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱（5.3.9），取备用上清液（5.4.1）全部过柱，再依次用3mL水、3mL甲醇（5.2.4）淋洗，抽干。

用5mL氨化甲醇溶液（5.2.12）洗脱，收集洗脱液置试管中。

于60℃下用氮气吹干，加入1.00mL甲醇溶液（5.2.11）于试管中，涡旋10s，用微孔滤膜（5.3.14）过滤，滤液供高效液相色谱仪分析。

15.4.3　测定

15.4.3.1　色谱条件

色谱柱：

SB-C18或SB-C8柱，粒度5μm，25cm×4.6mm（ID）。

流动相：

900mL离子对缓冲溶液（5.2.13）：

100mL乙腈（5.2.3），摇匀。

检测波长：

240nm。

柱温：

30℃。

流速：

1.0mL/min。

进样体积：

20μL。

15.4.3.2　测定

取试样溶液和相应的标准工作液，作单点或多点校准，外标法定量。

标准工作液及试样液中三聚氰胺的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

15.4.4　空白试验

除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

15.5　结果计算与表述

试料中三聚氰胺的残留量按式

（2）计算：

X=

…………………………………

（2）

式中：

X——试料中三聚氰胺的含量,单位为毫克每千克（mg/kg）；

C——标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

A——试样溶液中三聚氰胺的峰面积；

As——标准溶液中三聚氰胺的峰面积；

M——供试试样质量，单位为克（g）。

V——试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）。

注：

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

15.6　方法灵敏度、准确度、精密度

15.6.1　灵敏度

三聚氰胺在猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的定量限为0.20mg/kg。

15.6.2　准确度

本方法在0.50mg/kg～10.00mg/kg添加浓度的回收率为80%～110%。

15.6.3　精密度

本方法的批内变异系数≤15%，批间变异系数≤20%。

标准溶液色谱图、猪肉样品空白色谱图、猪肉样品回收色谱图见附录A中图A.1、图A.2和图A.3。

16　气相色谱-质谱法

16.1　原理

试料中残留的三聚氰胺经三氯乙酸和乙酸铅提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性杂质，经混合型阳离子交换固相萃取小柱净化，双三甲基三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷衍生，气相色谱-质谱仪测定，以m/z327碎片离子色谱峰面积定量。

16.2　试剂和材料

除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。

水应符合GB/T6682二级水的规定。

16.2.1　三聚氰胺对照品：

含三聚氰胺（C3H6N6）不得少于95.0%。

16.2.2　三氯甲烷（CHCl3）。

16.2.3　乙腈（CH3CN）：

色谱纯。

16.2.4　甲醇（CH3OH）:

色谱纯。

16.2.5　庚烷磺酸钠（C7H15SO3Na）。

16.2.6　柠檬酸（C6H8O7•H2O）。

16.2.7　氨水（NH3•H2O）。

16.2.8　氮气（N2）：

普通氮气。

16.2.9　吡啶（C5H5N）：

优级纯。

16.2.10　双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）=99:

1。

16.2.11　0.122mol/L三氯乙酸溶液：

准确称取三氯乙酸20g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。

16.2.12　0.058mol/L乙酸铅溶液：

准确称取乙酸铅22g于1000mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度。

16.2.13　80%甲醇溶液：

准确量取80mL甲醇（6.2.4）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。

16.2.14　5%氨化甲醇溶液：

准确量取5mL氨水（6.2.7）于100mL容量瓶中，用甲醇（6.2.4）定容至刻度，现用现制。

16.2.15　称取2.02g庚烷磺酸钠（6.2.5）和2.10柠檬酸（6.2.6）于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

16.2.16　三聚氰胺标准贮备液：

精确称取约50mg三聚氰胺标准品（6.2.1），精确到0.0001g，，用80%甲醇溶液（6.2.13）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。

16.2.17　三聚氰胺标准中间液：

吸取5.00mL标准贮备液（6.2.16）于50mL棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液（6.2.13）稀释、定容，配成浓度为100μg/mL的标准中间液。

16.2.18　三聚氰胺标准工作液：

吸取1.00mL标准中间液（6.2.17）于100mL容量瓶中，用甲醇（6.2.4）稀释、定容至浓度为1.00μg/mL的标准工作液。

16.3　仪器和设备

16.3.1　气相色谱-质谱仪。

16.3.2　毛细管柱：

HP-5MS毛细管柱。

16.3.3　分析天平：

感量0.0001g。

16.3.4　天平：

感量0.01g。

16.3.5　组织匀浆机。

16.3.6　匀浆杯：

30mL。

16.3.7　离心机。

16.3.8　离心管：

50mL。

16.3.9　混合型阳离子交换固相萃取柱：

60mg/3mL。

16.3.10　固相萃取装置。

16.3.11　氮气吹干仪。

16.3.12　涡旋混合器。

16.3.13　振荡器。

16.3.14　微孔滤膜：

孔径0.22μm，有机相。

16.4　测定

16.4.1　提取

取（2±0.05）g试料试料（3.1），置50mL离心管中，依次加入10mL三氯乙酸溶液（6.2.11）、2mL乙酸铅溶液（6.2.12）、3mL三氯甲烷（6.2.2），涡旋30s使其充分混匀，中速振荡提取10min，10000r/min离心5min，取上清液备用。

16.4.2　净化

依次用3mL甲醇（6.2.4）、3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱（6.3.9），取备用上清液（6.4.2）全部过柱，再依次用3mL水、3mL甲醇（6.2.4）淋洗，抽干。

用5mL氨化甲醇溶液（6.2.14）洗脱。

16.4.3　衍生化

将洗脱液（或根据洗脱液中三聚氰胺的浓度用甲醇适当稀释）在60℃下用氮气吹干，加入300μL吡啶和200μL的衍生化试剂（6.2.10），涡旋混匀，密封玻璃塞，70℃在恒温干燥箱中反应30min，冷却后用微孔滤膜（6.3.14）过滤，滤液用气相色谱-质谱仪测定。

16.4.4　标准曲线的制备

分别准确吸取1.00μg/mL标准工作液（6.2.18）0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL置具塞小试管，按6.4.3衍生后，（因试样溶液最终定容体积为0.5ml，则对应浓度对应分别是0.2μg/mL，0.4μg/mL，0.6μg/mL，0.8μg/mL，1.0μg/mL）气相色谱-质谱仪测定。

每一个浓度重复测定2次，测得的峰面积平均值与对应浓度绘制标准曲线，拟合，求得回归方程和相关系数。

16.4.5　测定

16.4.5.1　气相色谱-质谱条件

色谱柱：

HP-5MS毛细管柱或相当者。

载气：

氦气，流速为1.3mL/min。

进样量：

1μL。

进样口温度：

260℃。

升温程序：

起始温度75℃，持续1.0min,以30℃/min升温至300℃，保持2.0min。

传输线温度：

280℃。

运行时间：

10.5min。

扫描范围：

60m/z-400m/z。

扫描模式：

选择离子监测（SIM）。

监测离子m/z99、171、327、342，定量离子m/z327。

离子源：

EI源。

离子源温度：

230℃。

EI源轰击能：

70eV。

16.4.5.2　测定

定性方法：

衍生后试样溶液峰与三聚氰胺标准品峰保留时间的相对偏差不大于0.5%，且四个监测离子丰度比与标准溶液的四个监测离子丰度比一致（即相差在20%以内），可判断试样中含有三聚氰胺。

定量方法：

取衍生后的标准工作液及试样溶液，以m/z327碎片离子色谱峰（基峰）面积积分值进行单点或多点校准。

16.4.6　空白试验

除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

16.5　结果计算与表述

试料中三聚氰胺的残留量按式（3）计算：

X=

…………………………………（3）

式中：

X——试料中三聚氰胺的残留量,单位为毫克每千克（mg/kg）；

C——标准工作液中三聚氰胺的上机浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

A——试样溶液中经衍生化三聚氰胺327碎片离子的峰面积；

As——标准工作液中经衍生化三聚氰胺327碎片离子的峰面积；

M——供试试样质量，单位为克（g）；

V——试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

P——稀释倍数。

注：

计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

16.6　方法灵敏度、准确度、精密度

16.6.1　灵敏度

三聚氰胺在猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的定量限为0.10mg/kg。

16.6.2　准确度

本方法在0.20mg/kg～1.00mg/kg添加浓度的回收率为70%～110%。

16.6.3　精密度

本方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。

三聚氰胺标准品衍生物选择离子色谱图及对应质谱图、三聚氰胺空白衍生物选择离子色谱图及质谱图、三聚氰胺添加衍生物选择离子色谱图及质谱图、三聚氰胺标准溶液衍生物全扫描质谱图见附录A中图A.4～10。

附录A

（资料性附录）