微生物检验规范.docx
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微生物检验规范
微生物检验规范
1.目的
明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。
2.适用范围
公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。
3.职责
品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。
品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登
记和微生物检测工作。
成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微
检样品的保存、登记和微生物检测工作。
品保微生物检验员负责出具检测报告并作出符合性判定。
品保科长负责微生物检测报告的审核。
4.作业程序
实验器材
4.1.1实验器材、培养基和试剂
1.超净工作台2.恒温培养箱36±1C
3.低温培养箱25-28C4.恒温水浴锅46土1C
15.锥形瓶300ml/500ml+硅橡胶塞16.试管
（BGLB
3.霉菌、酵母菌培养基虎红培养基
4.氯化钠
6.乙醇
7.二氧化氯粉剂
8.过氧乙酸
微生物检验的前准备
检验所需器具的灭菌
421.1培养皿及移液管的干热灭菌
洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端
朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于120C干热灭菌
120分钟后，调至160-180C干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至
60C以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。
锥形瓶及移液管的湿热灭菌
洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛
皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于121C湿热灭菌20分钟即可。
镊子、接种环等的火焰灭菌
接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火
焰上方；培养基容器口边在火焰上方。
化学灭菌（75%酉精、100X10-6ClO2）
无菌超净台，手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100X10-6CIO2擦洗灭菌。
培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌
%生理盐水的配制
称取2.25g氯化钠，溶于250ml蒸馏水中，经湿热灭菌即可
4.2.2.275%酒精的配制
取375ml无水酒精，则需加水375/=125ml
4.2.2.3培养基的配制和灭菌条件
测定项目
培养基名称
培养基量/1000ml蒸馏水
杀菌条件
菌落总数
平板计数培养基
121CX15分钟
大肠困群
结晶紫中性红胆盐琼脂
煮沸火菌2分钟
大肠困群
煌绿乳糖胆盐
40g
121CX15分钟
霉菌酵母
虎红培养基
35g
121CX20分钟
火困完全后的培养基置于46土1C的水浴锅中,待培养基的温度降至46±1C方可
湿热灭菌的步骤：
（1）检查蒸压釜中有否足够的水。
（2）检查所有载有液体瓶子的螺旋盖（或塞）是否有松动。
（3）检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。
（4）小心地关好杀菌釜的盖/门。
除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压。
（5）检查排气道或排气阀是否打开。
（6）加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。
蒸汽要猛烈排放2-3min,以保证蒸压釜内冷空气全部排出。
关闭通风阀或排气阀。
（7）继续加热，至达到预定压力及温度。
设备和培养基将在121C下维持20min,
以进行灭菌。
所需压力要连续维持一定时间。
（8）所需加热时间一过，停止加热。
在排气阀不打开的情况下让压力自动下降到零。
否则不要打开蒸压釜。
当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排尽后，打开蒸压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内原载有的物品充分冷却。
（9）取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子，将这些瓶子存放在无菌室的传
递箱中待之冷却备用。
灭菌完成后的培养基，温度降至46土1C方可使用。
所有火菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。
4.2.3无菌室及超净台的灭菌
423.1每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净，每天用100X10-6CIO2消毒桌面、地面。
每月用2%±氧乙酸熏蒸。
4.2.3.2实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。
4.2.3.3实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。
关掉紫外灯后，打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即可进行实验操作。
.样品的抽样和判定标准
4.3.1实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、批号、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。
样品的抽样和判定标准
天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准
产品品项
抽样频率
检验项目
检验方法
检验标准
检验时间
正常：
1瓶/2小时/线
细菌总数
滤膜法
<50个/100ml
550ml/1.25L
大肠菌群
滤膜法
不得检出
恒温室放置
天然水
霉菌酵母
滤膜法
<20个/100ml
天后检验
开（关）机：
2瓶/线
细菌总数
GB-4789
<20个/ml
霉菌酵母
—GB-4789
W5个/ml
备注：
按抽样频率，检验方法一半采用GB-4789,—半采用滤膜法。
生产线微检监控点的样品的抽样和判定标准
各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准
线别
监控点
检验项
检验方
标准规定
检验频率
目
水处
理
源水
菌落总
数
大肠菌
群
霉菌酵
母
砂滤出水，碳罐出水
菌落总
数
大肠菌
群
霉菌酵
母
精滤出水
菌落总
数
大肠菌
群
霉菌酵
母
RO膜系统出水
菌落总
数
大肠菌
法
取合适的稀释倍数做滤膜法
监控项目
1次/周
取合适的稀释倍数做滤膜法
监控项目
1次/维护
后
取合适的稀释倍数做滤膜法
监控项目
1次/天
滤膜法
<10cfu/100ml
1次/维护
后
0cfu/100ml
群
霉菌酵
母
精滤UV后出水
菌落总
数
大肠菌
群
霉菌酵
母
膜出水、膜产水储罐、兑制水储罐、兑
制水UV后、
菌落总
数
大肠菌
群
霉菌酵
母
氧化塔出水、洗瓶水
菌落总
数
大肠菌
群
霉菌酵
母
灌装头（开机前）
菌落总
<5cfu/100ml
滤膜法
<50cfu/100ml
1次/天
0cfu/100ml
<50cfu/100ml
滤膜法
<10cfu/100ml
1次/天
0cfu/100ml
<5cfu/100ml
滤膜法
<3cfu/100ml
1次/天
0cfu/100ml
0cfu/100ml
擦拭法
<2个/每灌装头
1次/周
水线
灌装头
数
霉菌酵
母
<5个/每灌装头
洗瓶头（开机前）
<2个/每洗瓶头
洗瓶头
<5个/每灌装头
圭寸盖头
2
<5个/10cm
盖滑槽
<5个/10cm2
拨盖星轮
2
<5个/10cm
盖贮存槽
<5个/10cm
盖斗
<5个/10cm2
盖输送带
<5个/10cm2
洗瓶夹
2
<5个/10cm
门内壁
<20个/10cm2
充填槽外壁或顶部
<20个/10cm2
风送轨道
2
<20个/10cm
输送带（接近灌装
机）
<20个/10cm
冲洗后空瓶
平均<2个/瓶
盖卜滑道中盖
平均<2个/盖
操作人员手部
<50个/双手
操作人员衣服
<50个/10cm2
微生物检测方法
4.4.1滤膜法：
适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。
441.1仪器：
冰箱：
0〜4C；恒温培养箱：
36±1C/25-28C；恒温水浴锅：
46土1C；电子天平：
精确至；
灭菌平皿:
直径60mm或90mm膜过滤设备；滤杯；ym滤膜；超净工作台；真空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。
4.4.1.2试剂与培养基
平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基，％生理盐水，121C灭菌
20min；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。
4.4.1.3操作步骤：
（1）将样品摇匀，取100ml倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。
（2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中，平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数，虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。
（3）培养
a.菌落总数：
倒置于36±1C的恒温箱中，培养48h±2h。
菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。
b.霉菌和酵母菌：
倒置于25-28C恒温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。
c.大肠菌群
1倒置于36±1C的恒温箱中，培养18h-24h。
取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为或更大。
2从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB
肉汤管内，36±1C培养24h~48h,观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
3大肠菌群平板计数的报告：
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以①中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每100ml样品中大肠菌群数。
例：
在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100X6/10/100ml=60cfu/100ml。
4.4.2国标法：
适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测
的样品。
4.4.2.1菌落总数
4.4.2.设备与材料：
冰箱：
0〜4C；恒温培养箱：
36±1C；恒温水浴锅：
46土1C；电子天平：
精确至；灭菌吸管；灭菌平皿：
直径90mn或60mrp超净工作台；高压灭菌锅及其它物品。
4.4.2.培养基与试剂：
平板计数琼脂培养基，％生理盐水，121C灭菌20min；75%乙醇；100X10-6CIO2溶液。
4.4.2.操作步骤：
（1）样品稀释及培养
a.以无菌操作取样品。
b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1:
10的样品匀液。
c.用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:
100的稀释液。
d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度
（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。
在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同
时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。
及时将6-7ml或15-20ml
冷却至46C的培养基倾注入平皿。
采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。
f.待琼脂凝固后，翻转平板，置36C±1C恒温箱内培养48土2h。
（2）菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器。
记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（CFU表示。
a.选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于
30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
b.其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长
的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中
菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
c.当平板上出现菌藻间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落
计数。
（3）菌落总数的计算方法
a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。
b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：
N=EC/（ni+）d
式中：
N——样品中菌落数；
刀C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
ni――第一个适宜稀释度平板上的菌落数；
n2——第二个适宜稀释度平板上的菌落数；
d――稀释因子（第一稀释度）。
c.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
d.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
e.若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最
低稀释倍数计算。
f.若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（4）菌落总数的报告
a.菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
b.大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约，取前两位数
字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。
c.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
d.若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
e.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
酵母和霉菌
设备与材料：
冰箱：
0-4C;恒温培养箱：
25-28E;恒温水浴箱：
46土1C；电子天平：
精确
至0.1g;
灭菌具塞锥形瓶：
500ml;灭菌平皿：
直径90mn或60mm灭菌试管及其它灭菌设
备；
4.4.2.培养基与试剂：
虎红培养基，％生理盐水，121C灭菌20min，75%乙醇，100X10-6CIO2溶液。
4.4.2.操作步骤
（1）样品稀释及培养
a.以无菌操作取样品
b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1:
10的样品匀液。
c.用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理
盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混
合均匀，做成1:
100的稀释液。
d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度
（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。
在进行10倍递
增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。
及时将6-7ml或15-20ml冷却至46C的培养基倾注入平皿。
采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。
f.待琼脂凝固后，翻转平板，置于25-28E霉酵培养箱中。
3d后开始观察，共培养观察5d。
⑵计算方法：
通常选择菌落数在10-150之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中含霉菌和酵
母数，稀释度选择及菌落报告方式可参考菌落总数的计数方法。
⑶报告：
每克（或毫升）样品中所含的霉菌和酵母菌数以cfu/g（ml）表示。
4.4.2.3大肠菌群
4.4.2.设备与材料：
冰箱：
0〜4C；恒温培养箱：
36±1C；恒温水浴锅：
46土1C；电子天平：
精确至；灭菌吸管；灭菌平皿：
直径90mn或60mrp超净工作台；高压灭菌锅及其它
物品。
4.4.2.培养基与试剂：
煌绿乳糖胆盐（BGLB,%生理盐水，121C灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA,煮沸灭菌2分钟；75%乙醇；100X10-6CIO2溶液。
4.4.2.操作步骤
（1）样品稀释
a.以无菌操作取样品。
b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1:
10的样品匀液。
c.用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理
盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混
合均匀，做成1:
100的稀释液。
d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度
（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。
在进行10倍递
增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。
及时将6-7ml或15-20ml冷却至46C的培养基倾注入平皿。
采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。
（2）平板计数
a.选取2个一3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。
b.及时将6-7ml或15-20ml冷至46C的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA倾注于每个平皿中，小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL~4mLVR覆盖平板表层，翻转平板，置于36C±1C培养18h~24h。
（3）平板菌落的选择
选取菌落数在30—150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为或更大。
（4）证实试验
从VRBA平板上挑去10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种与BGLB
肉汤管内，36C±1C培养18h~24h,观察产气情况，凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
（5）大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，
再乘以稀释倍数，即为每克（每毫升）样品中大肠菌群数。
例：
10—4样品稀
释液1mL在VRBAP板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
—45
100X6/10X10/g（mL）=X10（CFU/g）CFU/mL
附：
大肠菌群检验程序
检样
诜择2个〜3个话宜稀释度的样品均液，接种VRBA平板
36°C±1C18h~24h
计数典型和可疑菌落
BGLB肉汤或复发酵试验
36C±iC18h~24h
报告
4.4.3空气落菌检验
4.4.3.1设备与材料：
恒温培养箱：
36±1C；霉酵培养箱：
25C~28C;电子天平：
精确至0.1g;灭菌平皿：
直径90mm高压灭菌锅及其它物品。
4.4.3.2培养基与试剂：
虎红培养基，平板计数琼脂培养基，121C灭菌20min。
4.4.3.3操作步骤
（1）在已经过灭菌的培养皿中分别倾注已经过灭菌后的平板计数琼脂培养基和虎红培养基，静置使其自然凝固。
（2）将已凝固的培养基正向放置于需检测空气落菌的地点，将培养皿的盖取下，盖口朝下,轻轻搭放在培养皿的边缘。
（3）将培养皿放置30分钟后，盖好培养皿盖取回，菌落总数平板倒放于36±1C恒温箱中培养48h±2h,霉酵平板倒放于25-28C低温培养箱中培养5天。
（4）计数：
可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
4.4.4空气浮游菌检验
444.1设备与材料:
浮游空气尘菌采样器；恒温培养箱：
36±1C；霉酵培养箱：
25-28°C,电子天平:
精确至0.1g;灭菌平皿：
直径90mm高压灭菌锅及其它物品。
4.4.4.2培养基与试剂：
虎红培养基,平板计数琼脂培养基，121C灭菌20min。
操作步骤
（1）在已经过灭菌的培养皿中分别倾注已经过灭菌后的平板计数琼脂培养基或虎红培养基,静置使其自然凝固。
（2）将浮游空气尘菌采样器置于被测区域，打开采样盖，对采样盖进行擦拭消毒，将预先制备的平皿开口置于采样器上，盖上采样盖。
设置采样的流量为50L。
（3）采样结束后，打开采样盖取出平皿盖好。
菌落总数平板倒放于36±1C恒温箱中培养48h±2h，霉酵平板倒放于25-28C低温培养箱中培养5天。
（4）计数：
可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
4.4.5棉签擦拭试验-表面微生物评估
4.4.5.1仪器擦拭用棉签，％生理盐水，121C灭菌20min；酒精灯；75%酉精；记号笔；其它同菌落总数的检测方法。
4.4.5.2培养基与试剂
平板计数琼脂培养基、虎红培养基
4.4.5.3操作步骤
（1）将棉签和生理盐水121C灭菌20min.
（2）手经75%酒精消毒后,或戴用酒精浸泡过的手套持棉签的后端部擦拭；
（3）擦拭：
a.设备及其它平整的表面：
用无菌棉签擦拭10cm面积的设备或其它平整的表面，往返涂擦两遍，每擦拭一遍，将棉签转动一次。
如检测表面狭长，可使其总面积达到iocm，如所检测表面面积较小，可适当减少擦拭面积。
b.灌装头或其它不规则表面：
用无菌棉签擦拭灌装头表面，尽量擦拭整个灌装头,往返涂擦两遍，每擦拭一遍，将棉签转动一次。
c.手部：
让受试者张开手指，用无困棉签擦拭手指缝，然后，手指并拢，用棉签擦拭在五指屈面指尖至指根，以及手掌，往返涂擦两遍，每擦拭一遍,将棉签转动一次。
严格遵守上述拭擦顺序。
（4）用75%酉精和火焰灭菌的镊子将棉签手持端掐断；
（5）国标法：
将擦拭的棉签放入6ml无菌生理盐水中，摇动，使微生物均匀分散。
将样液平分倒入两个平皿中，分别倾注平板计数琼脂培养基和虎红培养基，具体操作见相应的微生物检验方法。
（6）滤膜法，将棉签加入到100mL或200mL（试检测项目的数量而定）灭菌的生理盐水中，摇动，使微生物均匀分散。
将样液加入到滤杯中过滤，具体操作见相应的微生物检验方法。
计算：
a.设备及其它平整表面的菌数以CFU/10cm表示：
国标法：
设备及其它平整表面的菌数：
以平皿中的实际菌数报告
b.灌装头的菌数以CFU个灌装头或其它表示：
国标法：
灌装头及其它不规则表面的菌数：
以平皿中的实际菌数报告
c.手部的菌数以CFU/只表示:
国标法：
手部的菌数：
以平皿中的实际菌数报告
以上若所得的菌
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