不同品种枳实HPLC指纹图谱及成分含量差异性研究.docx

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不同品种枳实HPLC指纹图谱及成分含量差异性研究

不同品种枳实HPLC指纹图谱及成分含量差异性研究

　[摘要]采用HPLC-DAD方法建立18个批次酸橙枳实以及10个批次甜橙枳实的指纹图谱，通过对照品对照和紫外图谱指认了17个色谱峰并对其进行含量测定。

色谱条件：

AgilentPoroshell120SB-C18色谱柱（4.6mm×100mm，2.7μm），以流动相甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，流速0.6mL·min-1，检测波长318nm，柱温为30℃。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）软件进行指纹图谱分析，进一步通过SIMCA-P13.0软件对17个确认的成分含量进行最小二乘法判别分析，确定区分酸橙枳实与甜橙枳实的差异性标记物。

该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，为枳实的质量控制和评价提供依据。

　　[关键词]HPLC-DAD；酸橙枳实；甜橙枳实；指纹图谱；含量测定；差异性标记物

　　[Abstract]ThisstudyistoestablishanHPLCfingerprintbyHPLC-DADmethodandsimultaneousquantitativeanalysisof17componentsof18batchesofCitrusaurantiumand10batchesofC.sinensis.TheseparationwasperformedonanAgilentPoroshell120SB-C18（4.6mm×100mm，2.7μm）columnwiththegradientelutionofmethanol-0.1%formicacidwater，theflowwas0.6mL·min-1.Thedetectionwavelengthwassetat318nm.Thecolumntemperaturewasmaintainedat30℃.ThedatacalculationwasperformedwithsimilarityevaluationsystemforchromatographicfingerprintoftraditionalChinesemedicine（Version2004A）togetherwithSIMCA-P13.0softwaretoclarifythedifferentialmarkerbetweenthesetwodifferentspeciesofAurantiiFructusImmaturus.ThismethodhasgoodprecisionstabilityandrepeatabilitythatcouldprovidebasisforqualitycontrolandevaluationofAurantiiFructusImmaturus.

　　[Keywords]HPLC-DAD；Citrusaurantium；Citrussinensis；fingerprint；quantitativeanalysis；differentialmarker

　　doi：

10.4268/cjcmm20161725

　　枳实为常用中药，应用历史悠久，始载于《神农本草经》，为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙C.sinensisOsbeck的干燥幼果。

5—6月收集自落的果实，除去杂质，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥。

具有破气消积，化痰除痞的功效[1]。

目前枳实的产地主要有江西、四川、重庆、湖南、湖北、浙江、江苏、贵州等。

其中以江西为传统道地产地，四川质量优，湖南产量大[2]。

酸橙的变种主要有黄皮酸橙C.aurantium′Huangpi′、代代花C.aurantium′Daidai′、朱栾C.aurantium′Chuluan′和塘橙C.aurantium′Tangcheng′。

枳实中主要含有黄酮类成分、生物碱成分、挥发油成分和香豆素类成分，具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗肿瘤、升压、强心、促进胃肠功能等作用[3-9]。

酸橙与甜橙均作为枳实药用，前期研究发现它们的挥发油成分和主要4种黄酮类成分存在差异[10-11]，2种枳实组成的枳术丸临床疗效[12]也有所不同。

　　中药指纹图谱采用现代化的分析手段，得到能够标识中药材或制剂的特征成分的光谱图或色谱图，结合现代数理统计软件可将多维信息进行分析处理，使得指纹图谱信息得以充分整合、正确表达，真实、形象地反映了中药质量的差异[13]。

枳实品种来源各异，产地不一，市场流通的枳实药材多不知来源。

2015年版《中国药典》规定，以辛弗林作为枳实质量控制的指标[1]，为更全面反映枳实内在化学成分的种类和数量，以分析不同品种枳实质量差异，从而控制枳实的内在质量，本文以酸橙枳实和甜橙枳实为研究对象，在建立了不同品种枳实HPLC指纹图谱的同时，对其中17个含量较高的活性成分（7-OH香豆素，芸香柚皮苷，柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷，芹菜苷，野漆树苷，山柰苷，柚皮素，橙皮素，芹菜素，香叶木素，甜橙黄酮，川陈皮素，5-去甲川陈皮素，橘皮素，橙皮油素）进行标定并测定含量，确定了区分酸橙枳实与甜橙枳实的差异性标记物，为枳实多成分多指标测定及整体质量评价提供参考，也为枳实质量标准的提高提供科学依据。

　　1材料

　　AgilentHP1100系列液相色谱仪，配备G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A恒温箱，G1315BDAD检测器，G1313A自动进样器，ChemStation色谱工作站；TCQ-250型超声波清洗器（北京医疗设备二厂），CP225D型电子天平（德国赛多利斯公司）。

　　7-OH香豆素（批号MUST-14120715）、芸香柚皮苷（批号MUST-13041206）均购自成都曼斯特生物科技有限公司。

柚皮苷（批号K21M4C1）、橙皮苷（批号K02M3C1）、芹菜苷（批号PJ-0603RA13）、山柰苷（批号20120824）、甜橙黄酮（批号P22D3R1）均购自上海源叶生物科技有限公司。

新橙皮苷（批号111857-201102）、野漆树苷（批号111919-201102）、香叶木素（批号111788-200801），均购自中国食品药品检定研究院。

芹菜素（批号1246-081013）购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。

橙皮素（批号097K1153）、柚皮素（批号127K1240）均购自Sigma公司。

橘皮素（批号071126）购自上海融禾医药科技有限公司。

川陈皮素（批号JZ14102611）、5-去甲川陈皮素（批号JZ15041102）、橙皮油素（批号JZ15041110）均购自南京景竹生物科技有限公司。

枳实采集于江西、四川、湖南、湖北、广西、贵州等地，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为芸香科为植物酸橙C.aurantium及其栽培变种或甜橙C.sinensis的干燥幼果。

共计28批，包括18批酸橙枳实（S1～18）以及10批甜橙枳实（T1～10），样品详细信息见表1。

甲醇、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其他乙醇甲醇等试剂为分析纯。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件

　　AgilentPoroshell120SB-C18色谱柱（4.6mm×100mm，2.7μm）；流动相A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序：

0～4min，30%A；4～23min，30%～33%A；23～28min，33%～44%A；28～40min，44%A；40～44min，44%～63%A；44～48min，63%～65%A；48～50min，65%～73%A；50～56min，73%～96%A；56～60min，96%～100%A。

柱温30℃，流速0.6mL·min-1，检测波长318nm。

含量测定的17个成分均达到基线分离，分离度大于1.2。

对照品的HPLC色谱图见图1。

酸橙枳实和甜橙枳实的标准指纹图谱见图1。

　　2.2对照品溶液的制备

　　分别取各种对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成含7-羟基香豆素0.146g·L-1、芸香柚皮苷0.508g·L-1、柚皮苷1.242g·L-1、橙皮苷0.136g·L-1、新橙皮苷1.126g·L-1、芹菜苷0.246g·L-1、野漆树苷0.405g·L-1、山柰苷0.186g·L-1、柚皮素0.204g·L-1、橙皮素0.316g·L-1、芹菜素0.115g·L-1、香叶木素0.326g·L-1、甜橙黄酮0.242g·L-1、川陈皮素0.154g·L-1、5-去甲川陈皮素0.150g·L-1、橘皮素0.388g·L-1、橙皮油素0.148g·L-1的溶液，作为对照品储备液。

　　2.3供试品溶液的制备

　　取各供试品粉末（过60目筛）约0.2g，准确称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25mL，称定质量，超声提取30min，放冷，再称定其质量，用75%甲醇补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

　　2.4方法学考察

　　2.4.1线性关系精密吸取2.2项下各个对照品储备液，用色谱甲醇稀释成6个不同质量浓度梯度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标，质量浓度（mg·L-1）为横坐标，绘制标准曲线，得各成分的回归方程和线性范围。

将对照品溶液逐级稀释，当信噪比分别为3，10时，得定量限（LOQ），检测线（LOD）。

所得回归方程，线性范围，LOQ及LOD，见表2。

　　2.4.2精密度试验精密吸取同一供试品溶液（S-11），在上述色谱条件下连续进样6次，测定色谱峰峰面积，按峰号计算各峰面积的RSD，分别为2.0%，1.9%，2.0%，1.7%，1.3%，2.5%，2.3%，2.8%，2.6%，2.6%，1.5%，2.3%，1.9%，1.5%，2.6%，1.9%，1.2%，表明仪器精密度良好。

　　2.4.3稳定性考察取枳实粉末（S-11）约0.2g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0，2，4，8，12，24h，测定色谱峰峰面积，按峰号计算各峰面积的RSD，分别为1.7%，2.1%，1.5%，2.7%，1.2%，2.6%，2.5%，2.7%，2.2%，2.6%，1.4%，2.6%，1.3%，1.1%，1.9%，1.6%，1.7%，表明供试品溶液在24h内有较好的稳定性，符合指纹图谱及含量测定的要求。

　　2.4.4重复性试验取同一批次枳实粉末6份（S-11），各约0.2g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱峰峰面积，并按峰号计算各色谱峰含量的RSD，分别为1.4%，2.5%，2.4%，3.0%，2.2%，2.4%，2.1%，1.5%，2.7%，2.0%，2.5%，2.4%，2.5%，2.7%，1.8%，1.6%，2.2%，表明重复性良好。

　　2.4.5加样回收率试验取己知含量的样品粉末6份（S-11），各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，准确加入与样品中含量等量的17个对照品，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进液相色谱仪，测定并记录峰面积，计算各成分的加样回收率，结果见表2。

　　2.5枳实指纹图谱的建立

　　按照上述确定的HPLC色谱条件和供试品溶液的制备方法，测定了18批酸橙枳实和10批甜橙枳实的指纹图谱，因图谱中橙皮苷分离度好，含量较高，常作为评价枳实药材质量和活性的指标，因此将其作为色谱参照峰（S），将各色谱峰的保留时间与同一图谱中参照峰的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±5%。

将酸橙枳实和甜橙枳实的指纹图谱分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版），酸橙中设定S-11为参照图谱，甜橙中设定T-5为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1min，采用中位数法计算，选定多个特征峰进行多点校正，自动匹配，分别生成酸橙和甜橙枳实的对照指纹图谱，并计算相似度，18批酸橙枳实（S1-S18）与对照指纹图谱的相似度分别为0.996，0.963，0.99，0.974，0.988，0.972，0.989，0.972，0.94，0.969，0.988，0.945，0.982，0.965，0.963，0.982，0.977，0.963，10批甜橙枳实（T1-T10）与对照指纹图谱的相似度分别为0.873，0.876，0.83，0.903，0.833，0.918，0.889，0.908，0.92，0.771。

　　2.6共有峰的指认及含量测定

　　从酸橙枳实的指纹图谱确定了21个共有峰，甜橙枳实的指纹图谱确定了22个共有峰。

通过保留时间、紫外图谱比较以及对照品对照，从酸橙枳实21个共有峰中指认出12个色谱峰，从甜橙枳实22个共有峰中指认出11个色谱峰，共涉及17个黄酮和香豆素类成分，分别为7-OH香豆素，芸香柚皮苷，柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷，芹菜苷，野漆树苷，山柰苷，柚皮素，橙皮素，芹菜素，香叶木素，甜橙黄酮，川陈皮素，5-去甲川陈皮素，橘皮素，橙皮油素。

通过外标法计算这些成分的含量，结果见表3。

　　2.7酸橙枳实与甜橙枳实差异标记物的筛选

　　通过SIMCA-P13.0软件进行分析，以酸橙枳实与甜橙枳实中确认的17个化学成分的含量为X变量，枳实28个批次为Y变量，进行无监督的PCA分析、有监督的最小二乘判别分析（PLS-DA）和聚类分析，评价酸橙与甜橙枳实的差异。

样品的聚类情况，见图2，经PLS-DA模型拟合分析生成差异性标记物的VIP图，见图3，从中筛选出VIP>1的成分，并将其确定为贡献较大的成分。

　　3讨论

　　3.1枳实品种来源

　　本文主要参考药典以及枳实资源考察的文献，从道地产地和主产区收集不同批次的酸橙枳实与甜橙枳实作为供试品。

其中酸橙枳实主要采自江西、四川等地，甜橙枳实主要采自重庆、广西、贵州等地。

　　3.2提取溶媒和方法学考察

　　分别考察了不同浓度（30%，50%，75%，100%）甲醇和乙醇提取样品后的指纹图谱情况。

结果显示甲醇的提取效果比乙醇好，以75%甲醇为提取溶媒能够兼顾各极性成分的提取，故提取溶媒选择75%甲醇。

对超声和回流2种不同提取方式进行比较，其指纹图谱的色谱峰个数以及峰面积等均无明显差异，鉴于超声操作简单，省时，故采用超声提取方式。

同时对提取时间（15，30，60min）、溶媒用量（10，25，50mL）进行考察，最终确定上述2.3项下供试品溶液的制备方法。

　　3.3色谱条件的考察

　　本实验分别考察了乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-水溶液4种不同的流动相系统对液相色谱分离效果的影响，结果甲醇对枳实样品的色谱峰分离效果更好，甲酸和磷酸均能优化峰形，最终选择甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相。

枳实的中各活性成分紫外吸收峰主要集中在283，318，356nm附近。

但283，356nm不能兼顾所有峰的吸收情况，而选择318nm为检测波长能兼顾大部分色谱峰的检测，避免个别峰吸收太差而无法检测到。

对不同流速（0.4，0.6，0.8，1.0mL·min-1）以及柱温（25，30，35，40℃）进行考察，最终确定了2.1项下的色谱条件。

　　3.4酸橙和甜橙枳实指纹图谱及差异性标记物分析

　　从样品的聚类图可以看出，28批枳实样品聚成两组，分别为酸橙组和甜橙组，说明酸橙枳实和甜橙枳实存在差异，而不同批次酸橙枳实和不同批次甜橙枳实之间差异较小。

酸橙和甜橙枳实的相似度结果显示酸橙与对照指纹图谱的相似度均高于0.9，表明各批酸橙样品具有较高的均一性，质量相对较稳定。

说明本实验建立的酸橙枳实药材指纹图谱中21个共有峰及对照指纹图谱可反映其指纹特征，具有鉴别评价意义。

而10批甜橙的相似度与对照指纹图谱的相似度分别为0.873，0.876，0.830，0.903，0.833，0.918，0.889，0.908，0.920，0.771，相似度结果偏低，提示不同批次甜橙存在较大差异。

从产地因素分析，可能是所测定的甜橙枳实的产地不一，不同产地之间的样品质量存在一定的差异，以重庆奉节及广西临桂产的甜橙枳实相似度较高，因此建议在重庆奉节及广西临桂进行甜橙的大规模规范化种植，以提高市场上甜橙药材质量，这对于控制其质量稳定有重要意义。

　　将确认的酸橙与甜橙枳实17个化学成分的含量，经PLS-DA模型拟合分析生成的VIP图可显示模型中因素的重要性，由图3可见，VIP>1的有7个成分，按照VIP值由大到小排序，分别为新橙皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橘皮素、橙皮素、5-去甲川陈皮素、橙皮油素，这些成分是造成不同品种枳实质量之间差异贡献较大的成分，提示这些成分对酸橙枳实和甜橙枳实分类具有显著的影响。

前期研究已经发现，甜橙枳实中不含有柚皮苷和新橙皮苷[14]。

本文除此还发现，甜橙枳实只有极个别批次含有橙皮素与橙皮油素，而这些成分在酸橙枳实中都能检测到，提示枳实不同品种化学成分存在种类差异。

还有些成分在酸橙与甜橙枳实中含量差异显著，如野漆树苷，在酸橙中为0.327～1.735mg·g-1，而甜橙中只有0.029～0.197mg·g-1。

提示枳实不同品种化学成分存在含量差异。

并可能进一步导致药理作用及活性上的差异，因此有必要对不同品种的枳实建立指纹图谱及质量控制标准，为其合理用药提供理论依据。

药典中酸橙与甜橙作为2种品种枳实入药，且两种枳实在化学成分上存在显著差异。

建议除了药典规定的辛弗林之外，增加柚皮苷、新橙皮苷作为不同品种枳实质量控制指标，对枳实进行多指标综合评价，为保证枳实临床合理用药提供参考。

　[参考文献]

　　[1]中国药典.一部[S].2015.

　　[2]蔡逸平，陈有根，范崔生.中药枳壳、枳实类原植物调查及商品药材的鉴定[J].中国中药杂志，1999，24（5）：

259.

　　[3]SalasMP，CélizG，GeronazzoH，etal.Antifungalactivityofnaturalandenzymatically-modifiedflavonoidsisolatedfromCitrusspecies[J].FoodChem，2011，124（4）：

1411.

　　[4]OrtuoA，DíazL，AlvarezN，etal.ComparativestudyofflavonoidandscoparoneaccumulationindifferentCitrusspeciesandtheirsusceptibilitytoPenicilliumdigitatum[J].FoodChem，2011，125

（1）：

232.

　　[5]HoS，KuoC.Hesperidin，nobiletin，andtangeretinarecollectivelyresponsiblefortheanti-neuroinflammatorycapacityoftangerinepeel（CitriReticulataePericarpium）[J].FoodChemToxicol，2014，71：

176.

　　[6]ChenH，ZhangW，YuanJ，etal.SimultaneousquantificationofpolymethoxylatedflavonesandcoumarinsinFructusaurantiiandFructusaurantiiimmaturususingHPLC-ESI-MS/MS[J].JPharmBiomedAnal，2012，59：

90.

　　[7]陈廉，王殿俊，常复蓉，等.青皮、陈皮、枳实药理作用的比较[J].江苏中医杂志，1981（3）：

60.

　　[8]毕庆和，杨德治，应崇智，等.枳实对小肠电活动的影响[J].中国医药学报，1991，6

（1）：

39.

　　[9]郭兆贵.枳实注射液升压有效成分N-甲基酪胺的药理研究[J].中国药学杂志，1978，29（4）：

64.

　　[10]王淳.不同品种产地枳实有效成分的对比分析[D].北京：

中国中医科学院，2009.

　　[11]LiuY，LiuZ，WangC，etal.StudyonessentialoilsfromfourspeciesofZhishiwithgaschromatography-massspectrometry[J].ChemCentJ，2014，8

（1）：

22.

　　[12]张越颖.酸橙与甜橙枳实所制枳术丸治疗功能性消化不良脾虚气滞证的临床疗效比较[J].北京中医，2007，26（3）：

172.

　　[13]熊淑雯，章开，陈东，等.指纹图谱技术结合PLS-DA在黄连上清丸质量控制中的应用[J].南昌大学学报：

医学版，2015，55（6）：

15.

　　[14]LiuZ，LiuY，WangC，etal.DiscriminationofZhishifromdifferentspeciesusingrapid-resolutionliquidchromatography-diodearraydetection/ultraviolet（RRLC-DAD/UV）coupledwithmultivariatestatisticalanalysis[J].JMedPlantRes，2012，6（5）：

866.