LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性.docx

LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性.docx

《LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性

LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性

白血病抑制因子（LIF）信号通路可以维持小鼠胚胎干细胞多能性。

尽管Jak-Stat3在介导LIF信号传递中发挥重要作用，但始终不清楚这些信号是怎样与干细胞多能性相关的转录因子如Oct3\4,Sox2,Nanog联系起来的。

我们发现两条LIF相关的信号通路通过转录因子相连。

在小鼠胚胎干细胞中，Klf4主要是通过JAK-STAT3信号通路被激活，再优先激活Sox2；然而Tbx3主要是通过PI3K-ATK和MAPK-ERK信号通路被激活，再激活Nanog.在没有LIF时，只要维持Oct3\4表达，Klf4或者Tbx3表达就足够维持胚胎干细胞的全能性。

很显著的是，没有Klf4和Tbx3活性时，Nanog过度表达就可以使小鼠胚胎干细胞仅依靠LIF通路维持自我更新。

所以Klf4和Tbx3可以介导LIF信号传递到核心通路，但并不直接参与维持干细胞多能性。

因为在特别情况下，没有Klf4和Tbx3表达就可以维持干细胞全能性。

传统培养条件下，小鼠胚胎干细胞自我更新依赖于LIF激活信号转导因子Gp130;没有LIF就会导致干细胞分化。

但是若有人为激活Stat3或Nanog过表达就足以维持干细胞自我更新。

Stat3通过与Gp130相关的Jak激酶被激活，但是其与Nanog间的关系还不是很清楚。

生物信息学研究一些转录因子可以假定为核心转录因子的靶标。

在这些转录因子中发现在没有LIF时，Klf4和Tbx3有能力维持OCRG9细胞（来源于E14tg2a的Rex1-Gfp-BSD\Oct3\4-Ecfg-pac胚胎干细胞），与Nanog类似。

这些干细胞在有嘌呤霉素的条件下生存说明Oct3\4启动子有效促进转录翻译表达，但是绿色荧光蛋白的表达量要比原来的ES低。

Klf4编码锌指转录因子，作为与Oct3\4和Sox2辅助因子激活一系列靶基因，用于维持体细胞多能性，延迟胚状体培养条件下的细胞分化。

通过RNA干扰介导的功能缺失研究显示Tbx3编码T-box转录因子用于维持干细胞多能性。

把这些基因中的一个完整转染到MGZ5胚胎干细胞中（来源于CCE）有助于形成不依赖于LIF的克隆。

然而用可以使转基因高表达的episomalVector系统将Tbx3和Klf4转进MGZ5胚胎干细胞中，却没有获得稳定的转染细胞，说明这与基因的表达量密切相关。

没有LIF仅通过Klf4,Tbx3或者Nanog维持自我更新形成的胚胎干细胞表型与LIF存在下形成的表型相似。

生长速度比LIF存在下要慢，但是可以在体外维持恒定生长速度稳定传代一个月以上。

当FLOXED的Klf4基因转染到ES细胞中在没有LIF存在的条件下也可以维持生长一个月。

当含有cre重组酶的载体转染到胚胎干细胞中，会将Klf4基因剪切掉。

DsRed基因被激活，细胞重新依赖于LIF并恢复形成胚状体的能力。

这些胚胎干细胞注射到囊胚，再移植到假孕母鼠的子宫会产生嵌合鼠。

而表达DsRed的细胞会存在于整个胚胎部分。

对于Tbx3观察到相同的结果。

这两种情况在转入的基因去掉以前，不加LIF也能在有Jak抑制剂或显性负的Stat（StatF）稳定表达时生长。

这些结果显示：

和Nanog一样，Klf4或Tbx3表达足以维持胚胎干细胞在没有LIF存在的条件下生长。

为了研究这些具有相同功能活性的转录因子相互之间是怎样联系的，我们检测了不加LIF培养4天的转基因胚胎干细胞，内源性基因表达水平。

Stat3靶标基因Socs3表达下降或者是Stat3失去活性说明移除了LIF信号。

在三个转基因胚胎干细胞系中Oct3\4表达量都维持在正常水平。

但是，在Nanog-和Tbx3-ES细胞中Sox2表达量与在不加LIF条件下培养4天的ES细胞相比有明显不同。

这说明并转基因细胞并没有维持Sox2表达；然而Tbx3-ES细胞却可以维持Nanog表达。

因为先前我们曾发现Sox2独特功能就是可以维持Oct3\4表达，在Nanog-和Tbx3-ES细胞中做出来的结果说明除Sox2外，Nanog也可以维持Oct3\4表达。

Tbx3可以在Tbx3-ES细胞中表达，不在另外两种细胞中表达；但是三种细胞都不表达Klf4.三种细胞中Tbx3,Nanog和Klf4的表达特点通过蛋白水平上的检测得到验证。

这些研究结果表明三种转录因子发挥作用有先后等级特点，即Tbx3和Klf4是上游，Nanog在Klf4的下游，使得Oct3\4表达维持干细胞自我更新。

在有些转基因胚胎干细胞中可以观测到多种全能性相关基因调节其自我更新。

胚胎干细胞免疫染色实验显示Tbx3,Nanog和Klf4表达情况不同。

为了分析三种基因表达特点，我们用Rex1标记系统区分两种胚胎干细胞。

正如前面报道的：

80%OCRG-ES细胞表达绿色荧光蛋白，可以用来检测Rex1表达。

我们发现分别有75%，50%，30%的胚胎干细胞表达Klf4,Nanog和Tbx3,三种转录因子都表达的细胞占到24%。

三种转录因子核定位特点的微弱联系说明胚胎干细胞全能性维持并不仅仅依赖于传统培养基中LIF信号转导通路，还有其他信号发挥作用。

然而通过检测Oct3\4-CFP复合物表达，显示几种胚胎干细胞中Oct3\4表达情况相同。

所以尽管三种转录因子的表达有波动，到最后Oct3\4表达是恒定的，用以维持干细胞自我更新。

能够取代LIF维持干细胞自我更新说明这些转录因子和LIF具有相同的生理学特性。

为了检验这些特性，我们测定了在有LIF信号时的转录特点。

ES细胞在不加LIF时培养21个小时以彻底去除LIF信号干扰，测定显示Socs3，Klf4,Nanog和Tbx3表达但是Sox2和Oct3\4不表达。

然后加入LIF,测定显示这些基因都表达。

Stat3直接联系的基因Socs3在0.5h时表达量上调，2h后下降最后维持在恒定水平。

Klf4经历了相同的过程，但是上升量要小。

但是这段期间内Tbx3和Nanog并没有明显变化说明三个基因中Klf4是通过LIF信号调控的。

同时我们评估了可以激活这些基因表达的细胞内信号通路。

LIF信号激活Jak-Stat3,PI3K-Atk和MAPK三条信号通路。

它们中仅Jak-Stat3只通过LIF信号调控，其它两条都通过多种信号调控。

在LIF信号刺激以前，我们用每个信号通路的特异性抑制因子培养细胞，再通过WesternBlot检测产生的影响。

加入Jak通路抑制因子培养的细胞，1h后Socs3表达量不再上升；其它几种抑制因子对其表达量没有影响，说明Socs3表达通过Jak-Stat3通路调节。

Jak抑制因子也Klf4表达量不再上调。

24h时，加有MAPKK抑制因子培养的细胞中Nanog和Tbx3表达量升高。

对Jak-Stat3依赖性的微小差别通过ES细胞中Stat3活性的调整得到验证。

不加LIF，含有Stat3ER基因的胚胎干细胞在有4HT或没有4HT的条件下培养4天（4HT可以激活Stat3ER表达）。

与在LIF培养条件下，基因表达水平相比较。

结果显示Stat3ER基因表达可以维持Socs3和Klf4表达，不能维持Tbx3和Nanog表达。

如果Stat3负向形式过度表达使Stat3基因失活，Socs3,Klf4和Nanog表达被抑制而Tbx3表达不受影响。

这说明Tbx3不只是通过Stat3进行调节。

胚胎干细胞中PI3K-Atk通路部分通过LIF调节，还可以被胰岛素\胰岛素样生长因子和Eras（ES细胞表达的Ras）被激活。

为检验其对基因表达的影响，我们分析在没有LIF的条件下ES细胞内正常基因表达水平是通过活化Atk维持的。

这些细胞中Nanog，Tbx3和Oct3\4正常表达，但是Klf4和Sox2不可以。

这些基因的表达特点与Tbx3-ES细胞中很相似。

这结果与Nanog通过PI3K-Atk通路调节的报道是一致的，同时也说明Tbx3也部分通过PI3K-Atk进行调节。

然而为什么在有MAPKK抑制因子的条件下，后期阶段LIF会上调Tbx3和Nanog的表达量呢？

ES细胞中成纤维细胞生长因子激活MAPK信号通路破坏其全能性，完全抑制MAPKK和GSK3β足以在没有LIF存在的条件下维持干细胞全能性。

同时我们发现在这样的培养条件下可以维持Tbx3和Nanog表达，抑制MAPKK会使Tbx3蛋白从8h开始在细胞核内堆积等到24h达到最大值。

因为Tbx3-ES细胞中可以表达内源性Tbx3,Tbx3可以自动调节。

所以如果MAPK信号通路可以使Tbx3向核外输出，抑制MAPK信号通路可以使Tbx3在核内累积，通过自我调节维持Tbx3持续表达。

多种信号调节Tbx3在细胞核内的定位如在饲养层上培养的胚胎干细胞核内积累Tbx3蛋白，Tbx3蛋白在核内积累依赖于蛋白质合成。

我们实验结果显示LIF信号通过两条途径发挥对胚胎干细胞多能性调节作用：

Jak-Stat3激活Klf4和Sox2;PI3K-Atk激活Tbx3和Nanog.这些通路发挥主要作用，还有另外一些通路也发挥作用。

因为Sox2的调节并不是唯一的，ES细胞在没有LIF条件下仅通过Stat3ER维持其长期培养也可以获得基因正常表达水平。

细胞增殖调节与这些信号通路不同，因为转入Tbx3和Klf4不足以维持正常的生长速率。

但是Stat3-ER细胞可以在没有LIF的条件下维持正常生长。

在细胞转录因子作用网络上，寻找出的并行通路使Klf4,Tbx3和Nanog在胚胎干细胞和早期胚胎发育过程中变得可有可无。

主要是由于相关因子的重叠作用例如Klf2,Tbx4和Klf5都可以在没有LIF存在的条件下维持干细胞的自我更新。

Klf4和Tbx3发挥作用局限于与LIF信号核心调节回路的联系，因为在Nanog-ES细胞中虽然可以维持Oct3\4正常表达，但是不能激活Klf4和Tbx3。

实验结果显示Oct3\4,Sox2和Nanog表达水平与activin\Fgf228下培养的外胚层多能性干细胞相同。

这说明不同组合的细胞转录因子可以连接细胞外信号和细胞内核心调控回路。

事实上，最近报道显示在EpiSCs中可以通过activin激活Smad2\3信号通路调控Nanog表达。

转录因子发挥作用的先后顺序或许可以解释转录因子在维持干细胞多能性上的稳健性。

据我们所知，这是第一次分析维持干细胞自我更新的转录因子发挥作用先后等级特点。

方法小结

构建表达载体用附件1中的引物将小鼠Klf4和Tbx3cDNAs从小鼠胚胎干细胞cDNA中扩增出来。

然后测序，并连入pCAG-IP,pCAG-IN（用neo取代了pCAG-IP中的pac）和pCAG-DsRedT4-IP30载体。

ES细胞培养ES细胞培养条件，稳定的转染，和嵌合鼠形成都依照描述进行。

筛选药物，诱导剂，抑制因子用下列浓度：

1微克\毫升嘌呤霉素；150微克\毫升G418;1微摩4HT;10微摩Jak抑制因子I;5微摩LY294002;25微摩PD98059;10微摩U0126.

定量PCR1微克RNA逆转录合成cDNA,cDNA量相当于2.5纳克RNA用附件中的引物进行定量PCR进行检测。

所有样品用Gapdh作为内参检测三次，最后计算平均值。

免疫染色用下面的抗体和稀释浓度进行免疫检测：

羊抗Tbx3,1:

300;兔抗Tbx3,1:

1000;兔抗Klf4,1:

300;羊抗Klf4;兔抗Nanog，1:

100；鼠抗Oct3\4,1:

1000.

图一Tbx3和Klf4在没有LIF存在的条件下可以维持小鼠ES细胞自我更新

a.在没有LIF存在的条件下建立起转染有Tbx3,Nanog和Klf4载体的小鼠胚胎干细胞克隆。

转染1X107个OCRG9ES细胞，通过检测Oct3\4-CFP表达计算在有和没有LIF条件下干细胞克隆数的比值。

测量三次采用t检验的方法，P取小于0.05。

误差线指据此算出的标准差。

b.转基因小鼠ES细胞在没有LIF存在下的生长情况。

通过GFP报告干细胞标志物分子Rex-1的表达情况。

c.无LIF时转基因胚胎干细胞生长率。

1X105胚胎干细胞接种到90mm培养皿内，并加有嘌呤霉素用来筛选可以Oct3\4的细胞，在培养1-4天内测定细胞数。

误差线指标准差。

d.设计可以移除导入目标基因的表达载体。

将两侧加有Loxp位点的Klf4基因置于CAG控制下。

通过抗性基因Pac筛选稳定转染的细胞。

Cre表达载体的导入可以去除Klf4,使得DsRed表达。

e.来源于DsRed阳性ES细胞的12.5天嵌合鼠胚胎。

带有可剪切掉Klf4转基因载体的EB5ES细胞在无LIF条件下培养1个月，后通过瞬时转染表达重组酶的载体以产生DsRed阳性的Es细胞。

图2无LIF条件下培养的ES细胞系中多能性相关转录因子表达情况

a.无LIF培养四天后，定量RT-PCR分析转基因小鼠ES细胞内各种转录因子的表达情况。

设定有LIF条件下亲本ES细胞内表达水平为1.0。

亲本ES在没有LIF条件下培养4天，基因表达情况也测定出来。

误差线采用标准差。

星号显示与野生型+LIF比较后的差别；井号显示与野生型-LIF比较后的差别。

（P<0.5,n=3）

b.WesternBlot检测转基因胚胎干细胞内各基因表达情况。

c.WesternBlot检测在有\无LIF条件下转基因小鼠内磷酸化Stat3表达情况。

d.共聚焦显微镜观察转基因ES细胞多重免疫染色情况。

Tbx3,Klf4和Nanog分别通过Alexa546,594和647染色。

e.表达基因的ES细胞所占比例分析。

免疫染色评估Rex1-GFP阳性细胞和核内含Tbx3,Klf4或Nanog的细胞，在四个独立的共聚焦显微图像中计数。

f.三种基因表达情况的比例图表。

图3LIF信号通过特异性通路影响Tbx3和Klf4表达

a.去LIF培养24小时EB5SES细胞，定量RT-PCR检测基因表达情况。

设加LIF培养的ES细胞中各基因表达量为1.0。

P<0.5,n=3.

b.LIF激活基因的动力学特点。

EB5SES细胞在无LIF条件下培养21小时。

后设加LIF的时间为t=0,间隔一段时间测定一次基因的表达情况。

P<0.5,n=4

c.在有通路抑制因子时，LIF调节基因表达情况的敏感程度。

先无LIF培养21小时，在加LIF前一小时加入各通路抑制因子（设t=0）。

分别在加入LIF后0,1,24小时测定各基因表达水平。

d.Stat3活化表达产生的影响。

表达Stat3ER的ES细胞在（+Tx-LIF）,（-Tx+LIF）,（-Tx-LIF）条件下培养四天后检测基因表达水平。

e.抑制Stat3产生的影响。

CAG-Stat3F-IP或者CAG-IP转染EB5SES细胞，并在24-48小时培养基中加入嘌呤霉素筛选稳转细胞系。

48小时检测基因表达水平。

f.定量PCR分析无LIF条件下，含AtkER或Stat3ERES细胞内基因表达水平。

转基因ES细胞在-LIF+4HT培养3天后分析基因表达水平。

有LIF条件下培养的EB5SES细胞基因表达水平设为1.0。

g.在3i或有血清培养液中培养OCRG9ES细胞，检测各基因表达水平。

h.各通路抑制因子处理的ES细胞中Tbx3定位。

LIF+抑制因子培养OCRG9ES细胞24小时后，免疫染色方法定位Klf4和Tbx3.

图4LIF信号、转录因子网络通过三条并行信号通路形成环路用以维持胚胎干细胞全能性

Jak-Stat3通路激活Klf4,PI（3）K-Atk通路激活Tbx3,而MAPK通路抑制Tbx3.Klf4和Tbx3激活Sox2和Nanog,最终维持Oct3\4正常表达。

Oct3\4,Sox2,Nanog调节转录因子维持稳定的表达水平。