基因工程在生物柴油原料中的应用.docx

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基因工程在生物柴油原料中的应用

基因工程在生物柴油原料中的应用

生化系班级:

化工103学号:

201000601092名字:

韦仁明

　　摘要生物柴油由于其燃烧性高、污染小、可再生等优点,是传统化石燃料的理想替代能源,并已在世界范围内得到广泛应用。

基因工程技术在生物柴油中的应用,主要集中在提高生物柴油原料的脂类含量上,如对含油植物和含油微藻的研究。

结合国内外主要研究进展,综述了运用基因工程技术提高生物柴油原料脂类含量的8种途径,如超量表达乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、苹果酸酶等。

最后指出:

将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势,通过转录因子途径调控脂类的积累,是未来生物柴油产业发展的重要研究方向。

　　关键词基因工程;生物柴油;应用;脂类含量;微藻

　　社会的发展加速了人类对能源的消耗,能源问题已成为各国亟待解决的世界性问题。

统计显示:

全球石油探明储量仅供生产40年,这更为人类敲响了能源危机的警钟。

此外,化石能源燃烧过程中会产生大量CO2,引起的温室效应将直接影响人类的生存环境。

因此,为解决能源和环境问题,世界各国都在积极地寻找新能源,以应对将来可能发生的能源危机。

生物柴油作为生物能源的一种,越来越得到各国的重视。

与化石柴油相比,生物柴油具有闪点高、燃烧性高、污染小、可再生等优点,是化石燃料的理想替代能源[1]。

　　生物柴油原料的油脂含量是制约生物柴油发展的一大瓶颈。

运用基因工程技术,克隆并特异性表达调控脂类合成相关酶的基因,从而提高生物脂肪酸含量并改变其组分以适应生物柴油发展的需要,是目前解决这一难题的有效手段。

本文结合基因工程技术的应用现状,综述了基因工程在改造生物柴油原料中的研究进展,以期对生物柴油产业的发展提供一定指导。

　1基因工程概述

　　基因工程,又称DNA重组技术,是指在基因水平上,以人工的方法取得目的基因,在体外重组于载体上,形成重组DNA分子,然后将重组DNA分子转入受体细胞进行复制、转录和翻译,从而产生人们所需要的目的基因的产物。

基因工程技术打破了天然物种屏障,人们可以按照主观愿望,将来自不同生物体的DNA片段组合到一起,并获得新的表达产物。

　　基因工程技术促进了生物学的迅猛发展,为解决生命科学领域的一些重大问题提供了强有力的手段,现已广泛应用于农业、医学、食品和环境保护等诸多领域。

如培育抗虫、抗病、抗寒、抗旱农作物新品种,生产基因工程药物和可降解有毒物质的工程菌等。

同样,在生物柴油的生产中,运用基因工程提高生物柴油原料的油脂含量,也逐步取代了传统方法,并取得了显著的效果。

　　2基因工程在生物柴油中的应用

　　生物柴油作为一种新型可再生能源,其生产原料主要为含油植物,如大豆、油菜、棕榈和蓖麻等。

此外,将含油微藻作为生物柴油原料,也在逐渐成为一个新的研究领域。

用微藻生产生物柴油具有更多优势,缪晓玲等[2]利用小球藻生产的生物柴油,不仅具有传统化石柴油相当的密度、粘度和热值,而且具有更低的冷滤点和良好的发动机低温启动性能。

　　迄今,基因工程技术在生物柴油中的应用,主要集中在提高含油植物的脂类含量上。

虽然在含油微藻方面也有一些研究,但也主要借鉴对含油植物的研究方法。

下面结合国内外主要研究方向,综述基因工程在提高生物柴油原料中脂类含量的研究进展。

　　2.1乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）

乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoAcarboxylase,ACCase）是脂肪酸生物合成的关键酶,它催化脂肪酸合成的第一步反应,即催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A[3-6]。

生物中的ACCase有2种类型:

一是异质型,存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物等的质体中,由BC（生物素羧化酶）、BCCP（生物素羧基载体蛋白）、α型CT（羧基转移酶）和β型CT（羧基转移酶）等4个亚基组成[7-8];二是同质型,存在于动植物、酵母、藻类等的胞质溶胶中,由单亚基组成[9-12]。

有研究表明,植物脂肪酸含量与ACCase的活性呈正相关。

为了提高含油植物的脂肪酸含量,许多研究者进行了超量表达ACCase的试验。

其中,Roesler等将一个叶绿体转移肽和napin启动子与拟南芥同质型ACC1基因融合,然后转化甘蓝型油菜。

结果发现,转基因油菜的T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍,总的含油量约增加了5%。

由于ACCase过量表达,也改变了种子脂肪酸的组成[13]。

Ohlrogge等[14]用同样的方法转化油菜,获得的转基因油菜T1代成熟种子中ACCase的活性增加了1.7~1.9倍,脂肪酸含量增加了6%。

　　许多学者研究了ACCase不同亚基在脂肪酸合成中的作用。

Alisa等克隆和表达了油棕β-羧基转移酶基因（accD）和生物素羧化酶基因（accC）,研究表明accD基因的表达在维持异质型ACCase的水平及植物种子的含油量中起着最重要的作用。

这个研究也首次证明了高水平accD基因的表达,会产生高水平的含油量[15]。

此外,Madoka等[16]、Kode等[17]分别采用超量表达和基因敲除技术方法研究了accD基因,结果显示accD基因编码的β-CT亚基是ACCase的限制因子。

对于含油微藻乙酰辅酶A羧化酶的研究比较少,Dunahay等[18]首次报道了含叶绿素微藻的遗传转化。

在此试验中,他利用硅藻的遗传转化系统,超量表达ACCase基因（acc1）,初步结果显示,转基因硅藻中ACCase的活性增加了2~3倍。

　　2.2脂肪酸合成酶（FAS）

　　脂肪酸合成过程中,乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶催化转变为丙二酰辅酶A后,脂肪酸合成酶（FAS）就以丙二酰辅酶A为底物,继续进行脂肪酸的合成[19]。

在植物中,FAS由ACP（酰基载体蛋白）和其他6种酶构成。

其中,Dehesh等克隆了编码菠菜酮酰-ACP合酶（KASⅢ）的cDNA基因,使其在烟草、拟南芥和橄榄型油菜中超量表达。

结果与正常植株相比,饱和脂肪酸（16∶0）都有所增加,不饱和脂肪酸含量下降[20]。

　　2.3酰基辅酶A:

甘油二酯酰基转移酶（DGAT）

　　酰基辅酶A:

甘油二酯酰基转移酶（acylCoA:

diacylgy-cerolacyltransferase,DGAT）是一种完整的内质网细胞微粒体酶,是催化三酰甘油（triacylgycerol,TAG）合成的最后一步反应的酶,也是甘油三酯合成过程中唯一的关键酶和限速酶。

该酶的主要作用机制是使二酰甘油（diacylgycerol,DAG）加上脂肪酸酰基辅酶A形成三酰甘油[21-24]。

Jako等首次在野生型拟南芥中,超量表达了种子特异性DGAT的cDNA,结果DGAT的活性增加了10%~70%,种子含油量也有显著增加[25]。

Zhang等构建了特异hpRNA（具发夹结构的双链RNA）,用它沉默烟草内源性DGAT1基因,转基因植株的成熟种子含油量下降了9%~49%[26]。

　　2.4乙酰辅酶A合成酶（ACS）

　乙酰辅酶A合成酶不可逆的催化醋酸形成乙酰辅酶A,而乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。

Roughan等发现乙酰辅酶A合成酶可以将醋酸转化为乙酰辅酶A,并进入脂类合成途径[27]。

Lin等在大肠杆菌体内超量表达了其自身乙酰辅酶A合成酶基因（acs）,与对照组相比,乙酰辅酶A合成酶的活性增加了9倍,同时也加速了脂类的生物合成[28]。

　　2.5ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）

　　ATP-柠檬酸裂解酶催化柠檬酸形成乙酰辅酶A和草酰乙酸,乙酰辅酶A可以为脂类的合成提供原料。

Ratledge等研究了ACL的活性与甘蓝型油菜种子脂质积累的关系,发现在种子快速合成脂质过程中,ACL和乙酰辅酶A羧化酶一样,其活性达到最大[29]。

Rangasamy等研究了老鼠肝脏ACL基因在烟草质体中的异源超量表达,结果表明超量表达老鼠ACL基因,使烟草质体中总ACL活性增加了4倍,脂肪酸的合成也增加了16%[30]。

　　2.6苹果酸酶（ME）

　　苹果酸酶以NADP+为辅酶,催化苹果酸脱氢产生丙酮酸和NADPH,NADPH可用为脂肪酸合成中的还原反应。

于是有人提出通过超量表达苹果酸酶,为脂肪酸合成提供充足的还原动力,从而达到提高脂肪酸含量的目的。

Wynn等[31]发现苹果酸酶为构巢曲霉（Aspergillusnidulans）的脂质积累提供主要的还原动力NADPH。

随后,Wynn等又进一步研究了NADPH与脂质积累之间的关系。

即在丝状真菌中超量表达苹果酸酶,结果有大量NADPH生成,为脂类的合成提供了充足的还原动力,同时也增加了脂质的积累[32]。

Zhang等在卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）中超量表达了苹果酸酶,结果发现苹果酸酶的活性增加了2~3倍,同时脂质的生物合成也增加了2.5倍[33]。

　2.7β-氧化途径

　　脂肪酸的β-氧化途径,是生物体内脂肪酸降解的主要途径,它发生于原核生物的细胞溶胶及真核生物的线粒体基质中。

因此,有研究者提出限制脂肪酸β-氧化途径的发生来提高含油植物的脂类含量。

其中,Hara等用念珠菌研究了β-氧化途径中的关键酶——酰基辅酶A氧化酶,阻断对该酶所有基因的编码,并希望能增加二羧酸的生成。

但结果相反,重组体念珠菌不能利用烷烃,也不能生产二羧酸[34]。

由于直接对β-氧化途径关键酶的研究有一定的局限性,Cao等从酯酰辅酶A跨膜转运的角度,对提高念珠菌二羧酸生成进行了研究。

在其研究中,通过对肉碱-酯酰转移酶（CAT）基因在重组体中的特异表达,发现当CAT的活性减少1/2时,二羧酸的产率增加了21.0%,对烷烃的转化能力增加了12.0%。

但是,如果将CAT基因全部敲除,则重组体不能利用烷烃生产二羧酸[35]。

　　2.8磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPase）

　　许多研究者发现油菜蛋白质含量与油脂含量呈负相关,于是有人提出对应的反义技术调控植物油脂含量。

陈锦清等[36]提出油脂和蛋白质的“底物竞争”假说,认为葡萄糖酵解产物——丙酮酸是油脂和蛋白质合成的共同底物,2种物质在合成中竞争丙酮酸。

乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）和丙酮酸羧化酶（PEPCase）分别是这2种物质合成的关键酶,它们的相对活性就决定了丙酮酸的流向。

在这项研究中,他将根癌农杆菌EHA101携带反义PEP基因,然后转化甘蓝型油菜——浙油758和浙优油1号的下胚轴,成功地获得了转基因植株。

对浙油758转基因植株的含油量测定显示,种子平均含油量比对照组高6.4%。

对浙优油1号转基因植株的油脂及蛋白质含量测定表明,种子平均含油量比对照组高16.7%,其中1株油菜蛋白质含量下降9.7%。

对转基因植株及对照组种子的油脂和蛋白质含量进行回归分析表明,2种植株的油脂和蛋白质含量呈显著负相关。

张银波等构建了PEP基因的RNAi载体,希望通过抑制蛋白质的合成以使丙酮酸转向油脂的合成。

由于RNAi技术的有效性及简易性,若该载体成功实现抑制目的基因,则可以为高油作物的培育开辟新的途径[37]。

微藻PEPase的研究借鉴对含油植物的研究方法,其中宋东辉等采用反义PEP技术调控微藻PEPase的代谢途径,初步结果显示,反义抑制PEPase酶活性可以显著提高微藻脂类含量[1]。

　　3结语

　　生物柴油具有可再生、污染小、燃烧性高等优点,是一种新型环保可再生能源,具有极广阔的应用前景。

目前,世界生物柴油的生产原料主要为含油植物,但根据我国食用油尚需大量进口的情况,不可能将植物油大规模用于生产生物柴油。

而且我国土地资源有限,大幅度增加含油植物种植面积难度很大。

因此,若要大规模发展我国生物柴油产业,必须寻找其他的生物柴油原料。

利用微藻生产生物柴油可以很好地解决上述问题。

微藻生长周期短,生长速率快,光合作用效率高,而且不占用农业用地,可以利用微生物发酵技术,在光反应器中高密度培养。

因此,将微藻作为生产原料是我国生物柴油产业发展的必然趋势

　　目前,国内外运用基因工程技术