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gbk鲍曼不动杆菌检测分析手册1
鲍曼不动杆菌检测分析手册
一、分类和基因组特征
鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）属于莫拉氏菌科（Moraxellaceae），不动杆菌属，不动杆菌属命名于1986年，基于DNA-DNA杂交试验，已有21个基因种（genomospecies）被确定（4,32），其中只有7种有正式的命名。
鲍曼不动杆菌属于基因种2，是不动杆菌属中临床最常见的一种。
目前为止完成全基因组测序的鲍曼不动杆菌共有3株，多重耐药株AYE、全敏感株SDF、ATCC17978（10,31），其基因组信息见表1-1。
多重耐药株AYE携带3个质粒，但是令人惊讶的是这3个质粒没有携带任何已知的耐药相关基因。
在AYE染色体中共有52个基因被预测与抗性相关（其中只有7个在SDF中也有分布），其中有45个抗性基因紧密地集合在一个86kb的抗性岛中，是目前发现的最大的抗性岛（10）。
该抗性岛打断了一个“putativeATPase”读码框，该插入位点在SDF也发现伴有插入（19.6kb—25ORFs），都伴随着“ACCGC”的同向重复。
目前为止AYE和SDF的基因组序列还没有在网上公布，关于这两个基因组的其他信息还有待进一步公布。
表1-1 测序株基因组信息
菌株号
基因组大小
G+C含量
携带质粒大小
基因组岛
AYE
SDF
ATCC17978
3.9Mb
3.2Mb
3.9Mb
38.8%
38.2%
38.9%
5，9，and94kb
6kb，25kb
13.4kb，11.3kb
86kb抗性岛
19.6kb基因岛
28个（16个毒力相关）
二、临床特征
鲍曼不动杆菌为条件致病菌，一般认为对健康个体不致病，但可使虚弱个体感染。
可以引起肺炎、烧伤感染、伤口感染、脑膜炎、尿路感染、腹膜炎、心内膜炎、骨髓炎、关节炎等，并可进一步发展为败血症。
鲍曼不动杆菌感染往往存在混合感染，如19%～35％的败血症病例为多菌感染（29），所以临床表现不典型。
１．肺部感染就感染来源而言，既有外源性感染，又有内源性感染。
口咽部菌体的吸入，很可能是内源性感染的主要发病机制。
常有发热、咳嗽、胸痛、气急及血性痰等表现。
肺部可有细湿啰音。
肺部影像常呈支气管肺炎的特点，亦可为大叶性或片状浸润阴影，偶有肺脓肿及渗出性胸膜炎表现。
２．伤口及皮肤感染手术切口、烧伤及创伤的伤口，均易继发不动杆菌皮肤感染，或与其他细菌一起造成混合感染。
临床特点与其他细菌所致感染并无明显不同。
多无发热。
偶可表现为蜂窝织炎。
３．泌尿生殖系统感染不动杆菌可引起肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎、阴道炎等，亦可呈无症状菌尿症，但临床上无法与其他细菌所致感染区别，其诱因多为留置导尿、膀胱造瘘等。
４．菌血症菌血症为不动杆菌感染中最严重的临床类型，病死率达30%以上。
多为继发于其他部位感染或静脉导管术后，少数原发于输液、包括输注抗生素、皮质类固醇、抗肿瘤药物等之后。
有发热、全身中毒症状、皮肤瘀点或瘀斑以及肝脾肿大等，重者有感染性休克。
少数可与其他细菌形成复数菌菌血症。
５．脑膜炎脑膜炎多发于颅脑手术后。
有发热、头痛、呕吐、颈强直、凯尔尼格征阳性等化脓性脑膜炎表现。
鲍曼不动杆菌感染部位主要是下呼吸道，多见于胸肺部手术、机械通气患者、年老体弱者，其次是手术创口及泌尿系统感染。
医院内鲍曼不动杆菌感染主要集中于重症监护病房,重症监护病房鲍曼不动杆菌感染又主要集中于呼吸科。
近几年来由于多重耐药菌株的迅速增加，鲍曼不动杆菌已经在全世界成为最难以治疗和控制的院内获得性感染（16）。
四、流行病学特征
不动杆菌在自然界广泛存在，土壤和淡水样本中几乎都可以分离到不动杆菌
（2）。
在医院内的加湿器、呼吸机、医务人员皮肤、床垫、枕头等物品表面也可分离到不动杆菌（7,30,37）。
有研究发现，在家具的塑料贴膜表面，鲍曼不动杆菌可存活25天（14），而其他的革兰阴性杆菌如大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的存活时间均少于24小时。
不动杆菌不仅在自然界广泛存在，还经常在动物和人类的皮肤表面定植。
一般认为，由于其在皮肤表面的定植，医务人员通过手的接触可造成该菌的污染和扩散。
不动杆菌在物体表面和体表的持续存活，是其成为医院感染病原菌的重要条件。
鲍曼不动杆菌还具有显著的快速建立耐药性的能力，几十年内就可以建立多重耐药
（2），其中的部分菌株甚至对目前所有已知的抗生素均耐药（36）。
在20世纪70年代左右，鲍曼不动杆菌还对大部分抗生素均敏感，但由于抗生素的广泛使用，鲍曼不动杆菌获得了广泛的耐药。
由于鲍曼不动杆菌具有在干燥环境的生存能力，及快速获得耐药性的能力，现已在世界范围内成为院内感染的主要病原体。
在欧洲，鲍曼不动杆菌在ICU（intensivecareunits）病房内引发的院内感染占到了革兰氏阴性菌感染的2%~10%（12），而美国则占到了2.5%（17）。
随着耐药菌株的日益增多，鲍曼不动杆菌感染已经成为许多国家重要的公共卫生问题。
由于感染A.baumannii的病人往往已经患病严重或者免疫抑制，所以继发感染多重耐药A.baumannii后往往致死率会大大提高，有文献报道重症监护病房病人感染抗性不动杆菌后死亡率会提高3倍左右（24）。
不动杆菌是条件致病菌，好发于病情严重、免疫力低下的患者，医院感染多于社区获得性感染。
只有了解不动杆菌感染的危险因素，才能有针对性地采取防止其定植和感染的措施。
目前已证实的危险因素主要包括：
严重基础疾病、既往感染或败血症、长时间使用呼吸机、抗生素（特别是三代头孢菌素和碳青霉烯类）治疗史、不动杆菌体表定植史、长期在ICU病房住院、静脉插管、创伤性诊疗措施、静脉高营养和粒细胞减少等（2,15,19）。
这些因素同样也是许多其他革兰阴性杆菌感染的危险因素，并非不动杆菌所特异，但有报道认为鲍曼不动杆菌的流行与抗生素的压力关系密切（6）。
鲍曼不动杆菌感染的流行病学特征总结如下：
1．传染源：
绝大多数为医院获得性感染，污染的院内环境、医疗器械、人员的携带均可构成传染源。
2．传播途径及传播条件：
虽然鲍曼不动杆菌广泛存在于自然界和医院环境，但其储存库和感染源主要是医院环境和物件（包括各种医疗设备、空调、湿化装置等）以及住院患者。
主要传播途径为接触传播和空气传播，一般认为不动杆菌对健康个体是不致病的，但可使虚弱个体感染。
危险因素包括抗生素处理，外科手术，使用侵入性仪器及ICU病房的长期滞留等。
3．易感性：
鲍曼不动杆菌为条件致病菌，广泛存在于自然界和体表，一般认为健康个体不易感，但高龄、免疫抑制、外伤、长期接收抗生素治疗、接受侵入性医疗过程、长期住院或ICU病房滞留的患者易感。
4．流行特征：
鲍曼不动杆菌感染的流行没有明显发病季节，一年四季均可发病。
绝大多数为医院获得性感染。
危险因素主要与患者病情严重程度、治疗干预强度、免疫力、基础心肺功能、接受多种侵袭性操作、机械通气、广谱抗生素使用等有关，这些决定了它在院内的分布以ICU、血液、移植、烧伤等病房多见。
它主要引起医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎、菌血症、尿路感染、脑膜炎等，其中在机械通气患者中引起的下呼吸道感染已越来越受临床的关注。
六、菌株保存
对鲍曼不动杆菌的长期保存可采用冻存的方法，保存液配方见附录，也可用冻干方法。
短期保存可采用灭菌滤纸或保存液-20℃保存。
七、培养基和培养条件
鲍曼不动杆菌为专性需氧菌，营养要求不高，普通培养基上生长良好，最适生长温度35℃，可在麦康凯培养基上生长。
常用培养基有血平皿、营养琼脂、伊红美兰琼脂平板、MH琼脂等，液体培养基常用营养肉汤、MH肉汤等。
具体培养基配方见附录。
八、形态学特征
鲍曼不动杆菌为革兰氏阴性菌，球杆状，无芽孢、无鞭毛，单个细胞大小为（1～1.5μm）×（1.5～2.5μm），有时很难脱色，通常成对排列。
在静止生长和非选择性琼脂，以球杆状形态为主，而在液体培养基中的早期培养物和在含抗细胞壁的抗生素平板上的培养物，多为杆状（见图８－１）。
菌落光滑，不透明，比肠杆菌科成员的菌落略小一些，菌落为无色或略带粉色。
图８－１ 鲍曼不动杆菌革兰氏染色图片
九、生物化学鉴定
1．API20NE（BioMérieux，REF20050）——非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统，包括8个标准化测试和12个同化试验。
见表9-1。
但由于鲍曼不动杆菌与醋酸钙不动杆菌同属于Acb复合体（A.calcoaceticus-A.baumanniicomplex），仅从生化表型难以区分，所以鉴定结果均为A.baumannii/A.calcoaceticus。
而且该试条只覆盖了不动杆菌属中7种已命名的不动杆菌（A.baumannii/A.calcoaceticus,A.haemolyticus,A.junii/A.johnsonii,A.lwoffii,A.radioresistens），如果要准确鉴定到鲍曼不动杆菌，或不动杆菌属除以上7种已命名的不动杆菌之外的其他种还需要进一步的分子生物学试验。
图9.1-1 API20NE鉴定系统（鲍曼不动杆菌）
表9.1-2API20NE质量控制菌株试验结果
NO3
TRP
GLU
ADH
URE
ESC
GEL
PNPG
GLU
ARA
MINE
MAN
NAG
MAL
GNT
CAP
ADI
MLT
CIT
PAC
OX
1
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-*
-
+
2
+
-
-
V
V
-
+
-
+
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
4
-
-
-
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
附注：
*可能只产生微弱反应
标准菌株如下：
1－Aeromonashydrophilia（嗜水气单胞菌）ATCC35654
2－Pseudomonasaeruginosa（绿脓假单胞菌）ATCC27853
3－Alcaligenesfaecalis（粪产碱菌）ATCC35659
4－Sphingobacteriummultivorum（多食鞘氨醇杆菌）ATCC35656
2．触酶（catalase）试验：
按无菌操作技术，将细菌涂抹至载玻片上，加１～２滴３％过氧化氢水溶液，若迅速冒出气泡，则为阳性反应，表示细菌含有可将过氧化氢分解为氧气和水的触酶。
十、血清学鉴定
无
十一、毒力基因检测
鲍曼不动杆菌被认为是较低级的病原菌，对于其毒力因子的研究目前还处于初级阶段，有报道用PCR的方法检测了目前大肠杆菌（UropathogenicE.coli）已知的17个已知的毒力因子基因，但均为阴性（5）。
相信随着近期鲍曼不动杆菌全基因组测序工作的完成，毒力因子的确立与检测工作会得到进一步的发展。
十二、生物分型
无
十三、分子分型
1． PFGE
脉冲场凝胶电泳（PFGE）是目前鲍曼不动杆菌菌株分型中较成熟、较常见的分型方法，常用于确定疫情的暴发以及传染源。
2．MLST
多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST）不仅可以应用于分子流行病学研究，还可以用来研究微生物的遗传种群结构（populationgeneticstructure）。
鲍曼不动杆菌的MLST方法是通过扩增7个管家基因的内部片断，进行序列比对，并通过不同等位基因的排列组合来确定基因型。
（2）等位基因的比对
由于等位基因的鉴定是通过7个管家基因内部片断的序列比对来进行，所以扩增产物经测序后得到的序列必须经过剪切才能在数据库中进行比对。
由于单碱基变异也能产生新的等位基因，所以基因序列必须通过双向测序获得，并保证100％正确。
剪切后的7个管家基因序列可以单独或同时进行网上数据库比对，如果序列对应于数据库的已知等位基因，将会得到相应的等位基因号（allelenumber），如果鉴定为新的等位基因，需进一步与最相近的等位基因进行人工比对，确认差异是否确实存在。
经确认后，把测序彩图提交给数据库管理员（karen.mcgregor@tvu.ac.uk），验证后将会得到新的等位基因号。
任何与搜库菌株具有相同或相近等位基因谱（alleleprofile）的菌株信息可直接点击搜库结果中的菌株名而获得。
当菌株数量较多时，也可用batchquery菜单同时输入多个菌株的数据来进行搜库。
3． MLVA
由于鲍曼不动杆菌的全基因组测序工作刚刚完成，还没有开展MLVA方面的工作。
4． 其他分型方法
（1） 质粒指纹图谱：
主要利用碱裂解法、商用试剂盒等提取质粒的方法提取质粒，电泳比较菌株质粒构成谱。
缺点为还没有标准化，不同的提取方法或试剂盒可能部分菌株的部分质粒丢失等。
（2） 外膜蛋白谱：
提取外膜蛋白后通过SDS-PAGE电泳对不同菌株进行比较，缺点为不同培养条件不同实验室的数据间难以比较。
（3） 随机引物扩增：
十四、鉴定程序和标准
1．鉴定程序
不动杆菌的鉴定程序见下列流程图
37℃18～24h
尿液、痰液、脓液、血液、脑脊液
直接涂片
革兰染色
镜检
分离培养（血平板）
可疑菌落
ARDRA
最后报告
涂片革兰染色
革兰阴性球杆菌
氧化酶阴性
动力
阴性
KIA
底层斜面不变色
全面生化反应
PCR
2．鉴定方法
（1）分离培养
根据采样部位的不同，细菌分离培养的方法略有不同。
①尿液标本：
吸取尿液5-10ml置无菌试管中，3000-4000r/min离心30min，倾去上清液，取沉渣涂片，革兰染色后镜检。
取1l标准环尿液在血平皿上按四区法划线，37℃培养18-24小时，血平皿有菌落生长→做菌落计数（CFU/ml），分纯待进一步鉴定。
②脑脊液标本，浆膜腔穿刺液（胸水、腹水、关节液、心包液等）标本：
采用直接涂片，革兰氏染色。
标本→离心15min（1500g）→将已离心的沉淀物做革兰染色→根据革兰染色的细菌形态，初步提示感染细菌的种类。
接种血平皿按四区法划线，放37℃培养18-24小时，血平皿有菌落生长，分纯待进一步鉴定。
同时将标本接种营养肉汤进行增菌培养，37℃培养18-24小时后，取增菌液接种血平皿放37℃培养18-24小时，如果血平皿有菌落生长，分纯待进一步鉴定。
③鼻、咽部拭子：
拭子采用直接涂片，革兰氏染色。
同时拭子直接接种血平板按四区法划线，37℃培养18～24h，分纯待进一步鉴定。
④脓汁和创伤感染标本：
将标本直接接种血平板按四区法划线，37℃培养18～24h，分纯待进一步鉴定
⑤血液标本：
标本采集后立即进行传统肉汤增菌或自动血培养仪检测法增菌。
若指示有细菌生长，立即用注射器无菌法抽取阳性瓶中培养物作涂片、革兰染色、显微镜检查做初步判断；同时接种血琼脂平皿，37℃需氧培养。
⑥痰标本：
不含或含粘液很少合格标本，可直接接种。
遇有含大量粘液的标本，应加入等量液化剂sputosol（一种商品化的痰液溶解剂），作用20min溶解粘痰，使痰液均质化后接种。
将处理后的痰液接种于血琼脂平板、37℃培养18～24h，分纯待进一步鉴定。
如24h无细菌生长应再放置24h，再观察菌落生长情况，如仍无生长则定为阴性。
已接种的培养基需连续培养观察3d，确认无疑似鲍曼不动杆菌落出现时方可经高压灭菌后弃去。
可疑菌落经分纯后，接种2个血平板，分别置于35℃和44℃培养箱中培养18～24小时（44℃生长可将鲍曼不动杆菌和genomospeciesTU13与其他不动杆菌区别开来）。
获单个纯菌落后按API-20NE系统操作指南接种于生化鉴定条上，进行菌种鉴定。
补充触酶、动力、及分子生物学鉴定方法。
接种KIA斜面。
（2）革兰氏染色：
鲍曼不动杆菌镜检可见革兰染色阴成双排列的球杆菌，形状似奈瑟菌。
（3）尿液菌落计数
取1l接种环尿液所生长的菌落数乘以1000，即为每ml的菌落数（CFU/ml）。
临床上以细菌数≥105CFU／ml，做为诊断泌尿系感染的重要指标。
诊断泌尿系感染的细菌学标准是：
菌落计数≥105cfu／ml，才有诊断价值。
（4）生化鉴定：
不动杆菌属一般特性为：
革兰氏阴性、需氧、无动力的双球菌或球杆菌，触酶阳性、过氧化酶阴性。
生化反应的一般性状为：
氧化酶阴性，触酶阳性，无动力，吲哚阴性，不发酵糖类，不还原硝酸盐。
操作方法为挑取纯培养的细菌进行生化鉴定，采用API20NE鉴定系统，补充触酶、动力试验，具体方法见生物化学鉴定部分。
动力试验：
用无菌操作技术，灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可，置37℃温箱培养，次日观察结果。
无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动力的细菌使培养基呈现混浊样，穿刺线甚至难以看出。
（5）KIA鉴定结果：
底层及斜面均不变色。
（结果判定标准为，产生H2S：
中层或底部变黑；葡萄糖分解：
斜面变红，中层为黄色；乳糖发酵：
中层及斜面变黄；产气：
中层有气泡或破碎）。
（6）扩增核糖体DNA限制酶切分析（amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis，ARDRA）
十五、确诊感染必须的实验室结果
鲍曼不动杆菌是一种条件致病菌，常在患有各种基础疾病及使用广谱抗生素的病人中继发感染，临床症状不典型，且往往存在混合感染，因此鲍曼不动杆菌感染的诊断需特别慎重。
主要依靠不同部位感染的临床表现和分离到病原。
败血症、心内膜炎、肺炎、脑膜炎等的临床表现虽也有一定的特征，但难以与其他病原菌所致者鉴别，因此诊断的确立有赖于病原菌的发现及鉴定。
十六、需要鉴别的细菌
1． 醋酸钙不动杆菌：
生化表型与鲍曼不动杆菌非常接近，可用ARDRA方法加以鉴别，详见鉴定方法部分。
2．溶血不动杆菌：
在血平板上可产生β溶血，另外也可以使用API20NE生化试纸条加以鉴别。
3．其他不动杆菌：
可以使用API20NE生化试纸条加以鉴别。
4．铜绿假单胞菌，粪产碱杆菌：
可以使用API20NE生化试纸条加以鉴别。
十七、抗生素敏感试验
1． 常用抗生素
鲍曼不动杆菌是一种条件致病菌，常在患有各种基础疾病及使用广谱抗生素的病人中继发感染，并对常用的抗生素有广泛的耐药性。
并且鲍曼不动杆菌可快速获得对头孢菌素及氟喹诺酮的耐药,使碳青霉烯几乎成为惟一的治疗选择,而鲍曼不动杆菌在接受转导的D组β-内酰胺酶后可导致对碳青霉烯的高水平耐药（MIC≥16mg/L）（39）。
而对亚胺培南耐药不动杆菌通常仅对多黏菌素或舒巴坦有效（9）。
所以鲍曼不动杆菌治疗的关键是尽快找到敏感的抗生素。
目前不动杆菌的耐药率呈上升趋势，有的上升较快（如环丙沙星），耐药率一直保持在较高水平的有氨苄西林、头孢唑啉及氯霉素等。
耐药率尚较低的有亚胺培南-西司他丁、头孢他啶、头孢哌酮-舒巴坦、氨苄西林-舒巴坦，哌拉西林-他唑巴坦及阿米卡星等。
在经验用药阶段，往往首选头孢哌酮-舒巴坦、亚胺培南-西司他丁，还可选用氨苄西林-舒巴坦、替卡西林-克拉维酸、阿米卡星、新一代氟喹诺酮类。
对病情较重者，主张β-内酰胺类与氨基糖苷类（或氟喹诺酮类，或利福平）联合应用。
然后，则根据药敏结果调整选用方案。
2． MIC实验
稀释法可定量测定细菌对抗生素的耐药性，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。
具体操作步骤请参考CLSI/NCCLSM7-A6标准“MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically”。
3． 其他抗生素耐药性实验
（1）纸片扩散法
纸片扩散法使用MH琼脂培养基，接种前菌量调至0.5麦氏标准浓度，培养条件为35℃±2℃，在大气环境中培养20～24小时。
具体操作步骤请参考CLSI/NCCLSM2-A8标准“PerformanceStandardsforAntimicrobialDiskSusceptibilityTests”。
（2）E-Test法
E-Test法与NCCLS的稀释法相比其操作较为简便，MIC值更为精确。
瑞典ABBlODISK公司生产的E-Test试纸条已有很多种抗生素可供选择，所用的培养基和培养条件与琼脂稀释法相同，其结果判读同稀释法MIC标准。
原理：
载体塑料条5×50mm，一面标有ug/ml为单位的MIC读数，另一面则载有干燥而稳定呈连续指数梯度的抗生素，浓度一般为0.016-256ug/ml或0.002-32ug/ml。
当条贴到接种好的琼脂平板表面，条上抗生素立即释放出来，条下方形成连续梯度的浓度。
过夜孵育的细菌沿载体条为中心呈椭圆形抑菌圈，椭圆形抑菌圈与载体条交界处即可读出MIC值（ug/ml）。
4． 结果判读和解释
结果判读参照NCCLS标准.
5． 耐药基因检测
不动杆菌耐药机制复杂，主要包括以下几个方面：
（1）产生灭活酶，目前已经发现的与不动杆菌耐药性相关的灭活酶主要包括：
苯唑西林酶（oxacillinases，OXA）、金属β—内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL）、头孢菌素酶（AmpC）酶和超广谱β—内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamase,ESBLs）。
（2）细菌外膜通透性的改变，
（3）抗生素作用靶位的改变。
（4）细菌细胞膜对抗生素的主动外排机制。
其中灭活酶的产生和和产酶基因的传递又与整合子的作用密切相关。
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