primer 60 引物设计教程.docx
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primer60引物设计教程
primer6.0引物设计教程
首先,需要知道基因序列,如,我们要设计rat的CK18mRNA检测的引物,我们先到http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/这个网站查找CK18mRNA的基因序列,
首先选择Nucleotide然后在搜索栏输入基因序列号(如果不知道基因序列号则输入ratCK18)如图
然后点击搜索,就会出现ratCK18mRNA的基因序列
现在,往下拉就会看到基因序列
将这个序列复制到primer6.0中就可以进行引物设计,
我们先打开peimer6.0
破解版打开会出现这个对话框,关闭即可
将序列复制至这个对话框
点击Add
点击这个图标
出现下面对话框,这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物,我一般不更改,也就是引物可以设计在整个序列,你也可查一下序列有几个区,一般引物应该跨两个区。
之后点击primerParameters
这里可以设置退火温度、引物长度、产物长度等,我一般只是更改产物长度,我一般设为100到300bp,因为如果产物太大,在染料法中会影响扩增效率,
之后点击Search之后出现下面对话框
点击OK出现下面引物序列
这个时候引物设计完成,我们需要对引物进行验证,我一般到NCBI(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上验证,进去后点击最下面菜单中的BLAST
点击这个图标
之后点击Primer-BLAST
将前引物复制到图中位置
将后引物复制(注复制前引物用CopySensePrimer,复制后引物用CopyAnti-sencePrimer点击右键即出现复制菜单)
后引物放到下图位置
之后将图中位置的homosapiens删除后输入rat
出现上图对话框时选择Rattus(taxid:
10114)
之后点击GetPrimers
点这里
这时会出现下图情况,因为服务器在国外,请耐心等待
之后出现
他能扩增很多大鼠基因,如CK18产物为126bp,Ahsg产物795bp,但是除了CK18其他基因扩增是产物较大,而且有点突变,所以在PCR反应时这些东西是扩增不出来的,也就是说这个引物的特异性不错,在扩增时只会扩增出我们需要的CK18这个基因,所以这个引物我们就可以订出去,找公司合成。
有的时候这样的引物也不一定就可以用,所以当我们收到合成好的引物后,可以做一下预实验,看这个引物是否真的可以用,在需要引物时我们也可以到文献中查找,一般发表在全球著名杂志中的外文文献里的引物都是可以用的,查找是要注意文献中用的是染料法还是探针法,探针法的引物在染料法种效果不佳,应该舍弃,选择染料法的引物。