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临床微生物实用手册

临床微生物实用手册

（内部资料）

试剂配制

1、革兰氏染液

①甲液：

结晶紫：

1.25g95％酒精：

50mlDH2O：

450ml

②乙液：

Na2CO3：

6.25gDH2O：

500ml

③碱性碘液：

I2：

6.0gKI：

12.0gNaOH（1mol/L）：

270ml待KI完全溶于DH2O，后，再加I2

④丙酮酒精液：

95％酒精：

70ml丙酮：

30ml

⑤碱性复红水溶液：

碱性复红：

8g95%酒精：

100LDH2O：

900m

2、抗酸染液（萋－尼）

1．石炭酸复红染液：

（1）储存液

①碱性复红液：

碱性复红8g，加95%乙醇至100ml，充分振荡使复红溶解。

②5%石炭酸水溶液：

40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸5g溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml。

（2）石炭酸复红工作液：

经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml与5%石炭酸水溶液90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。

2．5%盐酸乙醇脱色液：

35%浓盐酸5ml与95%乙醇95ml混合。

3．亚甲蓝复染液：

（1）储存液：

亚甲蓝0.3g溶于95%乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。

（2）亚甲蓝复染液：

以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06%，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。

3、甲基红试剂

①甲基红：

0.2g②95％酒精：

300ml③DH2O：

200ml

配制：

将甲基红称入乳钵内，加1mol/LNaOH10ml左右（提高甲基红溶解度），碾磨，加入酒精300mlDH2O180ml，混匀后，再加入1mol/LHCL10ml左右，中和其中的NaOH，最后试剂弱带酸性

4、靛基质试剂

①对二甲氨基苯甲醛:

5.0g②纯戊醇或正丁醇:

75ml③浓盐酸:

25ml

配制：

浓盐酸要待对二甲氨基苯甲醛溶解于纯戊醇后，再一滴滴徐徐加入

5、伏－波（VP）试剂

甲液：

a萘酚：

6.0g无水乙醇：

100ml乙液：

KOH：

40g肌酸：

0..3gDH2O:

100ml

注：

甲液应储存于棕色瓶中

5、100g/L去氧胆酸钠溶液

①去氧胆酸钠：

5g②0.1mol/LNaOH：

5ml③溶解后加DH2O45ml

于冰箱可保存半月有效。

6、氧化酶，细胞色素氧化酶

①10g/L盐酸二甲基对苯二胺（或）四甲基对苯二胺）水溶液

②10g/La－萘酚乙醇液

7、硝酸盐还原试剂

①甲液：

对氨基苯磺酸：

0.8g5mol/L醋酸：

100ml

②乙液：

a－萘胺：

0.5g5mol/L醋酸：

100ml

8、6g/L酚红指示剂

酚红：

3g1mol/LNaOH：

10ml1mol/LHCL：

10mlDH2O：

480ml

配制：

将酚红放入乳钵内加NaOH研磨，加DH2O280ml，无水乙醇200ml混匀后，加入HCL混匀。

配好后液体应为透明橙红色。

染色

1、革兰氏染色法

试剂：

①结晶紫②碳酸钠溶液③碱性碘液④丙酮酸酒精

⑤碱性复红水溶液

方法：

1.将标本均匀涂布于洁净玻片上，自然干燥，火焰微热固定

2.滴加结晶紫（革兰甲液）和碳酸钠液（革兰乙液）各2滴，初染30秒钟，水洗。

3.用碱性碘液2滴固定30秒钟，水洗

4.用丙酮酸酒精脱色至无兰色脱落为止（约5－10秒），水洗。

5.用碱性复红水溶液复染5秒钟，水洗待干镜检。

结果：

革兰氏染色阴性细菌在视野下呈淡红色。

革兰氏阳性细菌呈深紫色

注意事项：

1.涂片应均匀，厚薄适宜，应自然干燥后再加微热固定。

以热而不烫手为易，过热易使细菌变形。

2.脱色要至无兰色脱落为止。

3.复染时间不可过长，以免细菌均染成G—菌。

4.枯草杆菌，链球菌有时染成紫红色，是因为细菌繁殖代谢中有紫色嗜变性，不一定全是染色原因，所以要根据其菌体形态加以确定。

2、抗酸杆菌染色

试剂：

①石碳酸复红溶液②盐酸酒精溶液③碱性美兰溶液

方法：

1.加满石碳酸复红溶液在已固定德标本玻片上，加温2－3分钟，使染液即有蒸汽上升又不致沸腾，不时添加染液，以免在受热情况下干凅。

2.倾出染液，以DH2O冲洗后用盐酸酒精溶液脱色，直至玻片无红色为止。

3.DH2O冲洗，用碱性美兰复染1分钟。

4.DH2O冲洗，待干镜检。

结果：

抗酸杆菌被染成红色，背景为兰色。

结核、麻风杆菌为抗酸阳性（奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性）

3、庞氏染色法

试剂：

庞氏染液

方法：

涂片经自然干燥后经火焰固定，滴加庞氏染液2滴，静染3－5分钟后，水洗，待干镜检。

结果：

双级体杆菌菌体呈淡兰色

两端级体呈深紫兰色

报告：

查见双级体杆菌或未查见白喉杆菌

4、墨汁染色查新型隐球菌

试剂：

优质印度墨汁

方法：

取一滴优质印度墨汁或国产优质墨汁于洁净载玻片上，加入待检标本（液体标本需离心后取沉淀）一滴，与之混合，加盖玻片于底倍镜下，将出光调暗，观察菌体及其周围荚膜。

阴性结果：

在高倍镜下可见黑色背景中透明宽厚的荚膜，似晕轮，有较厚的细胞膜，有时可见生芽的。

内有脂质颗粒析出。

注意：

要与白细胞区别。

白细胞无芽出现象、无荚膜、细胞壁薄、无脂质颗粒析出。

5、细菌细胞壁染色法

用途：

观察细菌细胞壁是否缺损

试剂：

甲液：

100g/L鞣酸水溶液乙液：

5g/L龙胆紫

方法：

用无菌生理盐水涂片，将细菌均匀涂布于玻片上，待其自然干燥后，滴加甲液固定15分钟，水洗，滴加乙液染色3分钟，水洗，自然干燥待检。

结果：

有细胞壁的细菌，周边染成紫色，内部无色，缺壁细菌染料可进入菌体，菌体被染成深紫色。

注意事项：

1.所用菌种必须是新分离所得菌

2.涂片需自然干燥，切勿在火焰上固定

6、鞭毛申云氏法（水法）

试剂：

①200g/L鞣酸②200g/L钾明矾③1：

12饱和石碳酸

④碱性复红酒精液

⑤应用液：

取1，2，3，4液个2ml，2ml，5ml，1.5ml混匀,用滤纸过滤后备用

方法：

1.“训练”菌种：

将菌种接种于软琼脂平皿中央（点种），37℃24h后取平板边缘扩散菌，再转软琼脂。

反复几次（视情况而定）。

2.取一洁净玻片，置于桌面，垫高一端，是与桌面呈15o角左右，用洁净滴管在玻片中央滴加一滴蒸馏水，用滴管顺玻片将液滴摸成卵圆形。

3.用接种环挑取一定量平板边缘菌，轻轻乳化于玻片高的一端的液滴边缘，让其自然往下流动5分钟左右。

4.轻轻将玻片放平，滴加与液滴同等量的应用，染色5分钟,用水沿一端（最好是从高的一端）轻轻冲洗，待干镜检。

结果：

菌体呈深紫红色

鞭毛呈淡紫红色

注意事项：

1.所用应用液必须新鲜配制，以配制后2－3天内使用为宜。

所用器皿，特别是玻片必须洁净。

2.所用代测菌应使用多次反复转种软琼脂后的新鲜菌种

3.方法中3项的时间要严格掌握，此步的原理是用蒸馏水：

这种低渗液渗入菌体内，使菌体，鞭毛都发生不同程度的膨胀，时间太长菌体易裂

正确选择需要鉴定的细菌

1、血培养：

主要病原菌：

沙门菌，布氏杆菌，其它革兰阴性杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌

以下菌应视为非致病菌（除非>1次血培养分离出）：

芽孢杆菌属，凝固酶阴性葡萄球菌，草绿色链球菌，棒状革兰阳性杆菌

2、脑脊液培养：

主要病原菌：

B群β溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌

3、咽部标本培养（上呼吸道标本）：

主要病原菌：

A群β溶血链球菌

选择性报告：

溶血隐秘杆菌

咽炎中非致病菌：

金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌，α溶血链球菌，所有革兰阴性杆菌，所有酵母菌

4、痰标本（下呼吸道标本）

主要病原菌：

肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌

非病原菌：

酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌

5、尿培养

主要病原菌：

大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其它革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌

6、生殖道标本培养：

主要病原菌：

淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌，女性细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群β溶血链球菌

非病原菌：

金黄色葡萄球菌，任何革兰阴性杆菌（包括大肠杆菌，变形杆菌），B群β溶血链球菌（仅为孕妇报告）

生殖道标本（女）：

阴道高位拭子：

酵母菌，阴道毛滴虫，细菌性阴道感染

宫颈或宫颈内部：

淋病奈瑟菌，沙眼衣原体，人乳头瘤病毒

肛门或直肠拭子：

淋病奈瑟菌，B群链球菌（+阴道拭子）

7、脓，吸取物或组织标本:

主要病原菌：

金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，其它β溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其它革兰阴性杆菌

非致病菌：

凝固酶阴性葡萄球菌，少量棒状革兰阳性杆菌

8、抽吸物组织标本的厌氧培养：

主要病原菌：

金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，其它β溶血链球菌，铜绿假单胞，其它革兰阴性杆菌，梭状芽孢杆菌，梭菌属，拟杆菌属，其它厌氧菌

非致病菌：

凝固酶阴性葡萄球菌，少量棒状革兰阳性杆菌

9、粪便培养：

主要病原菌：

沙门菌，志贺菌，弯曲杆菌，霍乱弧菌，副溶血弧菌，产毒性大肠杆菌，难辨梭菌（常规实验室检测不出）

常用的细菌鉴定

链球菌科（链球菌属和肠球菌属）的鉴定索引

GPC（椭圆，呈双、短链、长链）

触酶（-）

α溶血β溶血γ溶血

菌落、菌体特征胆汁七叶苷

胆汁溶菌试验杆菌肽CAMP七叶苷-+

optochin（5ug）S黄色素+草链D群

A链马尿酸钠胆汁七叶苷6.5%NaCl

S（溶菌,>15）R+

肺链胆汁七叶苷B链+-+-

--D群G链肠球菌属D链

草绿链球菌群D群

阿拉伯糖甘露醇山梨醇乳糖马尿酸钠

粪肠球菌-++++

屎肠球菌++-+-

鸟肠球菌-+++-

坚韧肠球菌---+-

微球菌科细菌的鉴定索引

GPC（圆形，呈葡萄、双、四联状）

+触酶-

微球菌科链球菌科

菌落、菌体特征

葡萄糖发酵

-+

四联球菌葡萄球菌属

玻片法血浆凝固酶

+-

金黄色葡萄球菌试管法血浆凝固酶

甘露醇发酵

+-

新生霉素（>16mmS）

尿素

麦芽糖发酵

表葡腐葡溶葡

新SRS

尿++-

麦+++

特殊细菌特点：

产单核李斯特菌：

主要存在于脑脊液和血中的病原菌

规则的革兰阳性杆菌，长短不一，β溶血但溶血环不超过菌落边缘，触酶阳性，26℃有动力，35℃无动力

芽孢杆菌属：

（主要病原菌：

炭疽芽胞杆菌）规则革兰阳性杆菌&芽孢（不着色）

可能炭疽芽胞杆菌：

生长迅速，不溶血，菌落粘在一起，无动力

伤寒沙门氏菌

标本采集：

未使用抗生素前提下

第一周分离阳性血液90%粪便10%

第三周分离阳性血液50%粪便85%尿25%

使用抗生素后：

骨髓，玫瑰疹

药物敏感性

超广谱-内酰胺酶（ESBLs）：

克雷伯菌属，大肠艾希氏，

特点：

质粒编码，非边界耐药（青霉素类，头孢菌素，氨曲南）；通常对抑制剂（棒酸、他巴唑、他唑巴坦）敏感。

治疗用药：

碳青酶烯、抑制剂复合类或头霉素

AmpC-内酰胺酶：

肠杆菌属，枸橼酸杆菌属，

特点：

染色体、质粒编码，诱导酶，非边界耐药（青霉素类，头孢菌素1，2，3代，头霉素）对抑制剂不敏感。

治疗用药：

碳青酶烯，头孢4代

抗生素：

青霉素类抗生素

天然青霉素：

青霉素G青霉素V

不产青霉素酶的G+球菌和G-球菌

耐青霉素酶青霉素：

苯唑西林氯唑西林

奈夫西林氟氯西林

产青霉素酶的G+菌和G-球菌

作用机制

青霉素类抗生素作用于细胞壁合成后阶段的酶

阻断肽聚糖合成的最后阶段—肽聚糖链的组装和三维结构的构建。

该阶段由下面几种酶催化完成：

转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶

不同β-内酰胺类抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用

头孢菌素类抗生素

第一代头孢菌素：

头孢噻吩、头孢唑啉等

对G+菌有较强作用

第二代头孢菌素：

头孢呋辛、头孢克洛等

对产β-内酰胺酶的G-杆菌有作用

第三代头孢菌素：

头孢噻肟、头孢他啶等

对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用

第四代头孢菌素：

头孢吡肟、头孢匹罗等

对肠杆菌科细菌和铜绿假单孢菌作用强

头孢菌素类抗生素和青霉素结合蛋白结合,抑制细菌细胞壁合成。

PBP位于质膜，不同的头孢菌素与不同的PBP结合，发生不同的效应，使菌形成丝状体或球体，最终溶解死亡。

其他β-内酰胺类抗生素

单环-内酰胺类抗生素：

氨曲南

对G-杆菌作用强

头霉素类：

头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑

对G+菌和产ESBLS有较好作用

氧头孢烯类：

拉氧头孢-氧头孢烯类衍生物

对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用，对产酶的金葡菌也有一定作用

碳青霉烯类抗生素：

亚胺培南、美洛培南等

对G-杆菌（除嗜麦芽窄食单胞菌外）有很强的活性

β-内酰胺酶抑制剂-与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性

克拉维酸可从链霉菌培养液中分离得到

舒巴坦半合成的酶抑制剂

他唑巴坦半合成的酶抑制剂

青霉素+β-内酰胺酶抑制剂

氨基糖苷类抗生素

链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素

庆大霉素、福提霉素

阿米卡星、奈替米星、地贝卡星

革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性；革兰阴性球菌效果差；革兰阳性球菌有一定活性

大观霉素、丙大观霉素：

淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原体敏感

氨基糖苷类抗生素和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆的结合，抑制MRNA的转录和蛋白合成；造成遗传密码子的错读，产生无意义的蛋白质；吸附在菌体表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏，胞内的K+、腺嘌呤等物质外漏。

喹诺酮类抗生素

第一代喹诺酮类抗生素：

奈啶酸等

大肠杆菌有作用

第二代喹诺酮类抗生素：

环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等

对G+菌和G-菌均有作用

第三代喹诺酮类抗生素（超广谱类抗生素）：

左氧氟沙星、司帕沙星等

对G+菌（如MRS、PRSP、肠球菌）作用强于二代4-8倍

作用机制

作用于DNA旋转酶,干扰细菌DNA的修复和重组

大环内酯类抗生素

常用的有：

红霉素、麦迪霉素等

主要用于G+菌，对苛养菌及厌养菌有作用，对衣原体、支原体、立克次体、螺旋体等有抑制作用

新一代大环内酯类抗生素：

阿齐霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素等

较红霉素有更强的抗菌活性

作用机制

大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。

四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素

四环素类抗生素广谱抗生素米诺环素多西环素等

四环素类抗生素主要与细菌30S核糖体亚单位结合，阻滞氨酰基转移RNA与信使RNA核蛋白体的受位位点的结合，阻滞肽链延伸，抑制蛋白质合成。

氯霉素类抗生素易进入脑组织氯霉素甲砜霉素

氯霉素主要作用于细菌70S核糖体的50S亚基，使肽链延长受阻而抑制蛋白质合成。

林可酰胺类抗生素盐酸林可霉素克林霉素G+球菌、白喉杆菌、破伤风梭菌、厌氧菌、沙眼衣原体

林可酰胺类抗生素与细菌50S核糖体亚基结合，抑制蛋白质合成，并可干扰肽酰基的转移，阻止肽链的延长。

糖肽类抗生素

万古霉素替考拉宁

对G+球菌有强大的活性

多粘菌素B和EG-菌强大的活性

糖肽类抗生素与一个或多个肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成复合物，可阻断肽聚糖合成中的转糖基酶、转肽基酶及D-D羧肽酶的作用

磺胺类药物及增效剂

用于全身感染，口服吸收好：

磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；

用于肠道，口服吸收差：

柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶；

局部应用：

磺胺米隆、磺胺醋酰钠

作用机制

磺胺类药物分子结构中含有对氨基笨磺酰胺，能竟争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶结合，使菌体内核酸合成重要物质辅酶F（四氢叶酸）钝化而导致细菌生长受到抑制。

甲氧苄胺嘧啶（TMP）能与二氢叶酸还原酶结合，抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻而达到抑菌目的。

硝基呋喃类：

用于肠道、尿路感染和外用

呋喃坦啶、呋喃唑酮

干扰细菌体内的氧化还原酶系统，阻断细菌的代谢，产生抑杀细菌的作用

硝基咪唑类：

甲硝唑、替硝唑用于厌氧菌

硝基咪唑类药物被厌氧菌还原而阻断DNA合成，从而阻止DNA的转录复制，导致细菌死亡。

替硝唑可干扰DNA合成，并能穿透细胞膜，快速进入细胞内。

（不断更新完善中）