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手性分子的拆分技术
手性分子的拆分技术
郝婷玉级材料工程
摘要：
对外消旋体实施拆分是获得手性物质的重要途径。
本文综述了外消旋体的拆分方法，主要有直接结晶拆分法、化学拆分法、动力学拆分法、色谱拆分法（含毛细管电泳法）和手性膜拆分法等五大类。
其中,包括目前作为手性拆分主要方法的色谱技术在内的前4类方法,由于批处理能力小、工业放大成本高,不适合大规模生产;相反,膜分离技术具有能耗低、易于连续操作等优点,被普遍认为是进行大规模手性拆分非常有潜力的方法之一,具有良好的应用前景。
关键词：
手性分子；拆分；对映体；外消旋化合物
手性是自然界存在的一种普遍现象,在药物化学领域尤为突出,已知药物中有30%～40%是手性的。
手性是生物体系的一个基本特征,很多内源性大分子物质,如酶、蛋白、核酸、糖,以及各种载体、受体等都具有手性特征。
此外，手性还在医药、食品添加剂、杀虫剂、昆虫性信息素、香料和材料等领域有着深刻影响。
特别是在医药行业，手性药物对映体通过与体内大分子的立体选择性结合,产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程,可能具有不同的药理毒理作用[1]。
随着医药行业对手性单体需求量的增加和对药理的探究，如何获得高纯度手性单体已成为一个令人困扰的问题。
因此,手性药物的分离分析就显得尤为重要。
随着对手性分子认识的不断深入，人们对单一手性物质的需求量越来越大，对其纯度的要求也越来越高。
单一手性物质的获得方法大致有以下三种：
（1）手性源合成法：
是以手性物质为原料合成其它手性化合物，这是最常用的方法。
但由于天然手性物质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会遇到很大困难，而且合成路线步骤繁多，也使得产物成本十分高昂。
（2）不对称合成法：
是在催化剂或酶的作用下合成得到过量的单一对映体化合物的方法。
化学不对称合成高旋光收率的反应仍然有限，即使如此，所得产物的旋光纯度对于多数应用仍不够高；生物的不对称合成具有很高的选择性，反应介质通常为稀缓冲水溶液，反应条件温和，但对底物要求高、反应慢、产物的分离困难，因而在应用上也受到一定的限制。
（3）外消旋体拆分法：
是在拆分剂的作用下，将外消旋体拆分成对映体。
因为化学法合成外消旋体比较简单，这种方法成本相对较低，因而得到广泛应用。
据统计，大约有65%的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物拆分得到的。
本文依据国内外相关文献报道，总结了外消旋体的拆分方法。
迄今,手性拆分技术主要有直接结晶拆分法、化学拆分法、动力学拆分法、色谱拆分法（含毛细管电泳法）和手性膜拆分法等五大类[3]。
1.直接结晶拆分法
对于一个外消旋混合物，其两种对映体常自发地以宏观晶体分别析出，如果这些晶体可以用肉眼区别，那么就可在放大镜的帮助下，用镊子之类的工具将他们拣出分开，从而达到拆分的目的。
这就是所谓的机械拆分法。
机械拆分法的缺点是过于繁琐，不能应用于外消旋化合物和外消旋固体溶液。
Wynbery等[4]用（-）-α-蒎烯作溶剂，通过直接结晶法拆分了类似七环杂螺烯的外消旋体。
但这种方法需要寻找特殊的手性溶剂，且适于拆分的外消旋混合物的范围相当狭窄，故实际工业生产的意义不大。
接种结晶拆分法是机械拆分法的改进。
在一个热的外消旋体混合物的饱和溶液中，加入适量的某一对映体的晶种，适当冷却，则相当量的这一旋光性的对映体从外消旋混合物中析出。
交替加入两种对映体晶种，可以获得两种对映体分子。
对于不生成外消旋混合物的化合物，将其转化成盐，往往可以满足要求，接种结晶拆分法工艺简单，成本较低且效果较好，因此是比较理想的大规模拆分方法，目前该法已经应用在大规模生产氯霉素、（-）-薄荷醇以及抗高血压药甲基多巴等手性药物上。
据统计，这种选择性接种结晶法占规模等于或者大于1kg的生产总量的1/5[5]。
但是在生产过程中为了使外消旋混合物饱和，必须采用间断式结晶，这无疑延长了生产的周期，增加了生产成本。
2.化学拆分法
2.1经典成盐拆分
化学拆分法是通过化学反应的方法，用手性试剂将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映体之间物理性质和化学性质的不同将两者分开。
拆分成功的关键是选择合适的拆分剂。
合适的拆分剂应该易与对映体生成非对映体，且溶解度差别较大，经拆分后，又易再生还原为原来的对映体。
虽然这种方法一直被作为重要的拆分方法，但其局限性也很明显：
（1）拆分剂和溶剂的选择较为盲目；
（2）拆分的产率和产品的旋光纯度不高；（3）适用于手性拆分的化合物的类型不多。
近年来，随着主-客体化学的深入研究而开发出来的包结拆分和组合拆分等新型手性拆分技术，在一定程度上解决了经典成盐拆分方法的不足。
2.2包结拆分
由日本化学家Toda教授发明的包结拆分[6]与经典成盐拆分相比，所拆分的化合物不再局限于有机酸或者有机碱。
此法主要利用主-客体分子之间存在很强的分子识别作用，而使得手性化合物通过氢键及分子间次级键作用选择性地与某一个对映异构体形成稳定的包结络合物（inclusioncomplex）而析出，从而实现对映体的分离[7]。
由于主-客体分子之间不发生任何化学反应，因而很容易通过溶剂交换过程以及逐级蒸馏等手段实现主体与客体的分离，使得溶剂可以重复使用。
因此，包结拆分操作简单、成本低廉、易于规模生产、具有很高的生产价值。
光学纯的联二苯酚的制备一直是一个难题，但最近Merck公司的Cai等[8]采用乙氰为拆分溶剂，使用略过量的氯化N-苄基辛可尼定作为手性主体，与R-（+）-联二苯酚形成包结晶体，留在母液中的S-（-）-联二苯酚的光学纯度可以达到99%e.e，包结晶体通过甲醇萃取不但可交换得到手性主体，还可以进一步提高R-（+）-联二苯酚的光学纯度（>99.8%e.e）。
这种方法极易放大，具有良好的工业应用前景。
2.3组合拆分
随着组合化学在药物先导化合物筛选中的作用日益显着，人们开始将组合方法引入手性拆分剂的设计和筛选之中。
Wynberg[9]首次将组合方法应用于化学拆分中，他们设计了一系列芳香环取代的衍生物组成不同的拆分剂家族。
研究表明这类拆分剂的组合几乎能以高的收率和近于100%e.e与所有的实验消旋体迅速地形成非对映体的结晶，这在拆分方法学上是一个重大的突破。
3.动力学拆分法
动力学拆分方法的原理是在手性试剂和催化剂的作用下，利用对映体反应速度的不同而达到手性化合物的分离目的[10]。
尽管动力学拆分方法与结晶拆分方法相比有许多优点，但是其自身也存在着不足之处。
传统的动力学拆分方法拆分得到的光学纯产物的最大收率只有50%，另一半对映异构体废弃，造成原料的浪费，生产成本的提高，甚至对环境的污染。
为了克服这些缺点，人们开发并研究了动态拆分法。
该方法具有原子经济性、环境友好等优点。
动态拆分法是利用手性底物的消旋化或手性中间体的动态平衡，使其中一种手性底物或手性中间体转化成另外一种对映异构体，可以达到最大限度拆分得到单一手性化合物的目的。
动态动力学拆分（DKR）是将经典的动力学拆分和手性底物消旋化相结合[11-17]。
在拆分过程中利用某一反应底物在化学条件或酶存在下不稳定易发生消旋化的特点，在动力学拆分的同时，通过改变反应条件如pH、反应温度等或加入能够产生消旋化反应的催化剂，如过渡金属络合物或消旋化酶等，使没有参加反应的底物异构体进行消旋化反应（图1）。
图1.动态动力学拆分原理
4．色谱拆分法
4.1气相色谱（GC）
气相色谱是较早用来分离对映体的一种方法，具有分离速度快、分离效率高、选择性好、样品用量少和检测灵敏度高且操作简单、费用低等优点[18]。
GC法分离对映体的方法主要有间接拆分法和直接拆分法。
间接拆分法又称手性试剂衍生化法（Chiralderivatizationreagent，CDR）。
这种方法先通过共价结合作用，在对映体分子中引入另一个手性中心，形成非对映体后，再用非手性GC拆分。
如章立等[19]采用柱前衍生化法测定了大鼠肝微粒体中安非他明对映体，以氯仿为提取溶剂，N－三氟乙酰基－脯氨酰氯为手性衍生化试剂，三乙胺为催化剂，将安非他明转变成相应的酰胺类非对映异构体对，用常规非手性毛细管柱气相色谱、程序升温法分离了大鼠肝微粒体中R－和s－安非他明，在5～250μg／mL范围内线性良好，方法检测限为12.5ng，定量限为125ng，重现性和精密度均良好。
实验表明，空白微粒体样品对安非他明对映体及内标无干扰。
直接拆分法又称手性固定相法（Chiralstationaryphases，CSP），这种方法通过使用一个具有光学活性的环境，称之为手性固定相，来提供拆分所需要的手性中心。
它与CDR法的区别是不需要柱前手性衍生化反应。
常见的手性固定相有羰基—双氨基酸酯类和环糊精及其衍生物类。
如匡唐永等[20]采用手性毛细管气相色谱法测定了人尿中美芬妥英对映体，仪器为常用的气相色谱仪、数据处理机，配以氮磷检测器（NPD），色谱柱为手性交联石英毛细管色谱柱，涂渍OV－225－缬氨酸－t－丁基酰胺，以二氯甲烷为提取剂，最低检测浓度小于50ng·mL－1，两种对映体的线性关系良好，回收率和精密度也较好。
4.2高效液相色谱法（HPLC）
HPLC分离药物对映体的方法可分为间接法和直接法两大类。
间接拆分法又称手性试剂衍生化法，虽需进行衍生化反应，但生成的非对映体异构体，物化性质不同，可用常规的正相或反相法分离，因此被不少学者采用。
如Peccinini等[21]使用（－）－薄荷基氯甲酸酯作为衍生化试剂，建立了血浆和尿液中卡维诺尔的HPLC法。
采用C18柱为固定相，荧光检测器检测。
间接拆分法分离效果好，分离条件简便，但需要使用高纯度的手性衍生化试剂，且该试剂对两种对映体的衍生化效率应相同，故应用范围有限[22]。
直接法应用范围较广，其优点是在分离前不需要进行衍生化反应，而且对分离机制的解释显示出优越性，因此得到迅速发展，成为手性拆分最有效的工具之一。
直接法分离手性药物对映体可分为手性流动相添加剂法（CMPA）和手性固定相法（CSP）两法[23]。
手性流动相添加剂法（CMPA）。
CMPA是指在普通色谱流动相中加入手性添加剂（CA），CA与对映体溶质通过静电引力和氢键等非共价键结合方式，形成可逆的不同稳定性的非对映体配合物，从而实现对映异构体分离的方法。
常见的CA有金属配合物、环糊精、蛋白质、手性离子对试剂等。
其中金属配合物添加剂色谱法系通过溶解在流动相中的配合物而实现的。
手性固定相法（CSP）。
手性固定相色谱法是指固定相与对映体溶质通过氢键、π－π键、偶—偶极、包合络合物、配位交换、疏水和极性相互作用的偶合，形成可逆的不同稳定性的非对映体配合物，从而实现对映异构体分离的方法。
常见的手性固定相有选择基键合相（Pirkle手性固定相）、纤维素和多糖衍生物、环糊精、蛋白质键合相和合成聚合物与分子烙印手性固定相。
4.3毛细管电泳法（CE）
毛细管电泳技术（CE）是80年代以来新兴的手性分离技术，特点是高效，快速，简便，适用于药物，生物大分子医学等领域[24]。
毛细管电泳技术以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。
用CE拆分药物对映体需加入各种不同的手性选择剂才能达到分离的目的[25]。
目前常用手性选择剂有:
CD、冠醚、胆酸盐、手性混合胶束、手性选择性金属络合物、蛋白和糖等7种类型[26]。
5.手性膜拆分法
目前,高效液相色谱（HPLC）是拆分对映体的最有效方法，但由于成本高，此方法不适合大规模制备。
膜分离是一种近几年刚发展的节能技术。
从连续性和能量有效的观点出发，通过手性膜拆分对映体是非常吸引人的。
关于外消旋体的膜分离已有某些报道，如采用手性冠醚膜、环糊精载体膜、分子印迹聚合物膜、多聚糖膜、中空纤维素膜、聚丙烯膜以及各种液膜等。
5.1手性药物拆分膜的基本特征
膜手性拆分法由含有消旋混合物的流入相、膜及接收相组成，相与流入相及接收相不相溶。
流入相中消旋药物在渗透压或其他外力如压力、电压、pH梯度的驱动下进入膜相,在膜相中载体选择性作用下，其中一种对映体通过膜相进入接收相。
根据膜分离和手性拆分的要求，用于手性药物拆分的膜需具备以下的特征[27]:
①较高对映体选择性;②膜通量要大;③通量及选择性应稳定。
药物通过膜的渗透是由被拆分药物在膜中的分配行为和它们在膜中的扩散速度来决定的。
为了提高膜的对映体选择性，需要优化这两个因素。
旋光异构体的分配行为很大程度上是受膜中手性识别位置的结构和数目影响的，扩散速度却难于控制，为旋光异构体具有相同的分子大小。
通过调节手性识别位置周围的亲水/疏水性质，来增大固定在膜上的手性识别位的拆分能力，将具有手性识别能力的膜放在一个被控制的亲水/疏水微环境中，根据它们的分配或渗透行为，得到对旋光性物质更高的选择性。
5.2手性药物拆分膜的种类
对于消旋药物的分离,膜操作的两种基本类型得以区别:
用手性选择性膜直接分离,或非手性选择性膜辅助手性拆分剂形成不对称的复合膜操作[28].通常对拆分膜的分类是以膜的状态分为固体膜和液膜两种。
5.2.1液膜
1979年,Newcomb等[29]首先报道了一种液体膜拆分的方法.在这种液膜体系中,手性分子（主体）与外消旋体（客体）结合,通过氯仿载体从一水溶液至另一水溶液中再释放出来.这种W型装置能够同时连续地将外消旋体拆分为2个对映体,得到的旋光纯度为70%～90%.1987年,Armstrong等[30]。
道了另一种液膜拆分对映体的方法,他们采用水基质液体膜拆分有机分子,首次采用环糊精作为膜载体分子,分离疏水性的异构体.对（±）-S-（1-二茂铁基乙基）苯硫酚等外消旋体进行了拆分。
液膜分离手性物质的原理是在手性分离过程中,液膜对某一对映异构体药物有比其他对映体更强的亲和力,基于选择性萃取的原理达到对消旋体拆分的目的.传递的驱动力来自对映异构体在膜两侧的浓度差.液膜可被分为支撑液膜、厚体液膜和乳化液膜.在各种手性拆分液膜中,选择性比较好的是使用流动载体的液体膜方法,选择的种类和程度取决于所使用的载体分子（手性选择体,CS）的性质.载体分子通常为大分子配体化合物,如冠醚、穴状配体等[31]
支撑液膜（SLM）即用薄壁空心纤维管内的毛细孔来支撑的液膜.一束这样的管子集中起来就能形成许多液膜,使液膜具有很大的比表面积.一种含有外消旋体的流体被送进管程,而富集后的对映异构体分离液则从壳程流出.流入液和分离液可以是相同的,但必须与空心纤维管的液膜不混容.在支撑液膜中,手性液通过毛细和表面张力固定在膜孔里,固定的薄膜能将易混合的液体分成两部分[32]支撑液膜的装置如图2。
图2支撑液膜装置
厚体液膜（BLM）在传统的厚体液膜装置中,膜相是混合良好的体相而不是在孔内或膜上的固定相.基本原理包含从流入相到接受相的手性选择性萃取,结果载体释放消旋体到接受相中.由于手性化合物在不同环境的形成和分解,形成了合适的吸附和解吸附作用.厚体液膜装置一般均为如图3所示的U型管单元.DanielaStella等[33]用BLM膜的U型管装置来研究金鸡纳啶对D,L-苯基乙醇酸的手性分离性能,得到的产品旋光度为79%ee.
图3典型的U-型管厚体液膜
乳化液膜（ELM）。
乳化液膜系统的应用包括3个连续的步骤:
①把不相溶的两表面活性剂搅拌以形成乳状液.②乳状液与含有要分离物质的液体混合.③产生相的分离,而乳化剂在去乳化步骤得以回收.图4为乳化液膜的膜萃取单元。
图4乳化液膜装置
5.2.2固膜
由于液膜的主要缺点是一个相当长时间的不稳定性[34]。
近几年来,手性药物膜分离的另一个新发展是手性固体膜即手性选择性高分子膜的发展。
手性选择性高分子膜通常是由一个表面带有一手性选择性薄层的非选择性多孔支撑组成。
这种高分子膜需要高的比表面积,低的物质转运阻力,好的机械强度和旋光性识别能力。
分离机制涉及要分离的对映异构体和膜表层的高分子矩阵的特定的选择性相互作用。
如果一步不能得到想要得的光学纯度的物质,膜单元的层叠很易于获得想要纯度的物质.渗透性和选择性决定手性膜的性能。
Lee等[35]则用聚谷氨酸酯衍生物对聚偏氟乙烯超滤膜改性,得到非对称的手性拆分固膜。
首先用蒸气吸附方法让γ-苯甲基-L-谷氨酸酯的N-羧酸酐单体发生开环反应,物理或化学吸附在聚偏氟乙烯膜上,从而得到PBLG膜,PBLG膜分别经过取代苯环和酯交换反应得到聚L-谷氨酸（PLGA）和具有三缩（乙二醇）单乙醚侧链的聚谷氨酸酯（PLTEG）非对称固膜。
对手性α-氨基酸（色氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸）和手性药物（心得安、氨酰心安和布洛芬）进行了渗透实验,对映体选择率为1.04～1.47。
实验观察到化学接枝的聚合物与物理吸附的多肽相比,手性选择率有所增加,这可能是因为分子质量和高分子链密度的增加促进手性混合物和表面束缚的多肽之间相互作用。
由于选择性与透过通量之间的反相关系,选择扩散型手性固膜处理量一般都较小,通过扩大膜面积或者增加平衡级数来弥补,在工业规模应用不太经济;而与之相比选择吸附型手性固膜则有更大的工业应用前景。
Randon等[36]采用2种方法来拆分色氨酸等外消旋体混合物,即溶液系统中的用牛族血清白蛋白（BSA）作为自由手性选择剂的超滤和用接枝BSA的尼龙膜渗析。
Nakamura和Kiyohara等[37-38]采用BSA作为手性选择剂固定在多孔的聚乙烯中空纤维孔内的接枝高分子链上,从而得到手性拆分固膜。
聚乙烯膜上BSA的固定量分别是150mg/g和190mg/g,相当于3层和4层BSA。
2种膜的区别在于前者固定的是交链的BSA分子。
实验得出固定交链BSA的多孔纤维对D,L-色氨酸的分离因子为12,并且相当稳定。
近年来发展起来的分子印迹技术由于其卓越的分析识别能力，被应用于分子拆分领域。
Izumi等[39]以Boc–L—色氨酸为印迹分子，将其引入到四肽衍生物中，然后经过处理制备成手性分子印迹膜。
这种膜对Boc—L—色氨酸具有较高的吸附选择性。
Yoshikawa等[40]将Z型谷氨酸保护剂（Z—D—Glu，Z—L—Glu）与乙酸纤维素（CA）结合制成了分子印迹选择性识别膜。
实验结果表明，D—Glu优先通过在Z—D—Glu分子印迹膜中，而在以Z—L—Glu为印迹分子的CA膜中，L—Glu则优先通过。
如上所述,很多研究组已经正在致力于手性高分子膜拆分手性药物的发展。
尽管如此,手性拆分膜法制备手性药物仍处于发展的初级阶段,为了工业化的应用,必须在流量和手性选择性上有所突破。
可以相信在不久的将来,随着对选择性拆分膜的深入研究,无论是液膜还是固体膜,都有可能在选择性和透过通量两方面同时获得改善,以满足工业应用的需求。
一旦克服了这些限制,手性拆分膜的使用将类似于反相渗透和超滤,允许有一个相对较快的使用,以满足工业应用的需求。
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