饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究.docx
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饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。
植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。
由于植酸酶可将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物，因此，在波长415nm下进行比色，可测定植酸酶活性。
目前已形成国标GB/T18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。
但是，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题：
①由于植酸酶在饲料中的添加量较低，现有方法不能将饲料中的植酸酶完全浸提出来；②饲料中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应，干扰415nm波长下的比色反应，从而影响酶活测定。
本实验旨在研究现有饲料中植酸酶测定方法的优势与缺陷，并寻找有效的检测途径。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
1.1.1仪器
分析天平；恒温水浴锅；分光光度计；磁力搅拌
器；涡流式混合器；酸度计；离心机：
转速为
4000r/min
以上；超声波溶解器；回旋式振荡器；透析袋（截留分
子量1万、10万和30~100万）；超滤离心柱（YM-30，
密理博公司生产）。
1.1.2试剂
植酸酶：
市售商品，酶活5000U/g，酶活定义参
照
GB-T18634—2009。
饲料：
市售商品蛋鸡料，原配方中不含植酸酶。
磷酸二氢钾（
KH
2
PO
4
）基准物
。
乙酸缓冲液（
1），c（CH
3
COONa）=0.25mol/l：
称取
20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml
水搅拌溶解，用冰乙酸调节
pH值至（5.50±0.01），再转
移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室
温下存放2个月内有效。
乙酸缓冲液
（2），c（CH
3
COONa）=0.25mol/l：
称取
20.52g无水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100（TritonX-
100），0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000ml烧杯中，
加入
900ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至
（5.50±0.01），再转移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏
水定容至刻度；室温下存放2个月内有效。
乙酸缓冲液（I），c（CH
3
COONa）=0.25mol/l：
称取
34.02g三水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml
水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至（5.00±0.01），再转
移至1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室
温下存放2个月内有效。
乙酸缓冲液（
II），c（CH
3
COONa）=0.25mol/l：
称取
34.02g三水乙酸钠，0.5g牛血清白蛋白（BSA）于
1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解，用冰乙酸
调节
pH值至（5.00±0.01），再转移至1000ml容量瓶中，
并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放2个月内有效。
植酸钠溶液（C
6
H
6
O
24
P
6
Na
12
）＝7.5mmol/l：
称取
0.6929g植酸钠（C
6
H
6
O
24
P
6
Na
12
，相对分子质量为
923.8，纯度为95%），精确至0.1mg，置于100ml烧杯
中，用约80ml乙酸缓冲液（[I）或
（1），按照实验操作
对照使用
]溶解，用冰乙酸调节pH值至（5.50±0.01）
[或（5.00±0.01）]，按照实验操作对照使用，转移至
100ml容量瓶中，并用乙酸缓冲液（[I）或
（1），按照实
验操作对照使用]定容至刻度，现用现配（实际反应液
中的最终浓度为
5.0mmol/l）。
硝酸溶液：
1份浓硝酸+2份水。
钼酸铵溶液，浓度为
100g/l：
称取10g钼酸铵
[（NH
4
）
6
Mo
7
O
24
·4H
2
O]于50ml烧杯中加水溶解，再转移
至100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水（25%），用水定
容至刻度
。
偏钒酸铵溶液，
2.35g/l：
称取0.235g偏钒酸铵
（
NH
4
VO
3
）于
50ml烧杯中，加入2ml硝酸溶液及少
量水，并用玻璃棒研磨溶解，再转移至100ml棕色容
量瓶中，用水定容至刻度，避光条件下保存。
显色液（及终止液）
（1）：
2份硝酸溶液，1份钼酸
铵溶液，1份泛酸铵溶液混合使用，现用现配。
0.2M乙酸钠缓冲液，pH值5.5。
1%（mM）植酸钠，溶解于0.2M乙酸钠缓冲液中，
《饲料工业》·2010年第31卷第22期
检测技术
54pH
值
5.5。
15%
三氯乙酸；
显色液（及终止液）
（2）：
3份硫酸，1份钼酸铵和1
份维生素
C
，混匀，现配现用
。
1.2
实验方法
1.2.1GB-T18634—2009《饲用植酸酶活性测定的方
法分光光度法》
GB-T18634—2009为饲用植酸酶的检测方法，
一般用于纯品植酸酶的测定。
本实验借鉴该方法，评
估是否可测定商品饲料中的植酸酶。
实验按照GB-T
18634—2009
方法进行。
1.2.1.1磷酸二氢钾基准物绘制标曲
以无机磷的量为横坐标，吸光值为纵坐标，列回
归方程（y=a+bx）。
1.2.1.2加酶饲料预处理
称取加酶（100g/t）饲料于200ml刻度锥形瓶中，
加乙酸缓冲液
（2）100.0ml，在超声波溶解器上溶解
15min，再放入回旋式振荡器中振荡30min。
提取后
的试样在离心机上以
4000r/min离心10min，分取
不同体积上清液，用乙酸缓冲液
（2）稀释，使试样溶液
的浓度保持在
0.4U/ml左右，待反应。
1.2.1.3反应步骤及试剂、溶液用量（见表1）
表1反应步骤及试剂、溶液用量
反应顺序
1.加乙酸缓冲液
（1）
2.加入待反应液
3.混合
4.水浴37℃预热5min
5.依次加入植酸钠底物溶液
6.混合
7.水浴37℃水解30min
8.依次加入显色液（及终止液）
（1）
9.混合
总体积
样品、标准
1.8ml
0.2ml
√
√
4ml
√
√
4ml
√
10ml
样品空白
1.8ml
0.2ml
√
√
4ml（第二步）
√
√
4ml（第一步）
√
10ml
1.2.1.4样品测试
反应后的试样在室温下静置
10min，如出现混浊
需在离心机上以4000r/min离心10min，上清液以
标准曲线的空白调零，在分光光度计
415nm波长处
测定试样空白（A
0
）和试样溶液（A）的吸光值，A-A
0
为
实测吸光值。
用直线回归方程计算植酸酶的活性。
1.2.1.5结果与计算
植酸酶活性X按下式计算：
X=
y
m×t
×n
式中：
X———样品植酸酶活性（U/g）；
y———样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应
磷的浓度（
μmol/l
）；
n———
样品溶液反应前的总稀释倍数；
m———
样品质量
（g）
；
t———
反应时间（
min
）
。
结果以两次平行测定的平均值表示，保留至
整数。
1.2.2透析法
饲料通过透析预处理可屏蔽部分背景干扰物质，
因此可提高饲料中植酸酶活性的检出率。
本实验采用
申请号200910009424.3《添加在饲料中植酸酶的微量
测定方法
》进行评估。
但由于该方法中存在两点遗漏，
本实验进行了弥补：
a.该方法采用透析袋对饲料样品
进行前处理，但并未标示透析袋的截留分子量，本实
验采用三梯度截留分子量的透析袋（
1万、10万和
30~100万）进行实验；b.该方法乙酸缓冲液（I）与乙酸
缓冲液（II）pH值均为（5.00±0.01），但实际反应中，加
入植酸酶底物等溶液后，并未将
pH值调回至（5.00±
0.01），从而造成反应条件偏离，酶活测定无效，本实验
在此步骤使用pH计测定，并用乙酸回调至（5.00±
0.01）。
实验步骤如下：
①磷酸二氢钾基准物绘制标曲线，以无机磷的量
为横坐标，吸光值为纵坐标，列回归方程（y=a+bx）；
②加酶饲料预处理取有代表性样品预冷至4℃，
全部粉碎（采取间断式粉碎，防止粉碎时饲料发热）通
过0.45mm的标准筛，充分混匀后准确称取样品
50.00g，加入500ml乙酸缓冲液（II），在4℃环境下
磁力搅拌
45min，过滤（弃去初滤液50ml），取过滤液
100ml完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的透析
外液（乙酸缓冲液I）中，透析外液体积约为透析酶液
的
10倍，透析时间为20h（透析10h需换一次透析
外液）；透析后准确量取体积并记录；
③已知酶液配制：
取植酸酶配制成酶活0.05U/
ml
的酶液，取
100ml，如②方法进行透析、测定；
④样品+已知酶：
准确称取待测饲料预冷至4℃，
全部粉碎并通过
0.45mm的标准筛，充分混匀后取样
50.00g
，量入上述步骤③所得的已知酶液500ml，在
4℃环境下磁力搅拌45min，过滤（弃去初滤液50ml），
取过滤液
100ml完全准确移入透析袋中，置于4℃
预冷的透析外液[乙酸缓冲液（I）]中，透析外液体积约
为透析酶液的
10倍，透析时间为20h（透析10h换
一次透析外液），透析后准确量取体积并记录，得加有
已知酶的样品透析液；
张英等：
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
检测技术
55⑤
反应步骤及试剂
、
溶液用量见表
2。
⑥
样品测试反应后的试样在室温下静置
10min
，
如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min，
上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波
长处测定试样空白（
A
0
）和试样溶液（
A
）的吸光值，
A-A
0
为实测吸光值。
用直线回归方程计算植酸酶的活性。
表
2反应步骤及试剂、溶液用量
反应顺序
1.加乙酸缓冲液（I）
2.加入待反应液
3.混合
4.水浴37℃预热5min
5.依次加入植酸钠底物溶液
6.混合
7.水浴37℃水解30min
8.依次加入显色液（及终止液）
（1）
9.混合
总体积
样品、标准
1.0ml
1.0ml
√
√
4ml
√
√
4ml
√
10ml
样品空白
1.0ml（2.0ml）
1.0ml
√
√
4ml（第二步）
√
√
4ml（第一步）
√
10ml
⑦结果与计算
植酸酶活性（
U/g）=
c
m
×F
式中：
c———根据实际样液的吸光值由直线回归方程
计算出的酶活性；
F———样品溶液反应前的总稀释倍数；
m———样品质量。
结果以两次平行测定的平均值表示，保留至整数
。
1.2.3超滤离心法
饲料通过超滤离心预处理可屏蔽部分背景干扰
物质，因此可提高饲料中植酸酶活性的检出率。
本实
验采用康奈尔大学
Dr.X.G.Le（i2005）发表的《Animproved
methodforarapiddeterminationofphytaseactivityin
animalfeed》方法进行评估。
其实验步骤如下。
①植酸酶提取和过滤
室内温度4℃，将饲料样品在匀浆器中研磨到样
品均能通过1mm筛。
称取5g样品放入125ml烧瓶
中
。
在烧瓶中加入50ml、0.2M柠檬酸缓冲液（pH值
5.5）和植酸酶提取液，在室温下不断搅拌（磁力搅拌
器）30min。
将混合物转移到50ml离心管中，在4℃
条件下，15000×g离心20min。
将上清液转移到超滤
管中（用25ml的一次性移液管转移）。
用10ml的注
射器过滤上清液，滤液收集到另外1个试管中。
吸取
0.5ml滤液到超滤管中，然后按照说明书将收集的样
品分装到玻璃瓶中，然后在4℃14000×g离心（约
12~20min）。
用分析天平称取1个玻璃瓶，记录下最
接近1mg的重量。
颠倒摇动玻璃瓶中的样品，稍微旋
转下，将剩余物转移到玻璃瓶中。
将玻璃瓶放在平衡器
上，加入
0.2M
柠檬酸缓冲液，
pH
值
5.5
，通过称量保
证最后体积约为0.5m（l1ml柠檬酸缓冲液=1.0298g）。
将最后产物混合后留作植酸酶活性分析用
。
②
植酸酶活性测定
提取
0.2M柠檬酸冲液，
pH值5.5，室温下搅拌30min
离心
15000×g，20mim
直接法
超滤法
过滤
0.45μM膜
超滤浓缩
14000×g，20min
植酸酶水解
37℃，15min
颜色反应，显色液（及终
止液）②，37℃，15min
分光光度计检测415nm
图1直接法和超滤法测定饲料中植酸酶活性
2实验结果与分析
实验结果见表3，由表3可以看出：
①方法1：
GB-T18634测定饲料中的植酸酶CV为
65%，相对偏差为71%（大于该方法的适用性要求：
小
于
15%）。
此外，该方法检出率仅为29%。
因此，GB-T
18634不适用于饲料中植酸酶的检测。
②方法2：
透析法测定饲料中的植酸酶，当截留分子
量为
1万时，CV为146%，相对偏差为92%，平均检出
率为8%，因此可以推断，此时植酸酶并未浸提进入缓
冲体系，无法检测。
当截留分子量为10万和30~100
万时，CV为55%和39%，相对偏差为59%和60%，平
均检出率为
41%和40%，虽然好于方法1GB-T
18634，但仍不具有适用性。
③方法3：
超滤离心法测定饲料中植酸酶的CV为
24%，相对偏差为43%，平均检出率为57%，均优于方
张英等：
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
检测技术
56法1和方法2，但相对偏差仍高于测定饲料中植酸酶
活性的相对偏差要求（15%）。
3讨论
饲料中植酸酶活性的测定关键点在于浸提及背
景干扰除杂。
GB-T18634适用于植酸酶产品的检测，并未进
行浸提及背景干扰除杂方便的优化与改进，因此，无
法测定饲料中植酸酶的活性。
透析法在一定程度上改进了背景干扰除杂的问
题，但专利申请中并未标示截留分子量的关键指标。
本实验选用截留分子量从1万到100万范围的透析
袋，均未实现较好的相对偏差和酶活检出率，因此，无
法适用于饲料中植酸酶的活性测定。
超滤离心法可更准确的进行背景干扰除杂，但是
原文中酶活的测定是在820nm波长下进行，本实验
为了保持三种试验方法的一致性，改为415nm波长
下进行测定，因此存在一定的检测偏差。
另外，该方法
所用仪器要求较高，不一定完全适用于饲料厂或酶制
剂生产企业实际情况，因此，有待进一步完善与改进
。
（编辑：
高雁，snowyan78@）
方法2（透析法）
表3不同方法测定8个饲料样品中植酸酶活性结果
样品01
样品02
样品03
样品04
样品05
样品06
样品07
样品08
平均值*
CV
相对偏差
平均检出率**
方法1
（GB-T18634）
143
167
0
204
192
0
235
210
144
65%
71%
29%
截留分子量1万
0
27
0
168
0
0
96
43
42
146%
92%
8%
截留分子量10万
269
325
108
64
226
97
193
377
207
55%
59%
41%
截留分子量30~100万
162
126
230
372
165
187
147
210
200
39%
60%
40%
方法3
（超滤离心法）
374
386
287
206
208
265
257
279
283
24%
43%
57%
项目
注：
*以U/kg配合饲料计；**饲料样品中植酸酶活性为500U/kg配合饲料，因此，平均检出率以“平均值/500”计。
张英等：
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